PLoS ONE: ALDH1-Høje Ovariecancer Stem-lignende celler kan isoleres fra Serøse og Klare Cell adenokarcinomceller, og ALDH1 Høj Expression er forbundet med dårlig prognose

Abstrakt

Kræft stamceller-lignende celler (CSCS) /kræft-initierende celler (CICS) er defineret som en lille population af kræftceller, der har høj tumorigenicitet. Desuden CSCS /CIC er resistente over for flere kræftbehandlinger, og CSCS /CIC derfor menes at være ansvarlig for kræft tilbagefald efter behandling og fjernmetastaser. I epitel kræft i æggestokkene (EOC) tilfælde, er tilbagefald efter kemoterapi ofte observeret, hvilket tyder på æggestokkene CSCS /CIC er involveret. Der er fire store histologiske undertyper i EOC, og serøs adenokarcinom og klar celle adenocarcinom er af høj kvalitet maligniteter. Vi analyserede derfor æggestokkene CSCS /CIC fra ovariecarcinom cellelinier (serøs adenokarcinom og klar celle adenocarcinom) og de primære ovariecancerceller i denne undersøgelse. Vi isoleret æggestokkene CSCS /CIC som et aldehyd dehydrogenase en høj (ALDH1

høj) befolkning fra 6 EOC cellelinier (3 serøse adenokarcinomer og 3 klare celle adenokarcinomer) ved ALDEFLUOR analysen. ALDH1

høje celler viste større kugle-dannende evne, højere tumorigenicitet og større invasive kapacitet, hvilket indikerer, at æggestokkene CSCS /CIC er beriget i ALDH1

høje celler. ALDH1

høje celler kunne også isoleres fra 8 af 11 primære ovariecarcinom prøver. Immunohistokemisk farvning viste, at højere ALDH1 ekspressionsniveauer i æggestok kræfttilfælde er relateret til dårligere prognose i begge serøse adenocarcinom sager og klare tilfælde celle adenocarcinom. Tilsammen indikerer resultaterne, at ALDH1 er en markør for æggestokkene CSCS /CIC og at udtrykket niveau ALDH1 kan være en roman biomarkør til forudsigelse af dårlig prognose

Henvisning:. Kuroda T, Hirohashi Y, Torigoe T , Yasuda K, Takahashi A, Asanuma H, et al. (2013) ALDH1-High Kræft i æggestokkene Stem-lignende celler kan isoleres fra Serøse og Klare Cell adenokarcinomceller, og ALDH1 Høj Expression er associeret med dårlig prognose. PLoS ONE 8 (6): e65158. doi: 10,1371 /journal.pone.0065158

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 8. februar 2013; Accepteret den 22. april 2013; Udgivet: 6 Juni 2013

Copyright: © 2013 Kuroda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (tilskud nummer 16.209.013, 17.016.061 og 15.659.097) til praktisk anvendelse Research fra Japan Science and Technology Agency, og for kræft Forskning (15-17 og 19-14) fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd Japan, Ono Cancer Research Fund (til NS) og Takeda Science Foundation (til YH). Dette arbejde blev støttet delvist af National Research and Development Fund Cancer Center (23-A-44). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ovariecancer er en ondartet sygdom med høj dødelighed og er den fjerde mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald hos kvinder på verdensplan. [1], [2] Obscure og uklare symptomer gør påvisning af kræft i æggestokkene i den tidlige fase vanskelig. [3] Generelt kræft i æggestokkene er relativt følsom over for første-line kemoterapi baseret på platin /taxan. [4] Klinisk komplet respons (CR) kan ofte opnås ved cytoreduktive kirurgi og kemoterapi i avanceret ovariecancer patienter; Størstedelen af ​​patienter med fremskreden har sygdomstilbagefald, som er årsagen til den høje dødelighed af denne sygdom. [5] Nogle terapeutiske kandidater af molekylære target medicin til kræft i æggestokkene var blevet testet, men mærkbare forbedringer i prognose blev ikke opnået. [2], [6].

Nylige fremskridt i cancer forskning har afsløret, at cancere er sammensat af en heterogen population af celler, og at kun en lille population af celler kaldet cancer stamceller-lignende celler (CSCS) /kræft -initiating celler (CICS) har høj tumorfremkaldende potentiale (cancer stamceller hypotese). CSCS /CIC er defineret som en lille population af celler, der har (1) høj tumorgenicitet, (2) multiple differentiering evne og (3) selvfornyelse kapacitet. [7] – [9] Resultaterne af nylig undersøgelse har også vist, at CSCS /CIC er relateret til kræft tilbagefald og resistens mod stråling eller kemoterapi. [10], [11] Derfor er CSCS /CIC menes at være ansvarlig for kræft tilbagefald og fjernmetastaser, og eliminering af CSCS /CIC derfor uundværlig for at kurere kræft.

Der er flere tilgange til at identificere CSCS /CIC fra cancere i forskellige organvæv. [12] Disse tilgange omfatter (1) brug af celleoverflademarkør såsom CD44

+ CD24

– /lowESA

+ [13], CD133

+ [14], CD44

+ CD117

+ [15], og CD166

+ [16], (2) side befolkning (SP) assay [17], hvori cellepopulationen, der har evnen til at pumpe et lægemiddel (Hoechst33342 [18 ] eller Dye Cycle Violet [19]) gennem den ATP-bindende kassette transporteren betragtes som CSCS /CIC, og (3) ALDEFLUOR assay baseret på niveauet af aldehyddehydrogenase 1 (ALDH1) enzymaktivitet. [20].

Funktionen af ​​intracellulær ALDH er at katalysere oxidationen af ​​aldehyd, og ALDH spiller derfor en vigtig rolle i cellulær homeostase. Nylige undersøgelser har vist, at både normale celler og cancerceller med høje niveauer af ALDH1 aktivitet har potentiale til at fungere som stamceller og potentialer for selvfornyelse kapacitet og stress-resistente egenskaber. [20] – [22].

Også i epitelial ovariekræft (EOC), har nogle undersøgelser foreslået nytten af ​​ALDH1 aktivitet for at identificere CSCS /CIC. Eksistensen af ​​celler med høj ALDH aktivitet (ALDH1high celler, sammenlignet med ALDH1low celler) er også blevet påvist i EOC cellelinier og i kliniske prøver. [23] – [25] Sammenhængen mellem ALDH1 aktivitet og prognose af patienter, er imidlertid stadig kontroversiel i EOC. [26] På samme tid, relevans for ALDH1 udtryk for hver histologisk undertype af EOC er ikke afklaret endnu.

I denne undersøgelse har vi identificeret og evalueret stemness af ALDH1

høje celler i serøs adenocarcinom og klar celle adenocarcinom i æggestokkene, ikke kun fra etablerede cellelinier, men også fra primære ovariecancerceller. Vi har også statistisk analyseret sammenhængen mellem ALDH1 udtryk og kliniske resultat for æggestokkene kræftpatienter.

Materialer og metoder

Etik Statement

Mus blev opretholdt og eksperimenteret på i overensstemmelse med retningslinjer og efter godkendelse af Udvalget for Sapporo Medical University School of Medicine, dyreforsøg center under tilladelsens nummer 08-006. Ethvert dyr fundet usund eller syg blev straks aflivet. Alle undersøgelser blev godkendt af Institutional Review Boards (IRB) af Sapporo Medical University Hospital og IRB af Hakodate Goryokaku Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter i henhold til retningslinjerne i Helsinki-deklarationen.

cellelinier og dyrkningsbetingelser

I denne undersøgelse 3 æggestokkene serøse adenocarcinom cellelinier (AMOC-2, HUOA og OVCAR-3) og 3 æggestokkene klare celle adenocarcinom-cellelinjer (ES-2, RMG-1 og TOV21G) blev anvendt. AMOC-2 (venligst stillet til rådighed af Dr. Yabushita, Institut for Obstetrik og Gynækologi, Aichi- Medical University, Aichi, Japan) [27], HUOA (venligst stillet til rådighed af Dr. Ishiwata, Obstetrik og Gynækologisk Hospital, Ibaraki, Japan) [28 ], OVCAR-3 og TOV-21G (ATCC, Manassas, VA, USA) blev dyrket i RPMI1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). ES-2-celler (ATCC) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Sigma-Aldrich). RMG-1-celler (JCRB Cell Bank, Osaka, Japan) blev dyrket i DMEM /F-12 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Hvert medium blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Celler blev inkuberet i en fugtig 5% CO

2 inkubator ved 37 ° C.

Isolering af Primary Cancer Celler fra kliniske prøver

Alle undersøgelser blev godkendt af Institutional Review Boards (IRB) af Sapporo Medical University Hospital og IRB af Hakodate Goryokaku Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter i henhold til retningslinjerne i Helsinki-deklarationen.

Solide tumorer blev skåret i fragmenter, vasket i phosphatpufret saltvand (PBS) og centrifugeres ved 2000 rpm i 10 minutter. Derefter celleaggregater blev inkuberet ved 37 ° C i ca. 30 min med 2 mg Liberase ™ forskningskvalitet (Roche, Basel, Schweiz) i 10 ml Iscoves Modificeret Dulbeccos Medium (IMDM, Life Technologies), indtil separeret i enkeltceller. De ved disse procedurer celler blev analyseret ved flowcytometri som beskrevet nedenfor.

ALDEFLUOR Assay og isolering ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)

Vi anvendte en ALDEFLUOR assaykit (Stem Cell Technologies ™, Vancouver, BC, Canada) for at bestemme ALDH1 aktivitet af celler ifølge producentens protokol. Celler blev suspenderet i ALDEFLUOR assaybuffer indeholdende 1 pmol /l pr 1×10

6 celler af ALDH substrat, bor-dipyrromethene-aminoacetaldehyd (Baaa) og inkuberet i 50 min ved 37 ° C. Hver prøve blev behandlet med 50 mmol /l af en ALDH-specifik inhibitor, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), som en negativ kontrol. Farvede celler blev analyseret ved BD FACSAria ™ II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Celler blev farvet med 1 ug /ml propidiumiodid for at vurdere deres levedygtighed inden analyse.

Til isolering af epitelceller fra faste ovariecancerprøver, vi sorteret epitelcancerceller anvendelse af anti-CD326 (Ep-CAM) APC-antistof (BD Biosciences). Vi brugte anti-CD326 mikrokugler (BD Biosciences) og en Automacs-system (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) at berige epitelceller fra maligne ascites af æggestokkene kræfttilfælde før ALDEFLUOR analysen.

Cell Cycle Analysis og

In vitro

Cell Grow Analyse

ALDH1

høje og ALDH1

lave celler blev direkte fikseret med 70% ethanol efter sortering. Derefter blev de resuspenderet i PBS indeholdende 250 ug /ml RNase A (Sigma-Aldrich) i 30 minutter ved 37 ° C og farvet med 50 pg /ml propidiumiodid i 10 minutter ved 4 ° C i mørke. Farvede celler blev analyseret med en FACSCalibur (BD Biosciences), og dataene blev analyseret ved hjælp af Mod-Fit cellecyklus analyseprogram.

For

in vitro

cellevækst assay, ALDH1

høje celler og ALDH1

lav celler isoleret fra AMOC-2 og RMG-1-celler blev podet i en 6-brønds plade ved 5 x 10

4 celler pr. Efter inkubation i 48 og 96 timer blev cellerne fjernet med trypsin og antallet af levedygtige celler blev bestemt ved anvendelse Countess® (Life Technologies).

Sphere-dannende assay /enkelt celle Sphere-dannende assay

ALDH1

høje og ALDH1

lave celler blev isoleret ved FACS og derefter dyrket i 6-brønds ultralav fastgørelsesflade retter (Corning, Tewksbury, MA, USA) ved 1000 celler per brønd. For enkelt celle sfære-dannende assay, blev begge ALDH1

høj og ALDH1

lav sorteret i 96-godt ultralav vedhæftede retter (Corning) på en enkelt celle per brønd. Cellerne blev dyrket i stamcelle medium, serum-frit DMEM /F12 (Life Technologies) suppleret med N-2 supplement (Life Technologies), 20 mg /ml rekombinant human epithelial vækstfaktor (Life Technologies), 10 mg /ml humant basisk fibroblastvækstfaktor (Sigma-Aldrich), 4 ug /ml heparin (Sigma-Aldrich), 4 mg /ml bovint serumalbumin (Life Technologies), 20 g /ml humant insulin, zink-opløsning (Life Technologies), og 2,9 mg /ml glucose (Sigma-Aldrich). blev observeret dagligt [29] morfologisk ændring under et lysmikroskop i 14 dage.

In vivo

Tumorigenicitet

Sorteret ALDH1

høje og ALDH1

lave celler blev resuspenderet ved 1,0 x 10

2, 1,0 x 10

3 og 1,0 × 10

4-celler i 100 pi PBS og Matrigel (BD Biosciences) blanding (1: 1). hver blanding blev derefter injiceret subkutant i højre /venstre midt tilbage områder af 6 uger gammel kvinde ikke-overvægtige diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Japan) under indånding anæstesi ved isofluran. Tumorinitiering og progression blev observeret ugentligt indtil musene blev aflivet 7 uger efter injektion. Ekstern volumen tumor blev beregnet som 0,5 × Dmax × (Dmin)

2 [mm

3] (Dmax: længdeakse, Dmin: korte akse masse).

immunhistokemisk farvning for kræft i æggestokkene Tissue

immunhistokemisk farvning af ALDH1 og Ki-67 blev udført med formalinfikserede, paraffinindlejrede sektioner af 123 epitelial kræft i æggestokkene væv (62 serøse adenocarcinomer, 37 klare celle adenocarcinomer, 18 endometrioide adenokarcinomer og 6 mucinøse adenokarcinomer) som tidligere beskrevet. [30] [31] Antigen genfinding blev udført ved kogning sektioner i 120 ° C i 5 minutter i en mikrobølgeovn i forvarmet 0,01 mol /l natriumcitrat (pH 6,0). Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 3% hydrogenperoxid i ethanol i 10 min. Efter blokering med 1% fedtfri tørmælk i PBS (pH 7,4), blev sektionerne omsat med muse-anti-ALDH1 monoklonalt antistof (1: 250, Sigma-Aldrich) eller muse-anti-Ki-67-monoklonalt antistof (1: 100 , DAKO, Glostrup, Danmark) i 1 time efterfulgt af inkubation med biotinyleret anti-mus IgG (Nichirei) i 30 min. Efterfølgende blev snittene farvet med setreptavidin-biotin-kompleks (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan), efterfulgt af inkubation med 3,3′-diaminobenzidin anvendt som et chromogen og kontra-farvning med hæmatoxylin. Cytoplasmisk farvning blev betragtet som positiv for ALDH1, og kerner farvning blev betragtet som positive for Ki-67. For evaluering af ALDH1 farvning er sagerne blevet delt i to grupper (ALDH1

høj gruppe og ALDH1

lav gruppe) ved medianer (medianer for serøs adenokarcinom medianen og klare celle adenocarcinom være 20% og 15%, henholdsvis) .

Matrigel invasion Assay

invasive evne celler blev evalueret ved hjælp af matrigel invasion kamre (BD Biosciences). Isolerede ALDH1

høje og ALDH1

lave celler (1,0 x 10

4) blev udsået i hvert øvre kammer i serum-frit DMEM. De ydre kamre blev fyldt med DMEM herunder 10% FBS som en kemoattraktant. Cellerne blev inkuberet i 48 timer, og invasive celler blev farvet med Hematoxylin, monteret på objektglas og talt ved 400-fold øvre område ved lysmikroskopi.

Statistical Analysis

Statistisk analyse, data montering og grafik blev udført under anvendelse af SPSS software-pakke ver.19 (SPSS, Chicago, IL, USA). Data er vist som middelværdier ±

SD

af mindst 3 uafhængige forsøg, og t-test blev anvendt til at vurdere statistisk signifikante forskelle (p 0,05). Samlet overlevelse (OS), defineret som intervallet fra datoen for den første diagnose til datoen for død fra sygdomsprogression, og progressionsfri overlevelse (PFS), defineret som intervallet fra datoen for den første diagnose til datoen for sygdomsprogression, blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet under anvendelse af log-rank test. Sammenslutninger af ALDH1 udtryk med klinisk fase blev lymfeknudemetastaser og formidling analyseret af Fishers test.

Resultater

Isolering af ALDH1

høje Celler fra EOC cellelinier

Flere metoder til at isolere CSCS /CIC er allerede blevet beskrevet [12], og et aldehyd dehydrogenase en stor befolkning (ALDH1

høj) identificeret af ALDEFLUOR assay blev beskrevet at blive beriget med CSCS /CIC. [20] Vi analyserede derfor ovariekarcinom-cellelinier ved ALDEFLUOR assay for at isolere æggestokkene CSCS /CIC. Vi undersøgte 3 humane ovarie serøse adenocarcinom cellelinier (AMOC-2, HUOA og OVCAR-3) og 3 humane klare celle adenocarcinom cellelinier (ES-2, RMG-1 og TOV-21G) (figur 1). ALDH1

stor befolkning blev identificeret i alle ovariecarcinom line celler, og forholdet mellem ALDH1

høje celler varierede fra 0,7% til ES-2 celler til 7,9% for TOV-21G-celler. Vi kunne isolere ALDH1

høje celler stabilt fra 4 cellelinier (AMOC-2, ES-2, RMG-1 og TOV-21G), og vi brugte derfor disse cellelinjer til yderligere analyse.

ALDH1

høje celler blev påvist i 3 serøse adenocarcinom cellelinier (AMOC-2, HUOA og OVCAR-3) og i 3 klare celle adenocarcinom cellelinier (ES-2, RMG-1 og TOV-21G). SSC-A: enkelt streng kropsbygning analyse. Baaa: bor-dipyrromethene- aminoacetaldehyd. FITC-A: fluoresceinisothiocyanat analyse. Procenter i felter angiver ALDH1

høje celle nøgletal. Diethylaminobenzaldehyde (DEAB), en ALDH-specifik inhibitor, blev brugt som en negativ kontrol.

Karakterisering af ALDH1

høje Cells

Da CSCS /CIC er kendt for at danne kugler i flydende dyrkningsbetingelser [29], vi analyserede ALDH1

høje celler af en kugle-dannende assay. I alt 10

3 celler pr brønd blev sorteret og inkuberet i en 6-brønds plade i en forankringsuafhængig miljø. På dag 10, ALDH1

høje celler afledt af AMOC-2-celler udviste større kugle-dannende evne end den af ​​ALDH1

lave celler. Lignende resultater blev opnået fra ES-2 celler, RMG-1-celler og TOV-21G-celler (figur 2A). Da kuglen-dannende assay er ikke egnet til kvantificering af forholdet mellem CSCS /CIC i ALDH1

høje celler, udførte vi en enkelt celle kugle-dannende assay. Sphere-dannelse blev observeret i 4,86% af brøndene i ALDH1

høje celler afledt af AMOC-2-celler og i 3,13% af brøndene i ALDH1

høje celler afledt fra ES-2-celler (figur 2B). På den anden side, brønde i ALDH1

lave celler afledt fra både AMOC-2 og ES-2-celler viste ikke nogen kugle formation. Salg

A Sphere-dannende assay Et tusind ALDH1

høje celler og ALDH1

lave celler blev dyrket i en flydende tilstand. Kuglerne blev talt på dag 10. Forstørrelse af billeder: × 100. Kriterium for klumpformet størrelse: Over 100 um. Hver værdi er middeltallet af sfæroider ± SD. * P-værdier. B Enkelt celle sfære-dannende assay Sorted ALDH1

høje celler og ALDH1

lave celler blev dyrket i et flydende tilstand ved en enkelt celle per brønd. Kuglerne blev talt på dag 12. Kun ALDH1

høje celler fra AMOC-s og ES-2 celler indledt encellede sfæroider. Forstørrelse af billeder: × 200. Hver værdier er den gennemsnitlige procentvise af sfæroider ± SD. C Matrigel invasion assay Images: Matrigel-invaderende celler fra ALDH1

høje /lave celler af ES-2 og TOV-21G celler. Forstørrelse af billeder: × 100. Hver værdier er det gennemsnitlige antal invaderende celler ± SD. * P-værdier.

Vi derefter undersøgt invasionen evne ALDH1

høj og ALDH1

lave celler af matrigel invasion analysen. ALDH1

høje celler afledt fra alle fire line celler viste større matrigel invaderende evne end gjorde ALDH1

lave celler (Figur 2C).

cellecyklus status ALDH1

høje celler, og at af ALDH1

lave celler blev analyseret. Forholdene mellem ALDH1

høje celler i S-fase og G2 /M-fase var større end forholdet mellem ALDH1

lave celler i S-fasen og G2 /M-fase (Figur 3A). Cell vokse analyse viste, at ALDH1

høje celler afledt af AMOC-2 og RMG-1 celler havde højere vokse satser end ALDH1

lave celler (figur 3B).

En Cellecyklusanalyse ALDH1

høje og ALDH1

lave celler blev analyseret af en celle cyklus assay. Grafen viser forholdene mellem celler i G0 /G1 fasen, S-fasen og G2 /M-fasen. B-celle vækst analyse De vækst kapaciteter ALDH1

høje celler og ALDH1

lave celler blev undersøgt. Hver værdier er det gennemsnitlige antal celler ± SD.

Højere tumorfremkaldende i ALDH1

høje celler end det ALDH1

lave Cells

For at løse

in vivo

tumorgenicitet af ALDH1

høje og ALDH1

lave celler fra EOC-cellelinjer, xenograft transplantation i NOD /SCID mus ved ALDH1

høj og ALDH1

lave celler, der stammer fra AMOC-2 og RMG-1-celler blev udført (figur 4A, 4B og 4C). Som vist i tabel 1 blev tumorer observeret i 5 af 5 mus (10

4 celler injektion), 4 af 5 mus (10

3-celler injektion) og 2 af 5 mus (10

2 celler injektion ), hvor xenotransplantation af ALDH1

høje celler, der stammer fra AMOC-2-celler blev udført. På den anden side blev tumorer observeret i kun 3 af 5 mus (10

4-celler injektion) og 2 af 5 mus (10

3-celler injektion), hvori xenotransplantation af ALDH1

lave celler blev udført. Endvidere væksthastighed af tumorer afledt af AMOC-2 ALDH1

høje celler var signifikant hurtigere end for tumorer afledt af AMOC-2 ALDH1

lave celler (figur 4C). Lignende resultater blev opnået for RMG-1-celler (figur 4B og 4C).

A ALDH1

høje /lave tumorer afledt af AMOC-2-celler. B ALDH1

høje /lave tumorer afledt af RMG-1 celler. Billede: NOD /SCID-mus, som blev injiceret med 1,0 x 10

3 ALDH1

høje /lave celler og i hvilket tumorer observeret på begge sider af ryggen. Histologiske billeder: Hematoxylin-Eosin farvning (H-E, venstre panel), ALDH1 immunhistokemisk farvning (midterste panel), Ki-67 immunhistokemisk farvning (højre panel) af ALDH1

høj /lav tumorer. Forstørrelse af billeder: × 400. C Vækst kurver ALDH1

høje /lave tumorer afledt AMOC-2 og RMG-1 celler. Venstre kolonne: AMOC-2 celler, 1,0 x 10

3 injektion. Midterste kolonne: AMOC-2 celler, 1,0 x 10

2 injektion. Højre kolonne: RMG-1 celler, 1,0 x 10

3 injektion. Hver værdi er middelværdien tumorvolumen ± SD. * P-værdier. D immunreaktivitet over ALDH1 eller Ki-67 i ALDH1

høje /lave tumorer afledt af AMOC-2 og RMG-1cells Hver værdi er middelværdien positive procentdel ± SD. * P-værdier.

Histologiske aspekter af tumorer afledt ALDH1

høje celler og ALDH1

lave celler, der blev isoleret fra AMOC-2 og RMG-1 celler blev undersøgt ( Figur 4A og 4B). Tumorer afledt af AMOC-2 ALDH1

høje celler og AMOC-2 ALDH1

lave celler viste dårligt differentieret adenocarcinom og der var ingen signifikant forskel. Tilsvarende tumorer afledt af RMG-1 ALDH1

høje celler og RMG-1 ALDH1

lave celler viste dårligt differentieret clear cell adenokarcinom. Immunohistokemisk farvning viste, at der ikke var nogen signifikant forskel i ALDH1-positive sats mellem tumorer afledt AMOC-2 ALDH1

høje celler og tumorer afledt AMOC-2 ALDH1

lave celler, mens tumoren stammer fra RMG-1 ALDH1

høje celler viste signifikant højere ALDH1 positive satser end tumor stammer fra RMG-1 ALDH1

lave celler (Figur 4D). Desuden tumorer afledt AMOC-2 ALDH1

høje celler og RMG-1 ALDH1

høje celler viste signifikant højere positiv for Ki-67 (MIB-1) end tumorer afledt AMOC-2 ALDH1

lave celler og RMG-1 ALDH1

lave celler (figur 4D).

Identifikation af ALDH1

høje celler i Primary EOC prøver

for at opdage ALDH1

høje celler i primær ovariecancer, analyserede vi elleve kliniske materialer i det ALDEFLUOR assayet (5 tilfælde af faste ovariecancerceller og 6 tilfælde af malign ascites af æggestokkene kræfttilfælde, opsummeret i tabel 2). CD326-positive epitelceller blev identificeret i faste ovariecancer væv, og de positive varierede fra 8,1% til 81,0% (figur 5A, øvre paneler). ALDH1

høje celler blev påvist i 4 af de 5 tilfælde, og positive ALDH1

høje celle varierede fra 0,9% til 12,0% (figur 5A, lavere paneler). Desuden blev ALDH1

høje celler påvist i CD326-positive celler fra kræft i æggestokkene ascites i 4 af de 6 tilfælde, og de positive satser ALDH1

høje celler varierede fra 1,7% til 4,2% (figur 5B). Derfor ALDH1 aktivitet bestemmes ved hjælp af ALDEFLUOR analysen kan være en nyttig metode til isolering af CSCS /CIC fra primære æggestokkene cancerceller.

En analyse af primær fast ovariecancerceller Øverste panel viser CD326 farvning. Procent indicat positiv sats for CD326 celler. Lavere panel viser ALDEFLUOR assay af CD326-positive celler. Venstre: Patient No.1, tilfælde af scenen Ic klar celle adenocarcinom. Til højre: Patient No.3, tilfælde af scenen Ic endometrioide adenocarcinom. B Analyse af primære kræftceller fra ascites CD326-positive valg blev gjort før ALDEFLUOR analyse. Venstre: Patient No.4, tilfælde af scenen IIIc serøs adenokarcinom. Til højre: Patient No.6, tilfælde af scenen IIIb klar celle og endometrioide adenocarcinom. CD326: Epiteliale celleadhæsionsmolekyle (EpCAM). APC: allophycocyanin område. Procent scorer i felter angiver CD326-positive eller ALDH1-aktivitet nøgletal.

Foreningen af ​​høj ekspression Grad af ALDH1 er med dårlig prognose

I alt 123 epitelial kræft i æggestokkene væv blev immunhistokemisk farvet med anti-ALDH1 antistof (tabel 3, figur 6A). Medianerne af ALDH1-positive rater i serøse adenocarcinom tilfælde og klare tilfælde celle adenocarcinom var 20% og 15%, hhv. Vi delte derfor sagerne i to grupper, ALDH1

høj gruppe og ALDH1

lav gruppe, ifølge medianerne. Som vist i tabel 3, var der ingen signifikant korrelation mellem ekspressionsniveauet af ALDH1 med alderen eller med hver FIGO kliniske stadium. Høj udtryk niveau af ALDH1 viste ingen signifikant sammenhæng med fremskredne stadier (stadium III + IV), T faktor eller lymfeknude metastaser i begge serøse adenocarcinom sager og klare tilfælde celle adenocarcinom. Log-rank test viste, at højere ekspressionsniveau af ALDH1 er forbundet med dårligere prognose med en væsentlig forskel i OS af patienter med serøs adenokarcinom (P = 0,006) og OS af patienter med clear cell adenokarcinom (P = 0,047) end dem med mindre ekspressionsniveauet af ALDH1 (figur 6B). Højere udtryk niveau af ALDH1 viste en tendens til kortere PFS end det lavere udtryk niveau af ALDH1, men forskellene var ikke signifikante (serøs adenocarcinom: P = 0,062; klar celle adenocarcinom: P = 0,058).

A HE farvning og ALDH1 immunhistokemisk farvning af primær ovariecancer serøs adenokarcinom (til venstre) og primær ovariecancer klar celle adenocarcinom (højre) Øverst til venstre panel: HE farvning af ALDH1

høje eksemplar. Øverst til højre panel: ALDH1 immunhistokemisk farvning af ALDH1

høje eksemplar. Nederste venstre panel: H-E farvning af ALDH1

lave eksemplar. Nederste højre panel: ALDH1 immunhistokemisk farvning af ALDH1

lave eksemplar. Forstørrelse af billeder: × 400. B Log-rank test for ALDH1

høje /lave grupper af æggestokkene serøs adenokarcinom og klare celle adenocarcinom patienter. Serøs adenocarcinom: 62 tilfælde /klar celle adenocarcinom: 37 tilfælde. Sager i ALDH1

høj gruppe er tilfælde med positiv ratio for ALDH1 på over 20% for serøse adenocarcinom tilfælde og 15% for klare celle adenocarcinom tilfælde. Venstre: kolonne: progressionsfri overlevelse (PFS). Højre kolonne: samlet overlevelse (OS). * P-værdier.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi isoleret æggestok CSCS /CIC med høj tumorigenicitet ved ALDEFLURO assay. En ALDH1

stor befolkning kunne isoleres ikke kun fra æggestokkene kræftceller, men også fra primære kræft i æggestokkene prøver. Der er rapporteret flere metoder til isolering af CSCS /CIC. Faktisk, ovarie- CSCS /CIC succes er blevet isoleret ved hjælp af forskellige metoder, herunder ALDEFLUOR assay [25], side befolkning (SP) analyse [32], [33], og anvendelse af CD133

+ [34], CD44

+ CD24

– [35] og CD24

+ celler. [36] Der er imidlertid en kontroversiel rapport, der viser, at en CSC /CIC markør ikke fungerer i nogle typer af celler. [37], [38] Det er derfor vigtigt at validere cellepopulationen isoleret ved CSC /CIC markører af flere typer analyser. I denne undersøgelse har vi bekræftet, at ALDH1

stor befolkning havde højere tumorigenicitet og større kugle-dannende evne. Disse observationer viser, at ALDH1

høje celler vi anvendt i denne undersøgelse er beriget med CSCS /CIC. Der har været få rapporter om vellykkede isolation af CSCS /CIC fra primly æggestokkene cancerceller. Vi isolerede ALDH1

høje celler fra 8 af 11 primære tilfælde kræft i æggestokkene. Vi kunne ikke analysere ALDH1

høje celler fra primære ovariecancer på grund af begrænsningen af ​​celletal; Men vores tilgang er en mulig og lovende metode til isolering CSCS /CIC fra primære æggestokkene kræftformer.

Større histologiske undertyper af EOC er serøs adenocarcinom, klar celle adenocarcinom, endometrioide adenocarcinom og mucinous adenocarcinom, og disse undertyper er kendt at have forskellige karakteristika i risikofaktor for carcinogenese, molekylære biologiske aspekter og så videre. er behov for mere information om de enkelte undertyper at forbedre overlevelsen af ​​patienter. Serøs adenocarcinom er histologi subtype med værste prognose; dog er serøse adenocarcinom sager ofte diagnosticeret på fremskredent stadium. Clear celle adenocarcinom er gradvist stigende op til næsten 12% af EOC i asiatiske lande, og sammenligning af de tilfælde i samme fase af 3 histologiske undertyper (klar celle adenocarcinom, endometrioide adenocarcinom og mucinøs adenocarcinom) viste, at klare celle adenocarcinom er det fattigste prognose i hvert trin. Derfor er klar celle adenocarcinom menes at være den højeste karakter EOC, for nylig. [39], [40] Serøse adenocarcinom sager blev hovedsageligt analyseret i tidligere undersøgelser, og der har været nogle undersøgelser, hvor klare tilfælde celle adenocarcinom blev analyseret. [23] – [25] I denne undersøgelse analyserede vi ikke kun serøse adenocarcinom tilfælde, men også klare tilfælde celle adenocarcinom. Derfor vil disse oplysninger bringe indsigt i ikke kun for serøse adenokarcinomer, men også mest højeste kvalitet klare celle adenokarcinomer.

Vi fandt, at 4 EOC cellelinjer, herunder 3 klare celle adenocarcinom linjer var positive for kugle formation med 1000 celler /godt. På den anden side, kun to cellelinier (AMOC-2 og ES-2) viste sfære dannelse i enkelt celle sfære analyse. Disse resultater indikerer, at CSCS /CIC, der har evnen til at danne en kugle fra én celle, er beriget i ALDH1

høje celler; men forholdene mellem CSCS /CIC er ikke så høj, selv i ALDH1

store populationer. Dette resultat viste, at ALDEFLUOR analysen er blot et surrogat markør for CSCS /CIC og at kombinationen af ​​ALDEFLUOR assay med andre markører kan være en bedre tilgang til at isolere CSCS /CIC.

I tidligere undersøgelser af immunhistokemisk farvning, modstridende resultater vedrørende deltagelse af ALDH1 udtryk med prognose i EOC blev opnået. Chang

et al

. rapporterede, at ALDH1 udtryk korrelerer med gunstig prognose i serøs eller ikke-serøs ovariecancer [26], mens Deng

et al

. og Wang

et al

.