PLoS ONE: Interferon-α /Ø og Anti-fibroblast vækstfaktor receptor en monoklonalt antistof Undertryk Nedsat Cancer celler in vitro og in vivo

Abstrakt

Baggrund

hepatocellulært carcinom (HCC) er den mest almindeligt forekommende primær leverkræft og rangerer som den femte hyppigst forekommende kræft, samlet, og den tredje hyppigste årsag til kræftdødsfald , i hele verden. På nuværende effektive terapeutiske muligheder for HCC er begrænsede; følgelig prognosen for disse patienter er dårlig. Vores mål i nærværende undersøgelse var at identificere en ny mål for antistofbehandling mod HCC.

Metode /vigtigste resultater

Vi brugte Western blot og flow cytometrisk og immuncytokemiske analyser til at undersøge reguleringen af ​​FGFR1 ekspression ved interferon-α /β i flere humane hepatiske cancercellelinier. Desuden testede vi virkningen af ​​kombineret behandling med anti-FGFR1 monoklonalt antistof og interferon-α /β i en murin xenograftmodel af human HCC. Vi fandt, at interferon-α /β inducerer ekspression af FGFR1 i humane HCC-cellelinier, og at en anti-FGFR1 monoklonalt antistof (mAb) målretning af den inducerede FGFR1 effektivt kan inhibere væksten og overlevelsen af ​​HCC-celler

in vitro

og

in vivo

. Desuden er en kombination af interferon-α, anti-FGFR1 mAb og mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) der udøves en signifikant antitumorvirkning

in vitro

. Salg

Konklusioner

Vores resultater antyder, at den kombinerede anvendelse af et anti-FGFR1 antistof og interferon-α /β er en lovende fremgangsmåde til behandling af HCC

Henvisning:. Sasaki S, Ishida T, Toyota M, Ota a, Suzuki H, Takaoka A, et al. (2011) Interferon-α /β og Anti-fibroblast vækstfaktor receptor en monoklonalt antistof Undertryk Nedsat kræftceller i vitro og in vivo. PLoS ONE 6 (5): e19618. doi: 10,1371 /journal.pone.0019618

Redaktør: Young Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, Republikken Korea

Modtaget: 9 oktober, 2010; Accepteret 11. april 2011; Udgivet: 9. maj 2011

Copyright: © 2011 Sasaki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning på prioriterede områder fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (17016060 til KI og TI); Tilskud-i-Aid for Videnskabelig Forskning (C) fra Japan Society for fremme af videnskab (21.590.853 til SS); Grant-in-Aid for sonderende forskning fra Japan Society for fremme af videnskab (17659218 til SS og KI). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. A. Ota, M. Maeda, T. Seito er medarbejdere i Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer med andre efterforskere.

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er den mest almindeligt forekommende primær leverkræft og rangerer som den femte hyppigst forekommende kræft, samlet, og den tredje hyppigste årsag til kræftdødsfald, på verdensplan [1]. På nuværende tidspunkt kirurgi, er perkutane terapier, såsom ethanol injektion og radiofrekvens ablation, og transkateterteknikker behandlingsformer såsom arteriel chemoembolization anvendes i behandlingen af ​​HCC. Disse metoder kan selektivt at fjerne og dræbe kræftceller, hvilket gør dem anvendelige til styring af den lokale tumor; men de er ikke tilstrækkelige til at forbedre prognosen for HCC patienter, da sygdommen let opstår igen skyldes blodbårne metastaser (fx intrahepatisk metastase og vaskulær infiltration) eller udvikling af nye HCCs (multicentrisk carcinogenese). Derfor de 1-årige og 3-årige overlevelsesrater for HCC er kun 36% og 17%, henholdsvis [2]. Svaghederne ved de nuværende HCC behandlinger omfatter ufuldstændig hæmning af multicentrisk carcinogenese, problemer med at kontrollere intraportal infiltration, og den manglende evne til at forhindre forringelse af leverfunktionskapacitet eller fremme dens restaurering. Således kan også anvendes udvikling af nye behandlinger, der forbedrer prognosen for HCC patienter, og som hos patienter ældre og avancerede trin ville være meget ønskeligt.

Målretning celleoverflademolekyler vha mAb’er er et spirende strategi i cancerterapi, og mAbs mod kræft-relaterede overflade molekyler såsom EGFR, HER2 og CD20 med succes er blevet anvendt [3], [4], [5]. Imidlertid celleoverfladeekspression af antigene molekyler er ofte svag og heterogen, hvilket forhindrer den effektive målretning af tumorer [6] og til dato, har kun få pilotundersøgelser undersøger ekspression af HCC-associerede antigener blevet udført [7].

Interferoner (IFN’er), der er almindeligt anvendt til behandling af neoplasier og virussygdomme, forøge ekspression af flere celleoverflademolekyler både

in vitro Salg og i xenograft tumormodeller [8], [9 ]. Induktion af genekspression ved IFN er et komplekst fænomen, der involverer aktivering af målgener via phosphorylering af statistikker af JAK-kinase [10]. Desuden kan IFN’er inducere ekspression af interferon regulatoriske faktorer (IRFS) og transkriptionsfaktorer, som derefter inducerer gener involveret i apoptose og immunresponser [11]. IFN’er bliver allerede brugt til at behandle de fleste hepatitis patienter, og deres virkninger foreslår at målrette celleoverflademolekyler induceret af IFN kan være en nyttig strategi til behandling af HCC. Vores mål i den foreliggende undersøgelse var at anvende HCC-cellelinier og en murin xenograftmodel af human HCC at undersøge ændringer i genekspression induceret af IFN og identificere potentielle mål for antistofterapi. Vores resultater tyder IFN-α /β-induceret fibroblastvækstfaktorreceptor 1 (FGFR1) kunne være et hidtil ukendt terapeutisk mål til behandling af HCC.

Resultater

Induktion af FGFR1 ekspression ved IFN α /β i HCC xenotransplantater

For at identificere gener opreguleres af IFN i HCC-celler, udførte vi en microarray analyse ved anvendelse af cDNA fremstillet fra tumorer dyrket i SCID-mus subkutant administreret HepG2-celler, en human hepatisk cancer cellelinie. Resultaterne af microarray analyse er opsummeret i figur 1A. Blandt generne opreguleret ved IFN var

FGFR1

, som koder for en receptortyrosinkinase. Real-time PCR-analyse bekræftede induktion af

FGFR1

transkription af både IFN-α og IFN-β (figur S1), og tilsvarende stigninger i FGFR1 protein blev observeret i HepG2, Huh-7 og CHC4 celler (figur 1B -D). Vi derefter bruges immunhistokemisk farvning for at undersøge fordelingen af ​​IFN-α /β-induceret FGFR1 inden tumorerne og fandt, at niveauer af FGFR1 blev forhøjet ved cellemembranen og i cytoplasmaet af HCC-celler (figur 1E).

A, Oversigt over gener fremkaldt af IFN-α i hepatiske cancer cellelinjer og HepG2-xenotransplantater. Ekspression af gener induceret ved IFN-α blev undersøgt under anvendelse af DNA array analyse, og ekspression af

FGFR1

viste sig at være stærkt induceres. B, Western blot, der viser IFN-α /β-induceret ekspression af FGFR1 i humane hepatiske cancerceller. Relative proteinniveauer er angivet nedenfor. C, Flowcytometrisk analyse viser IFN-α /β-induceret ekspression af FGFR1 i humane hepatiske cancerceller: sort, intet antistof; grøn, ingen IFN; Pink, IFN-α; Blå, IFN-β. D, Western blot, der viser tidsforløbet af FGFR1 ekspression efter behandling med IFN-α /β. Immunoblots blev udført ved anvendelse af total lysater fra HepG2-xenotransplantater. E, IFN-α /β-induceret FGFR1 ekspression i udskårne væv fra HepG2-xenotransplantater. FGFR1 blev farvet ved hjælp af anti-FGFR1 antistof.

Udvikling af en anti-FGFR1 monoklonalt antistof

Vi udviklede nye anti-FGFR1 mAbs ved immunisering BALB /c mus med et FGFR1 ekspressionsvektor . Seks antistoffer, der genkender FGFR1 blev isoleret fra musene, hvoraf to, betegnet A2C9-1 og A2D11-1, udviste kraftig affinitet i ELISA’er og blev karakteriseret yderligere. For kinetiske analyser blev det ekstracellulære domæne af FGFR1 kovalent koblet til en CM-5 sensor chip ved lav densitet (215 responsenheder af FGFR1), hvorefter bestemte vi Kd-værdier for A2C9-1 og A2D11-1 at være 209 nM og 7,03 uM (fig S2a). Således viste A2C9-1 den stærkeste affinitet for FGFR1. Flowcytometrisk analyse bekræftede, at A2C9-1 reagerer med FGFR1 (figur 2), og Western blot-analyse viste den molekylære vægt af ektopisk udtrykte FGFR1 at være omkring 115 kDa (fig S2B).

flowcytometrisk analyse viser ekspressionsniveauet af FGFR1 og specificiteten af ​​A2C9-1 mAb. Venstre: Graferne viser de opnåede med lysater fra NIH3T3-celler resulterer i hvilke M19B2 cDNA indført (kontrol). Til højre: graferne viser resultaterne med lysater fra NIH3T3 celler, hvori fuld-længde FGFR1 cDNA blev indført

Anti-FGFR1 mAbs hæmmer HCC cellevækst in vitro

Vi næste undersøgt. virkningerne af A2C9-1 og A2D11-1 mAb’er på væksten af ​​hepatiske cancerceller (figur 3). IFN-α viste nogen antitumoraktivitet over hepatiske cancerceller, og svag vækst suppression blev set, når A2C9-1 eller A2D11-1 blev tilsat til kulturer i fravær af IFN-α. På den anden side, behandling med en kombination af A2C9-1 og IFN-a signifikant reduceret celleoverlevelse i sammenligning med behandling med IFN-α alene (

P

= 0,01) (Figur 3). Virkningen af ​​A2D11-1 i kombination med IFN-α var ikke større end effekten af ​​IFN-α alene.

I grafen er overlevelsesraten blandt dyrkede HepG2 HCC-celler vist på den lodrette akse, og inkubationstiden efter indgivelse af de angivne stoffer er vist på den horisontale akse. PBS er den negative kontrol. Symboler og bjælker repræsenterer middelværdier ± SD. Bemærk, at behandling med en kombination af A2C9-1 og IFN-a signifikant reduceret celleoverlevelse i sammenligning med behandling med IFN-α alene (

P

= 0,01).

Effekter af A2C9-1 med og uden IFN-α i en mus xenotransplantat tumormodel

Vi næste testede antitumorvirkninger af et anti-FGFR1 mAb i en mus xenograft model for human HCC (figur 4A og B). I mus behandlet med kun A2C9-1 eller IFN-α, havde tumorvolumener ikke fra kontrolgruppen indgives PBS. Men behandling med IFN-α + A2C9-1 havde en inhibitorisk virkning på tumorvækst, men undertrykkelsen ikke var statistisk signifikant. Endelig i mus behandlet med IFN-a + A2C9-1 + PBMC’er (perifere mononukleære celler), der var en signifikant antitumorvirkning sammenlignet med grupperne behandlet med PBS (p = 0,026), INF-α (p = 0,03) , A2C9-1 (p = 0,014), PBMC (p = 0,022) eller IFN-a + PBMC’er (p = 0,007). Faktisk tumoren forsvandt i 2 af de 4 dyr testet. I løbet af forsøgene vi detekteret nogen cytotoksicitet over normale hepatocytter (data ikke vist). Histologisk analyse afslørede markant infiltrering af mononukleære celler fra de resterende tumorvæv fra mus behandlet med IFN-a + A2C9-1 + PBMC’er, men der observeredes ingen sådan infiltration i tumorvæv fra mus i de andre grupper (fig S3).

A, Repræsentative billeder af tumor transplantater på SCID-mus. B, I grafen størrelserne af tumorerne i hver gruppe (n = 4 mus pr gruppe) er vist på den lodrette akse, og den forløbne tid efter behandling med de angivne lægemidler og celler er vist på den horisontale akse. Symboler og barer er middelværdier ± SD. C, Tumorvolumener efter behandling med de angivne lægemidler og celler. PBS er den negative kontrol. Dataene er middel ± SD.

IFN øger ophobning af anti-FGFR1 mAb inden tumorer

For yderligere at bekræfte, at den observerede regression af xenotransplantaterne var relateret til behandlingen med A2C9-1 mAb, Alexa Fluor 680-konjugeret A2C9-1 blev injiceret i halevener tumorbærende SCID-mus, hvorefter målretning af tumoren ved A2C9-1 blev evalueret i de samme dyr på forskellige tidspunkter under anvendelse af et optisk molekylær billeddannelse systemet (figur 5A og B). Hos mus forbehandlet med IFN-α, A2C9-1 selektivt og tidsafhængigt akkumuleret inden tumorerne i perioden fra 24 timer til 192 timer efter dens administration. Derimod blev der kun opdaget ubetydelige niveauer af mAb i kontrol mus administreret A2C9-1 + PBS. Vi bekræftede også, at der var ingen akkumulering af en Alexa Fluor 680-konjugeret kontrol-antistof (data ikke vist). Det fremgår således, at IFN-α forøger akkumulering af anti-FGFR1 mAb

in vivo

, mest sandsynligt ved opregulering FGFR1.

A, SCID-mus var xenotransplanteret med 1 × 10

6 HepG2-celler, hvorefter 50 ug Cy5-konjugeret A2C9-1 mAb blev intravenøst ​​administreret via halevenen. Mus blev derefter afbildet under anæstesi. B, Time løbet af Cy5 signal intensitet.

Diskussion

I denne undersøgelse fandt vi, at FGFR1 kan tjene som en ny målsætning for antistofbehandling i HCC. Mere specifikt kombineret behandling med IFN-α /β og en anti-FGFR1 mAb (A2C9-1) viste stærk vækst undertrykkende virkninger på humane HCC celler

in vitro

in vivo

. Fem isoformer af transmembrane receptor FGFR (FGFR1-4 og FGFR5 /1L) er kendt for at blive udtrykt i pattedyr [12]. Hver består af tre ekstracellulære immunglobulin-lignende domæner, et transmembrandomæne og to intracellulære tyrosinkinase-domæner. FGF binder til FGFR via to af de immunoglobulinlignende domæner (II og III). Under FGFR ekspression, alternativ splejsning af

FGFR

transkripter producerer multiple splejsningsvarianter med forskellige vævsspecifikke ligandspecificiteter [13]. Blandt dem har FGFR1 blevet vist at blive udtrykt i HCC og er kendt for at fremme udviklingen af ​​HCC som reaktion på kræftfremkaldende stimulation [14]. FGFR1 udtrykkes ikke i noncancerous hepatocytter. FGFR1-medieret signalering er involveret i cancercellevækst og infiltration, samt ved angiogenese [15], som allerede er et mål for antitumor-terapier [16]. Desuden har tidligere undersøgelser vist forhøjede ekspression af FGFR ligander, herunder FGF1 og FGF2, i ubearbejdet HCC væv og hepatiske cancercellelinier [17], [18], [19], [20], hvilket kraftigt antyder FGF signalering spiller en central rolle i udviklingen af ​​HCC. Disse egenskaber gør FGFR1 et attraktivt molekylære mål for behandling af HCC.

Et stort problem med antistofbehandling mod kræft er den svage og heterogene udtryk for celleoverfladeantigener. For at overvinde dette problem, vi undersøgte gener opreguleret ved IFN i HCC xenografter. Vi fandt, at ekspression af FGFR1 induceres af IFN-α /β og at behandling HCC-celler med en kombination af IFN-α /β og et anti-FGFR1 mAb effektivt hæmmer væksten og overlevelsen af ​​HCC-celler. Således er en årsag til den utilstrækkelige terapeutiske virkning af anticancer lægemidler rettet mod FGFR1 synes at være, at uden induktion, ekspression af FGFR1 på cancerceller, ikke er tilstrækkelig til effektiv behandling. Konsistent med denne ide, viste vores immunhistokemisk analyse ekspression af FGFR1 at være meget lav i ubehandlede HCC-celler. Især, epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er også opreguleret ved IFN [21], og dette opregulering af EGFR er en afgørende faktor bag modtageligheden af ​​påvirkede cancerceller til anti-EGFR-antistof-behandling [22]. Tilsammen tyder disse resultater på behandling med en kombination af IFN og et antistof kan være et effektivt terapeutisk strategi mod forskellige former for kræft.

Den molekylære mekanisme, ved hvilken IFN-α /β inducerer FGFR1 udtryk fortsat ukendt. Det er imidlertid kendt, at de antitumor og antivirale virkninger af IFN medfører ændring af transkriptionel regulering af forskellige gener [23], og at IFN-inducerbare gener indeholder et interferon respons element (ISRE) i deres promotorregioner [24]. Ved anvendelse af en transkriptionsfaktor søgeprogram, vi identificeret en række formodede ISREs i 5′-UTR of FGFR1, hvilket antyder, at FGFR1 kunne være et direkte mål af type I IFN (data ikke vist). Yderligere undersøgelse vil være nødvendigt at bestemme præcist, hvordan interferon inducerer FGFR1.

Vi har heller endnu ikke fuldt ud forstår den molekylære mekanisme, hvormed vores antistof udøvede sin anti-tumor effekt, selv om der er flere muligheder. Mange af de tumor-udtrykte mål for terapeutiske antistoffer er vækstfaktorreceptorer. For eksempel anti-EGFR-antistoffer, herunder Cetuximab, har vist sig at blokere vækstfaktorsignalering ved at forhindre liganden i at binde til sin receptor, eller ved at forhindre receptordimerisering [25]. Det er meget sandsynligt, at A2C9-1 undertrykker tumorcellevækst igennem en lignende mekanisme ved at målrette IFN-induceret FGFR1. Det blev også rapporteret, at bindingen af ​​et antistof til en vækstfaktor receptor resulterer i internalisering af antistof-receptor-komplekset, og nedregulering af downstream signalering [26]; men vi observeret nogen A2C9-1-induceret internalisering i cancerceller (data ikke vist). For det tredje, antistoffer mod vækstfaktorreceptorer også udøve vækst undertrykke effekter via immunsystemet [27]. Her for eksempel, viste vi, at IFN-α /β forøger overfladeekspression af FGFR1, måske muliggøre en anticancervirkning baseret på antistof-afhængig cellemedieret cytotoksicitet at ledsage bindingen af ​​anti-FGFR1 mAb til receptoren. Resultaterne af vores

in vivo

eksperiment viser betydningen af ​​PBMC’er til antitumorvirkninger af A2C9-1 er konsistent med den ide, at dette antistof kraftigt stimulerer antistof-afhængig cellemedieret cytotoksicitet.

sammenfattende fandt vi, at IFN-α /β inducerer ekspression af FGFR1 og at behandling med en kombination af IFN-α /β og et anti-FGFR1 mAb undertrykker HCC cellevækst

in vitro

i vivo

. Vi bekræftede også, at IFN-α /β øger ophobningen af ​​anti-FGFR1 mAb inden tumorer. Denne behandling protokol inhiberer selektivt væksten af ​​HCC-celler uden at påvirke normale celler, hvilket antyder, at det kan anvendes til behandling af HCC uden at reducere hepatisk indledende ydeevne. Vi foreslår derfor, at vores resultater kan danne grundlag for en ny tilgang til behandling af HCC, som der ikke er nogen effektiv terapi i øjeblikket.

Materialer og metoder

cellelinjer og eksperimenterende dyr

Humane hepatiske cancer cellelinjer (HepG2, Huh-7 og CHC4) blev opnået fra den japanske Collection of Research Bioressourcer (Tokyo, Japan) og dyrkes som anbefalet. Celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium tilsat 10% føtalt bovint serum og penicillin /streptomycin ved 37 ° C under en atmosfære af fugtig luft med 5% CO

2. Perifere, mononukleare blodceller (PBMC’er) blev isoleret fra raske frivillige ved anvendelse af Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sverige) og anvendt som effektorceller i SCID-mus. Alle donorer forudsat skriftligt informeret samtykke før samling i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen, og alle protokoller med humane prøver blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelse Sapporo Medical University. Whole PBMC’er (1 × 10

7) suspenderet i 0,2 ml RPMI 1640 blev intraperitonealt injiceret i hver SCID mus. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med anerkendte standarder for pasning af dyr og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Sapporo Medical University.

microarray analyse

For microarray analyse, HepG2-celler (1 × 10

6 celler) blev indledningsvis xenotransplanteret til svær kombineret immundefekt (SCID) mus. Tre uger senere, når den resulterende tumor havde nået 6-7 mm i diameter, IFN-α (OIF®; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokushima, Japan) blev subkutant injiceret i en dosis på 2000 U /mus. Prøver af tumorvæv blev opsamlet før og 24 timer efter injektion af IFN-α. RNA blev ekstraheret fra de indsamlede væv under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og revers transkriberet til cDNA ved anvendelse af Superscript III (Invitrogen). CDNA’et blev derefter omsat ved anvendelse Gene Navigator cDNA Array Filter-human cancer (Toyobo, Osaka, Japan) og underkastet DNA array analyse under anvendelse af en Fluor-S Multi Imager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Real-time RT-PCR-analyse

HepG2 (1 × 10

6 celler) celler var subkutant xenotransplanteret i ryggen på SCID-mus. Når den podede tumor nåede 10 mm i diameter, IFN-α (OIF®) eller IFN-β (Feron®; fremstillet af Toray Industries, Inc., Tokyo, Japan) blev administreret intravenøst ​​i en dosis på 2000 U /mus, og prøver af tumorvæv blev opsamlet 0, 1, 3, 8, 24 og 48 timer efter administration. Totalt RNA blev oprenset fra prøverne under anvendelse af en RNeasy Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland), og enkeltstrenget cDNA blev syntetiseret ud fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse af en First-Strand cDNA Synthesis Kit (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sverige) . Real-time kvantitativ analyse blev udført ved anvendelse SYBR Green I (Roche, Basel, Schweiz) med en LightCycler real-time PCR-system (Roche). Niveauer af FGFR1 og OAS1 (kontrol) mRNA-ekspression blev normaliseret til ekspressionen af ​​GAPDH mRNA. Primersæt til FGFR1 (sense, 5′-GGA CGA TGT GCA GAG CAT CAA CTG-3 ‘; antisense, 5′-AAC TTC ACT GTC TTG GCA GCC GG-3′), OAS1 (sense, 5’-CAT CCG CCT AGT CAA GCA CTG-3 ‘; antisense, 5′-CCA CCA CCC AAG TTT CCT GTA-3′) og GAPDH (sense, 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3 ‘; anti-sense , 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT-TC-3 ‘) blev syntetiseret ved Greiner Bio-One (Tokyo, Japan).

Western blot-analyse

HepG2, Huh-7 eller CHC4 celler blev inkuberet i 48 timer i nærvær af IFN-α eller IFN-β (1.000 IE /ml), hvorefter cellerne blev lyseret i prøvebuffer (50 mM Tris-HC1, pH 6,8, 6% 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 0,004% bromphenolblåt og 10% glycerol). Proteiner i prøver af lysatet blev adskilt ved 7,5% polyacrylamidgelelektroforese og derefter overført på en nitrocellulosemembran (Bio-Rad Laboratories). Efter blokering af membranen med 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 1 time ved stuetemperatur blev det inkuberet med anti-humant FGFR1 antistof (sc-121, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) i 1 time ved stuetemperatur. Blottet blev derefter fremkaldt med 0,005% H

20

2-3, 3′-diaminobenzidin anvendelse af et immunperoxidase ABC kit (Vectastain ABC kit, Vector Labs, Burlingame, CA, USA).

flowcytometrisk analyse

Otteogfyrre timer efter indgivelse af IFN-α, blev ekspression af FGFR1 vurderet ved anvendelse af flowcytometri. Celler i suspension (4 x 10

5 celler /rør) blev vasket med 2 ml vaskebuffer (0,2% bovint serumalbumin, 0,1% NaN

3/10 mmol /l phosphatpufret saltvand, pH 7,4) og centrifugeret ved 300

g

i 5 min ved 4 ° C, hvorefter supernatanten blev fjernet. Den tilbageværende cellepellet blev fikseret i 0,25% paraformaldehyd i mindst 15 minutter i mørke ved stuetemperatur, vaskes to gange med 2 ml vaskepuffer, inkuberet i 1 time i 70% methanol ved 4 ° C og derefter vasket igen. For at undersøge ekspression af FGFR1 blev de fikserede celler inkuberet først med anti-FGFR1 antistof (1:100 fortynding) i 1 time ved 4 ° C. Cellerne blev derefter vasket to gange og inkuberet i 30 minutter i 4 ml fluoresceinisothiocyanat-konjugeret gede anti-mus IgG på is i mørke. Efter igen vask af cellerne to gange, blev de suspenderet i 1 ml vaskebuffer til analyse under anvendelse af en FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA).

Analyse af FGFR1 ekspression i humane lever cancer xenotransplantater

HepG2-celler (1 x 10

6 celler) xenotransplanteret i SCID-mus. Når den resulterende tumor nåede 10 mm i diameter, blev IFN-α (OIF®) eller IFN-β (Feron®) indgivet intraperitonealt eller intravenøst ​​i en dosis på 100 U /g, og 24 timer senere tumorvæv blev opsamlet. Western blot og immunohistokemiske analyser blev derefter udført under anvendelse af et anti-humant FGFR1 antistof. (Sc-121; Santa Cruz Biotechnology)

Fremstilling af anti-FGFR1 Antibody

Et polynukleotid der koder for regionen, der strækker sig fra amino acid 1 til 822 af FGFR1 og repræsenteret ved SEQ ID NO. 1 blev amplificeret ved PCR under anvendelse af fuld længde FGFR1 (Accession Nr NM_000604) som template med primerne No. 5′-3 [(SEQ ID NO. 3): 5′-ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA-3 ‘] og nr 3′ 3 [(SEQ ID NO. 4): 5’-AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA-3 ‘]. Det amplificerede polynukleotid blev indsat i pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for at konstruere en ekspressionsvektor, som blev administreret som det immuniserende antigen i en dosis på 50 ug /mus i et volumen 50-pi ved 1- eller 2- ugers intervaller. Antigenet for den første immunisering blev blandet med komplet Freunds adjuvans, mens de antigener til den anden og efterfølgende administrationer blev blandet med Freunds inkomplette adjuvans. Spleen monocytiske celler fra den immuniserede mus og en fusionspartner, X63-Ag8-653, blev fusioneret under anvendelse af polyethylenglycol-medieret cellefusion, som blev efterfulgt af selektion af et hybridom under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Kinebuchi et al. [28]. Celler, som havde reageret med det immobiliserede FGFR1 blev dyrket i serumfrit GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) for at fremstille mAb’er indtil 80% af cellerne var døde. Cellerne blev derefter fjernet fra dette medium ved centrifugering (1.000 rpm, 15 min), og ammoniumsulfat blev tilsat til 50% mætning og efterladt natten over ved 4 ° C. De resulterende præcipitater blev indvundet ved centrifugering (1.000 rpm, 30 min) og opløst i to gange fortyndet bindingspuffer (Protein AMAPS II kit), hvorefter IgG blev adsorberet på en protein A-søjle (GE Healthcare Life Science). Efter eluering mAb’erne fra søjlen blev eluatet dialyseret mod PBS natten over til oprense antistoffer, hvilket gav en række mAb’er genkender FGFR1. En af disse mAbs blev betegnet A2C9-1 og blev bekræftet at genkende FGFR1 ved Western blotting og FACS hjælp prøver af FGFR1 udtrykt i NIH3T3 celler.

Affinity måling

Affiniteten af ​​anti-FGFR1 mAbs for FGFR1 blev fastsat på grundlag af overfladen (SPR) med en Biacore 3000-enhed (Biacore AB, Uppsala, Sverige). Det ekstracellulære domæne af FGFR1 blev kovalent koblet til en CM-5 sensor chip ved lav densitet (215 responsenheder af FGFR1). Bindende kinetik blev derefter vurderet under anvendelse dobbelt seriefortyndinger af antistof i koncentrationer fra 500 til 0,08 nM i løbebuffer (PBS, pH 7,4, 0,005% (vol /vol), polysorbat 20 – filtreret og afgasset) ved 25 ° C og en strømnings- hastighed på 25 ml /min. Proceduren regenereringen bestod af tre injektioner med 10 ml 2,5 M guanidiniumhydrochlorid, hvorefter sensorchippen blev skyllet i 5 minutter med rindende puffer. Statistik og databehandling blev udført ved anvendelse BIA evaluering software 4.0.1 og GraphPad Prism 4,02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Alle SPR eksperimenter blev udført ved Biaffin GmbH Co. KG (Kassel, Tyskland).

Vurdering af effekten af ​​anti-FGFR1 mAb på hepatisk kræftcelle levedygtighed

For at undersøge effekten af ​​at administrere IFN-α (OIF®) i kombination med anti-FGFR1 mAb (A2C9-1 eller A2D11-1) til HCC-celler, vurderede vi overlevelsesraten for HepG2-celler i nærvær og fravær af IFN-α og /eller anti-FGFR1 mAb. HepG2-celler blev podet i brøndene i en 24-brønds plade til en densitet på 1 x 10

4 celler /brønd, hvorefter anti-FGFR1 mAb, IFN-α eller anti-FGFR1 mAb + IFN-α blev tilsat, og dyrkningen blev fortsat i 0 til 6 dage. Cellerne blev derefter løsrevet anvendelse af trypsin, og overlevelsesraten blev vurderet ved anvendelse MTT-assays. Antistof-dyrkningsmedium blev tilføjet som negativ kontrol, og celler, som intet blev tilføjet, blev anvendt som en ekstra kontrol.

Terapeutisk eksperimentere med humane lever kræftceller-xenotransplanterede mus

HepG2-celler ( 5 × 10

6 celler /mus) var xenotransplanteret subkutant i ryggen af ​​CB17-scid /SCID-mus. Når mængden af ​​tumorerne nåede 100 mm

3, blev musene inddelt i 7 behandlingsgrupper: 1) Mus i PBS-gruppen modtog intravenøse injektioner af PBS (250 pi) og normal muse IgG (100 ug). 2) IFN-α gruppe modtog intraperitoneale injektioner af IFN-α (OIF®: 2000 U) og normalt muse-IgG (100 ug). 3) Antistoffet modtog intravenøse injektioner af PBS og anti-FGFR1 mAb (100 ug; A2C9-1). 4) IFN-α + antistof gruppe modtog intraperitoneale injektioner af IFN-α (2000 U) og intravenøse injektioner af anti-FGFR1 mAb (100 ug). 5) IFN-α + antistof + PBMC gruppe modtog intraperitoneale injektioner af IFN-α (2000 U), intravenøse injektioner af anti-FGFR1 mAb (100 ug) og intravenøs administration af PBMC’er (1 × 10

7 celler). 6) IFN-α + PBMC gruppe modtog intraperitoneale injektioner af IFN-α (2000 U) og intravenøs administration af PBMC’er (1 × 10

7 celler). 7) PBMC gruppe modtog intravenøs administration af PBMC’er (1 × 10

7 celler). Behandlinger blev administreret 5 gange i alt, begyndende på dag 0 og derefter 1 uge senere (w1), 2 uger senere (w2), 5 uger senere (W5) og 6 uger senere (W6). Kun ved W6, blev dosis antistof forøget til 200 pg /mus. Hver gruppe indeholdt 4 dyr, og størrelsen af ​​tumoren blev målt som (hovedakse) x (lilleakse) x 2 ugentligt efter indledende administration. Tumorer blev høstet en uge efter den sidste behandling.

Immunophotodetection i tumor-bærende mus

HepG2 humane HCC-celler (1 x 10

6 celler) blev xenotransplanteret ind i ryggen på SCID-mus . Tre uger senere, når den podede tumoren havde nået omkring 10 mm i diameter, IFN-α (OIF; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) i en dosis på 20.000 U /mus eller PBS (kontrol) blev administreret intraperitonealt. Efter 24 timer, 50 ug Alexa Fluor 680-konjugeret anti-FGFR1 mAb blev intravenøst ​​administreret via halevenen. Musene blev derefter afbildet under anæstesi ved hjælp af en IVIS LUMINA imaging system (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA).

Støtte oplysninger

figur S1.

Induktion af

FGFR1

transkripter efter IFN-α og IFN-β. HepG2-celler (1 x 10

6 celler) blev subkutant xenotransplanteret ind ryggen af ​​SCID-mus. Når den podede tumor havde nået 10 mm i diameter, blev IFN-α eller IFN-β administreres intraperitonealt eller intravenøst ​​i en dosis på 2000 U /mus. Tumorvæv blev derefter opsamlet 0, 1, 3, 8, 24 og 48 timer efter administration. A, tidsforløbet for FGFR1 og OAS1 (kontrol) mRNA-ekspression efter indgivelse af IFN-α. FGFR1 mRNA (blå linje) blev forøget 3 h (151%), 8 h (202%) og 24 timer (119%) efter administration. OAS1 mRNA (rød linje) blev forøget 3 timer (162%), 8 h (133%) og 24 timer (150%) efter administration. Vist er gennemsnit af to replikater af real-time RT-PCR. B, tidsforløbet for FGFR1 og OAS1 mRNA-ekspression efter indgivelse af IFN-β. FGFR1 mRNA (blå linje) blev øget 8 h (348%) og 24 timer (337%) efter administration, mens OAS1 mRNA (rød linje) blev forøget 3 h (262%) og 8 h (511%) efter administration. Niveauerne af mRNA-ekspression blev normaliseret med den for GAPDH mRNA.