PLoS ONE: Zink Finger Nuclease medieret Knockout af ADP-Dependent Glucokinase i kræftceller: Effekter på Cell Survival og mitokondrie oxidative metabolisme

Abstrakte

Zink finger nukleaser (ZFN) er stærke værktøjer til redigering gener i celler. Her bruger vi ZFNs at afhøre den biologiske funktion af

ADPGK

, der koder for et ADP-afhængig glucokinase (ADPGK), i humane tumorcellelinier. Hypotesen vi testede, er, at ADPGK udnytter ADP til at phosphorylere glucose under betingelser, hvor ATP bliver begrænsende, såsom hypoksi. Vi karakteriseret to ZFN knockout-kloner i hver af to linjer (H460 og HCT116). Alle fire kloner havde læserammeforskydningsmutationer på alle alleler i målområdet i exon 1 af

ADPGK,

og var ADPGK-nul ved immunoblotting.

ADPGK

knockout havde ringe eller ingen effekt på celledeling, men kompromitteret evne H460 celler til at overleve siRNA lyddæmpning af hexokinase-2 under iltede forhold, med klonogene overlevelse falder fra 21 ± 3% for forældrenes linje til 6,4 ± 0,8% (p = 0,002) og 4,3 ± 0,8% (p = 0,001) for de to knockouts. En lignende øget følsomhed over for klonogenisk celledrab blev observeret under anoxi. Der blev ikke fundet sådanne ændringer, når

ADPGK

blev slået ud i HCT116 celler, for hvilke forældrenes linje var mindre følsomme end H460 for iltmangel og hexokinase-2 lyddæmpning. Mens knockout af

ADPGK

i HCT116 celler forårsaget få ændringer i den globale genekspression, knockout af

ADPGK

i H460 celler forårsaget bemærkelsesværdige opregulering af mRNA, der koder celleadhæsionsproteiner. Overraskende kunne vi skelne nogen konsekvent effekt på glycolyse målt ved glucose forbrug eller lactat formation under iltmangel, eller ekstracellulær forsuring sats (Seahorse XF analysator) under iltede forhold i en række medier. Men forbrug ilt satser var generelt lavere i

ADPGK

knockouts, i nogle tilfælde markant så. Kollektivt, resultaterne viser, at

ADPGK

kan bidrage til tumorcelleoverlevelse under forhold med høj glykolytisk afhængighed, men den fænotype som følge af knockout af

ADPGK

er cellelinje afhængig og synes at være relateret til priming af glykolyse i disse linjer

Henvisning:. Richter S, Morrison S, Connor T, Su J, Print CG, Ronimus RS, et al. (2013) Zink Finger Nuclease medieret Knockout af ADP-Dependent Glucokinase i kræftceller: Effekter på Cell Survival og Mitokondriel oxidative metabolisme. PLoS ONE 8 (6): e65267. doi: 10,1371 /journal.pone.0065267

Redaktør: Mark Isalan, Center for Genomic forordning, Spanien

Modtaget: Marts 5, 2013; Accepteret: April 23, 2013; Udgivet 14. juni, 2013

Be the first to comment

Leave a Reply