PLoS ONE: epigenetisk inaktivering af peroxisomproliferatoraktiverede receptor γ er en biomarkør for tarmkræft Progression og Adverse Patienter Outcome

Abstrakt

Forholdet mellem peroxisomproliferatoraktiverede receptor γ (

PPARG

) udtryk og epigenetiske forandringer i colorectal-cancer patogenese er stort set ukendt. Vi undersøgte, om

PPARG

er epigenetisk reguleret i kolorektal cancer (CRC) progression.

PPARG

udtryk blev vurderet i CRC væv og parret normal slimhinde ved western blot og immunhistokemi og relateret til patienternes klinisk-patologiske parametre og overlevelse.

PPARG

promotor methylering blev analyseret ved methylering-specifikke-PCR og bisulfit sekventering.

PPARG

udtryk og promotor methylering blev ligeledes undersøgt også i CRC afledte cellelinier. Chromatin immunoprecipitation i basale betingelser og efter epigenetisk behandling blev udført sammen med banke-down eksperimenter af formodede regulatoriske faktorer. Genekspression blev overvåget ved immunoblotting og funktionelle assays af celleproliferation og invasionsevne. Methylering på en bestemt region af promotoren er stærkt korreleret med

PPARG

manglende udtryk i 30% af de primære CRC’er og med patienternes dårlig prognose. Bemærkelsesværdigt er den samme methyleringsmønster fundet i

PPARG

-negative CRC cellelinier. Epigenetisk behandling med 5′-aza-2′-deoxycytidin kan vende tilbage denne tilstand og, i kombination med trichostatin A, dramatisk re-aktiverer gentransskription og receptoraktivitet. Transkriptionel silencing skyldes ansættelse af MeCP2, HDAC1 og EZH2 at give undertrykkende kromatin signaturer der bestemmer en øget celle proliferativ og invasive potentiale, funktioner, der kan eksperimentelt blive gendannet. Vores resultater giver en ny mekanistisk indsigt i epigenetisk inaktivering af

PPARG

i CRC, der kan være relevant som prognostisk markør for tumor progression

Henvisning:. Pancione M, Sabatino L, Fucci A, Carafa V, Nebbioso A, Forte N, et al. (2010) epigenetisk inaktivering af peroxisomproliferatoraktiverede receptor γ er en biomarkør for tarmkræft Progression og Utilsigtede patienters Outcome. PLoS ONE 5 (12): e14229. doi: 10,1371 /journal.pone.0014229

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 10. juli 2010; Accepteret: November 9, 2010; Udgivet: December 3, 2010

Copyright: © 2010 Pancione et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af tilskud fra AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) til VC og L.A .; EU-projekt til LA De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

peroxisomproliferatoraktiverede receptorer (PPAR’er) er ligand-afhængige transkriptionsfaktorer, der tilhører den nukleare hormonreceptor superfamilien [1]. Tre forskellige PPAR isoformer, α, β og γ er blevet isoleret indtil nu, hver med en distinkt mønster af væv ekspression og evne til at interagere med forskellige klasser af forbindelser. Specifikt PPARy isoform impliceret i en lang række fysiologiske processer [2]: den integrerer styring af energi, lipid og glucosehomeostase og spiller en central rolle i adipogenese, inflammatorisk respons og differentiering af mange epitelceller [3]. Konsekvent, variationer i

PPARG

ekspression eller genmutationer er blevet forbundet med tumorigenese [4] – [6]. Imidlertid har modstridende resultater er hidtil rapporteret, hvilket rejser spørgsmålet om, hvorvidt PPARy letter eller undertrykker tumorigenese [7], [8]. For nylig har vi vist, at sporadiske kolorektal kræft (CRC’er) præsenterer reducerede PPARy-ekspressionsniveauerne er signifikant forbundet med patienternes dårligere prognose; i samme type af tumorer,

PPARG

har vist sig at være en uafhængig prognostisk faktor [9], [10], hvilket antyder muligheden for at målrette dette gen med lægemidler i kliniske anvendelser [10]. De molekylære mekanismer bag

PPARG

udtryk regulering i CRC progression er stadig ukendt [9].

Det bliver stadig mere klart, at der ud over genetiske ændringer, epigenetiske modifikationer bidrager til tumorigenese [11] . Epigenetisk regulering indebærer arvelige ændringer, der ikke ændrer DNA sekvenserne, men giver “ekstra” lag af kontrol til at regulere kromatin organisation og genekspression [12]. Aberrant DNA-methylering på CpG-rige sekvenser, også kendt som “CpG-øer”, som ligger i promotorregionerne af omkring halvdelen af ​​de kendte gener, fører til epigenetisk inaktivering af genekspression [11], [12]. I CRC, har omfattende DNA methylering blevet påvist på flere loci, specielt ved promotorområder af tumorsuppressorgener (GTS), en karakteristik af en undergruppe af tumorer præsenterer den såkaldte “CpG ø methylator fænotype” (CIMP) [13] . Andre epigenetiske begivenheder, såsom undertrykkende histon modifikationer, samarbejder om at etablere stabile gendæmpning. A “histon-kode” er blevet foreslået at tilvejebringe en underskrift på specifikke aminosyrerester, der korrelerer med aktiv eller undertrykt genekspression [11], [12]. Forbindelsen mellem DNA-methylering og histon modifikationer synes at være medieret af methyl CpG DNA-bindende proteiner, et medlem af hvilken MeCP2 spiller en vigtig rolle til at etablere denne interaktion [14]. DNA methylerede regioner, sædvanligvis beriget i modificerede histoner, generere et mere tæt pakket kromatin hvor adgangen af ​​specifikke transkriptionsfaktorer til deres beslægtede bindingssteder er stærkt svækket [12]. Sådan DNA-methylering og mønstret af histon modifikationer på promotorområder af specifikke gener er forbundet med kræft initiering og progression, især i sporadisk CRC, er endnu ikke klarlagt [15]. I denne rapport, analyserede vi et hundrede og halvtreds-to primære CRC’er og parret normal slimhinde for at korrelere

PPARG

udtryk variationer medieret af epigenetiske begivenheder med tumor progression og patienternes overlevelse. Vi har udvidet analysen til CRC afledte cellelinier som et system til at undersøge de molekylære mekanismer der ligger til grund

PPARG

silencing grund epigenetiske variationer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev foretaget i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board of Fatebenefratelli Hospital i Benevento. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver og efterfølgende analyse.

Tumor prøver

Et hundrede og halvtreds-to patienter diagnosticeret primær sporadisk CRC og kirurgisk behandlet ved Institut for Kirurgi, Fatebenefratelli Hospital, Benevento, Italien, mellem 1999-2004, blev undersøgt i denne undersøgelse. Fifty-to sager omfatter både flydende nitrogen snap-frosne prøver, opnået umiddelbart efter kirurgisk resektion, og paraffinblokke. Hver prøve blev matchet med den tilstødende tilsyneladende normal mucosa (ved 20 cm afstand fra tumormassen) fjernes under samme operation. Ingen af ​​patienterne havde en familiær historie med intestinal dysfunktion eller CRC, havde modtaget kemoterapi eller strålebehandling før resektion eller havde taget ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler på regelmæssig basis. Konventionelle postoperative behandlinger blev givet til alle patienter, afhængigt af alvorligheden af ​​sygdommen. De klinisk-patologiske træk ved de undersøgte patienter er rapporteret (tabel 1). Opfølgningen var til rådighed for alle patienter, med en median postoperativ varighed på 59,5 ± 26,5 måneder. Samlet længde af overlevelse blev beregnet fra den første operation. Patienterne blev prospektivt fulgte indtil døden eller deres seneste lægeundersøgelse.

cellelinjer og 5′-aza-2′-deoxycytidin og Trichostatin A behandling

Twelve CRC afledte cellelinjer var anvendt i denne undersøgelse, og blev opnået fra ATCC og dyrket som foreslået. For DNA demethylering blev celler behandlet med 1 eller 5 pM 5′-aza-2′-deoxycytidin (AZA) i 72 hs eller 300 nM Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) i 24 hs, alene eller i kombination. Efter behandlingerne blev celler høstet til DNA, RNA eller protein ekstraktion.

DNA ekstraktion, bisulfit behandling, analyse methylering og sekventering

Genomisk DNA blev isoleret fra frosne væv eller fra paraffinindlejrede prøver ved anvendelse af en standardprocedure [6], eller FFPE væv kit (56.404, Qiagen, Hilden, Tyskland), henholdsvis. Et pg af hver DNA-prøve blev bisulfit modificeret i overensstemmelse med producentens protokol (59.104, Qiagen, Hilden, Tyskland). Både universelt ikke-methylerede (59.665) og CpGenome universelt methyleret DNA (59.655, Qiagen, Hilden, Tyskland) blev anvendt i hver reaktion som methyleret eller methyleret kontrol hhv. Søgningen efter CpG-indhold i

PPARG

promotor blev udført ved hjælp af Methprimer softwaren ifølge CpG ø definition. PCR-primere for methylering specifik PCR (MS-PCR) blev konstrueret under anvendelse af Methyl Primer Express software v1. Både umethyleret (U) og methylerede (M) specifikke sæt af primere blev designet baseret på den positive streng af bisulfit-konverterede DNA dækker CpG øer i

PPARG

promoter region. MS-PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af MS-PCR-kittet (59305, Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. PCR-produkter blev fyldt på ikke-denaturerende 3% agarosegeler, farvet med ethidiumbromid, og visualiseret under en UV-transilluminator. Primersekvenser er anført (tabel S1). Bisulfit sekventering (BS) blev automatisk udført på PCR-amplifikation opnået ved anvendelse af en primer sæt uden indhold CpG sites inden deres sekvenser og designet på bisulfit modificerede DNA (Applied Biosystems, Applera, Foster City, USA).

chip og MeDIP assay

chip assays og Q-PCR-amplifikation (Biorad, Hercules, USA) blev udført som beskrevet [16]. De anvendte primere er beskrevet (tabel S1). MeDIP assay blev udført som anbefalet af leverandøren (Diagenode, Liège, Belgien). Antistoffer rejst mod: AcH3K9, H3K4me3, HDAC1 og MeCP2 (Abcam, Cambridge, UK), H3K27me3, (Millipore, Billerica, USA), RNA pol II og P-RNA pol II (Covance, Dallas, USA), ZAC og oprenset IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) blev anvendt i chip assays.

Western blot og immunhistokemisk analyse

Western blot-analyse blev udført på proteinekstrakter fra tumorvæv og tilstødende normale slimhinde udtages under kirurgi og CRC-cellelinier, som tidligere rapporteret [6], [9]. Immunohistokemisk analyse af tumorer og fjern ikke-neoplastisk mucosa blev udført som beskrevet [9]. Følgende antistoffer blev anvendt: anti-PPARy (E-8), anti-ZAC (H-253), anti-ERK 1/2 (MK1) og anti-p-ERK (E-4) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA); anti-E-cadherin (610.405) (BD Transduction Laboratories, Lexington, USA); anti-MeCP2 (ab55538), anti-HDAC1 (ab19845) (Abcam, Cambridge, UK); anti-EZH2 (4905) (Cell Signaling, Boston, USA); anti-β-actin (A5441) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

MTT og apoptoseassays

Celler blev podet i tre eksemplarer på 24 eller plader med 96 brønde og MTT-assay (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) blev udført ifølge fabrikantens protokol ved 0, 24, 48, 72 og 96 hs efter opnåelse konfluens, som angivet. Vækstkurverne blev sat op under hensyntagen til de gennemsnitlige resultater af tre uafhængige forsøg. For at analysere kemo-følsomhed over for PPARy-agonister celler blev behandlet med 5 pM troglitazon (TZD). Apoptose blev udført ved hjælp af flow cytometrisk analyse (FCA) ved anvendelse af propidiumiodid (PI) farvning. Kort fortalt, efter inkubering med TZD blev celler høstet og fikseret i 70% iskold ethanol /PBS og opbevaret ved 4 ° C natten over. De suspenderede celler blev derefter vasket med PBS, inkuberet i en PI opløsningen i 15 minutter. ved 37 ° C og straks analyseret med et FAC scan flowcytometer (Becton Dichinson, San Jose, USA).

Migration og invasion assays

I den sårhelende assay Celler blev udpladet i 60-mm-plader og dyrkes til konfluens. Efter en 6 hs lang serum sult, blev et sår lavet ved hjælp af en mikropipette tip til at skrabe cellerne. Cellemotilitet blev undersøgt efter 24 og 48 hs, efter celler fra forskellige mikroskopfelter. Endelig det tilsvarende sår området ved hvert tidspunkt var digitaliseret og kvantificeres ved hjælp Metamorph Imaging System Software version 6.0 til Microsoft Windows. En gennemsnitlig procentdel af sårlukning blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg. For at bestemme invasionsevne en transwell assay blev udført under anvendelse af en 24 brønd celledyrkningsinsert, 8 um pore (3097, Falcon-Becton Dickinson, USA). Efter hydratisering af matrigel i det øvre rum, Celler blev podet og inkuberet. Fireogtyve og otteogfyrre hs senere cellerne i den øvre overflade af filteret blev fjernet med en vatpind; dem nedenunder blev fikseret med 4% paraformaldehyd, farvet med 0,2% krystalviolet og talt. Kvantificering blev opnået ved at tælle mindst 10 lavere effekt felter fra tre uafhængige forsøg.

RNA-ekstraktion og semikvantitativ omvendt transkription-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra cellelinier og væv med Trizol med mindre modifikationer (Invitrogen Carlsbad, USA). Revers transkription-PCR (RT-PCR) blev fremstillet ved anvendelse af Super-script II (Invitrogen, Carlsbad, USA) og PCR-amplifikation under anvendelse af specifikke primere til

PPARG

. RT-PCR-betingelser og de anvendte primere er tidligere blevet beskrevet [5]. I alle PCR-reaktioner,

GAPDH

tjente som en intern kontrol for normalisering. De amplificerede produkter blev kørt på en 2% agarosegel og farvet med ethidiumbromid.

plasmider og transfektioner

PPRE-TK drevet luciferasereporterplasmid, pcDNA3 bærer vildtype

PPARG

cDNA og de transfektionsbetingelser er allerede blevet beskrevet [6]. Til gen-genaktivering assays blev celler podet i plader med 6 brønde, behandlet med AZA og TSA alene eller i kombination og transient transficeret med reporterplasmidet. Efter 12 hs, 1 uM TZD eller bæreren alene blev tilsat til mediet. Når angivet, GW9662, en selektiv PPARy antagonist, blev anvendt.

siRNA

En retroviral vektor PSM2C (klon ID VH2-203345), der bærer en kort hårnål DNA (shRNA, katalognummer RHS1764- 9494331) til målretning PPARy mRNA blev anvendt. HT29-celler blev stabilt transficeret med shRNA-PPARy-vektor og de positive kloner udvalgt ved anvendelse af 1 uM puromycin. En vektor, der bærer ikke-specifikke shRNAs eller en tom vektor blev anvendt som kontroller. Den siRNA designet til at målrette human MeCP2 mRNA (kode: HS-MECP2-7HP SI02664893, Qiagen, Hilden, Tyskland) blev venligst stillet til rådighed af Prof. Chiariotti. HCT116-celler blev podet i plader med 6 brønde og transient transficeret med MeCP2 siRNA eller ikke-specifikke oligoer, ifølge producentens anvisninger (Invitrogen, Carlsbad, USA). At lukke munden EZH2, en retroviral vektor PSM2C bærer et EZH2-shRNA (kode: RHS1764-9100483, CN: V2HS-63033) krypteret shRNAs eller en tom vektor, blev anvendt i henhold til producentens instruktioner (Invitrogen, Carlsbad, USA). I begge tilfælde blev celler høstet til Western blot-analyse 56 hs senere.

Tab af heterozygositet,

BRAF

KRAS

mutationer og mikrosatellit instabilitet analyse

Tab af heterozygositet (LOH) blev vurderet som tidligere beskrevet, ved hjælp af mikrosatellitmarkører D31259 og D3S3701, der flankerer

PPARG

[6]. Mikrosatelitter ustabilitet (MSI) blev udført som beskrevet [17].

MLH1

promotor methylering blev også vurderet på nogle repræsentative tumorprøver [18].

BRAF

KRAS

mutationer ved codon 600 i exon 15 og codon 12/13 i exon 2, henholdsvis blev evalueret ved PCR /sekventering og Real-Time PCR ved hjælp af primere tidligere beskrevne [18 ].

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført med SPSS (version 15.0) til Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). Association mellem

PPARG

promoter methylering, andre markører og klinisk-patologiske parametre blev vurderet ved hjælp af χ

2 testen eller Spearman rank test, som angivet. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere overlevelse; overlevelse forskelle blev analyseret med log-rank test. Data blev rapporteret som middelværdi ± SD, og ​​middelværdier blev sammenlignet ved anvendelse af Students t-test eller Mann-Whitney-test. Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikant, når en

P

≤0.05 blev opnået.

Resultater

PPARG

promotor methylering i CRC’er korrelerer med genekspression og er forbundet med patienternes resultat

for at vurdere den rolle, som

PPARG

spiller i kolorektal tumorigenese

in vivo

, vi analyserede 152 primære sporadiske CRC’er og matchede tilstødende ikke-neoplastisk slimhinde for

PPARG

udtryk (figur 1, panel A). Omkring 60% af tumorer viste

PPARG

overekspression og 5% af tilfældene viste ikke signifikante forskelle mellem tumorvæv og den matchede normale slimhinde. I modsætning hertil 35% af tumorerne udviste lavere PPARy niveauer end den normale slimhinde og en signifikant sammenhæng med fjerne metastaser og reducerede patienternes overlevelse, i overensstemmelse med vores tidligere data (Figur 1, panel B og C) [9]. Vi har allerede rapporteret, at reduceret

PPARG

udtryk i sporadisk CRC’er er ikke forbundet med LOH [6]. For således at bestemme, om

PPARG

reduceret ekspression er korreleret med DNA-methylering, undersøgte vi hele promotorregionen. Inspektion af den humane

PPARG

promotoren viste, at kerneregionen, fra -474 til +600 i forhold til transkriptionsstartsitet, er særligt beriget i “CpG-øer”, der kunne være mål for DNA-methylering (figur 1 , panel D). En kortere CpG-rige DNA-tarmkanalen placeret opstrøms (fra -793 til -580) har vist sig stabilt methyleret i Evaluering af epigenetiske risikofaktor associeret med den tidlige begyndelse af voksne metabolisk syndrom (figur 1, felt D) [19]. For at undersøge, om disse to regioner er differentielt methyleret i primære CRCs og parret normal slimhinde, udførte vi MS-PCR på fire promotor- segmenter (M1 til M4 startende fra mere nedstrøms) (figur 1, felt D). Segmenter M4 (fra-746 til -616) og M1 (fra -123 til +49) var altid methyleret eller umethyleret i normale og tumor prøver og var ikke korreleret med

PPARG

udtryk niveauer (Figur 1, panel E ). M2 (fra -235 til -151) var variabelt methyleret og endelig M3 (fra -359 til -260) blev methyleret i ca. 30% af tumorer sammenlignet med 8% af parrede normale slimhinder (n = 80) og korreleret med reduktion /tab af

PPARG

udtryk (figur 1, panel E og tabel 1). En nærmere inspektion af M3-segmentet identificeret 9 bindingssteder for CpG, methylering status blev analyseret ved bisulfit sekventering (figur 1, panel F). Den øer methylering niveau CpG var signifikant højere i

PPARG

ekskluderet end

PPARG

-positive tumorer og parrede normale slimhinder (figur 1, panel G). Konsekvent, M3 region methylering korreleret med patientens alder, dyb invasion, hertugens C og D stadier, mens ingen sammenhæng blev påvist med tumor placering (proksimal eller distal colon) og køn (figur 1, panel H og tabel 1).

PPARG

methylering blev observeret hyppigere i en undergruppe af mikrosatellit høj (MSI-H) end i mikrosatellit stabile (MSS) tumorer. Desuden blev disse sager ikke relateret til

KRAS

eller

BRAF

mutationer (Figur S1). Alle sammen disse resultater viser, at

PPARG

promotor methylering, specielt på M3-regionen, er signifikant korreleret med tumor progression og patienternes dårligt resultat (figur 1, panel I).

(A) halvtreds ug af total proteinekstrakter fra tumorvæv (T) og matchede ikke neoplastiske mucosa (N) blev analyseret ved Western blot. I panelet vises der kun nogle repræsentative prøver (fra 1 til 8). Histogrammet rapporterer kvantificeringen til p-actin, anvendt som intern kontrol. (B) Korrelation af

PPARG

ekspressionsniveauer i fravær = M0 eller tilstedeværelse = M1 af fjernmetastaser. (C) Kaplan Meier overlevelsesanalyse relateret til

PPARG

ekspressionsniveauerne.

P Drømmeholdet værdi er rapporteret i hver graf. (D) Skematisk struktur

PPARG

promotor og identifikation af CpG-berigede regioner omfattende transskriptionsstartstedet af det humane gen. MS-PCR regioner analyseres (M1-M4) og positionerne af anvendte primere er vist som rektangler. (E) repræsentant MS-PCR’er viser en korrelation mellem methylering af M3-regionen og reduceret

PPARG

ekspression i tumorvæv vs. matchet normal slimhinde, C + angiver methylerede (M) og umethylerede (U) kontroller. (F) M3 nukleotidsekvens fremgår; De CpG-øer er fremhævet. De kromatogrammer viser som CpG dinukleotid methyleres i nogle repræsentative prøver efter BS. Sorte eller hvide cirkler angiver de methylerede eller ikke-methylerede cytosiner hhv. (G) methylering niveauer opdaget af BS i tumor og normale mucosa prøver. M3-regionen methylering er relateret til tumor ‘stadie (Dukes fra A til D) (H) og patienternes overlevelse (I).

P Drømmeholdet værdi er rapporteret i hver graf.

PPARG

nedregulering i CRC-cellelinjer korrelerer med promotor methylering

For at undersøge den molekylære mekanisme (r) ligger til grund for dette forhold, vi søgte at bruge en

in vitro

cellekultur system. Vi screenede en række humane CRC cellelinjer (Tabel S2) til

PPARG

ekspressionsniveauerne og korreleret disse med mulige lyddæmpende begivenheder. PPARy-ekspression blev undersøgt ved mRNA og proteinniveauet ved RT-PCR og Western blot-analyse, henholdsvis (figur 2, panel A). PPARy-mRNA spejlet proteinniveauer med en bred vifte af variationer fra den højeste i HT29 til de laveste i HCT116-celler. De påviste blev tilskrevet transskription variationer forskelle; en nedsat proteinekspression ikke er relateret til mRNA niveauer blev kun observeret i Caco-2-celler, sandsynligvis på grund af post-translationel mekanisme (r). Blandt disse cellelinjer, valgte vi HT29 og HCT116 for yderligere undersøgelser. Vi fandt ikke tab af heterozygositet på

PPARG

locus i begge cellelinier. Ligeledes har vi ikke korrelere forskellige

PPARG

niveauet i HCT116 og HT29-celler med post-translationelle modifikationer forårsaget af en aktiv mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK /ERK) vej (figur S2) [6], [20]. For at undersøge om

PPARG

ekspression korrelerer med promotor-methylering i CRC cellelinier, udførte vi MS-PCR (figur 2, panel B). M4 og M1 segmenter stabilt methyleret eller ikke-methyleret i alle cellelinjer, uanset PPARy-ekspression. M2-segmentet blev methyleret i 5 ud af 8 cellelinier, herunder HCT116. Interessant nok blev M3-segmentet methyleret kun i HCT116 ud af de otte CRC cellelinier analyseret (figur 2, panel B). Ved at undersøge fire yderligere CRC cellelinjer, fandt vi, at også RKO-celler var negative for

PPARG

udtryk, skyldes afvigende methyleret M3 region (tabel S2 og data ikke vist). MeDIP analyser bekræftede disse resultater:

PPARG

promotor DNA (fra -368 til -166) var tre gange mere methylerede i HCT116 end i HT29-celler, hvilket indikerer en mere tæt pakket kromatin struktur (figur S2). 90% af de bindingssteder for CpG er indeholdt i M3-segmentet blev methyleret i HCT116, mens kun få eller ingen blev methyleret i andre cellelinjer som vurderet ved bisulfit sekventering (Figur 2, panel C). Disse resultater tyder på, at promotor methylering kunne spille en rolle i at lukke munden på

PPARG

udtryk i CRC cellelinjer analyseret.

(A)

PPARG

mRNA og protein niveauer påvist ved RT -PCR annonce Western blot-analyse i et panel af otte CRC cellelinier.

GAPDH

og β-actin blev anvendt som kontroller, hhv. (B) MS-PCR resultater opnået på M1-M4 promotorregioner analyserede; M, methyleret; U, ikke-methyleret; C + angiver methylerede og ikke-methylerede kontroller. status methylering af alle CRC cellelinjer analyseret er sammenfattet, med HCT116 og HT29-celler er afbildet grå. (C) CpG dinukleotider methylering blev vurderet ved BS. Resultaterne af nogle repræsentative cellelinier er rapporteret. Methylerede eller ikke-methylerede CpG-dinukleotider er afbildet som sorte eller hvide cirkler, henholdsvis. (D) Farmakologisk demethylering induceret

PPARG

ekspression i HCT116 mens ingen signifikant forskel blev fundet i HT29 celler, der anvendes som kontrol. Celler blev udsat for 1 og 5 uM AZA i 72 hs, MS-PCR blev udført på M2 og M3 regioner, før og efter behandling, **

P

. 0,01

PPARG

udtryk genaktiveres ved farmakologisk demethylering

For at kontrollere, om

PPARG

udtryk kan genaktiveres ved farmakologisk demethylering, vi behandlede HCT116 celler med AZA , en velkendt inhibitor af DNA-methylering. RT-PCR-analyse fra HCT116 udsat for 1 og 5 uM AZA viste en dosisafhængig forøgelse af PPARy mRNA henviser ikke viste signifikante variationer i HT29-celler, som forventet (figur 2, panel D). MS-PCR udført på M3-regionen, der methyleres kun i HCT116-celler, viste tab af methylering efter behandlingen; M2 region, der i basale betingelser er methyleret i begge cellelinier, fik demethyleres efter behandlingen (figur 2, panel D). Alle sammen viser disse data, at omfattende promotor methylering er forbundet med reduceret

PPARG

udtryk i CRC-cellelinjer.

Co-operative virkning af AZA og TSA på

PPARG

re- aktivering

at bestemte områder af

PPARG

promotor er forskelligt denatureret påpeger, at epigenetiske mekanisme (r) er involveret i sin dereguleret udtryk i CRC celler. For at verificere denne hypotese, vi behandlede HCT116 med AZA, alene eller i kombination med TSA, en kendt histondeacetylaseinhibitor (HDACi). HT29-celler blev anvendt som kontrol.

PPARG

ekspression blev synergistisk induceret af den kombinerede behandling med AZA og TSA i HCT116-celler, mens der ikke var påvirket i HT29-celler, når de blev anvendt enten alene eller i kombination (fig S3). Disse data indikerer, at chromatin-associerede histon enzymer kan bidrage til gene silencing. For at bestemme om re-aktiverede PPARy opfører sig som en

bona fide

funktionel transkriptionel faktor, behandlede vi HCT116 celler med AZA eller TSA alene eller i kombination og efterfølgende transficeres med en PPRE-drevet luciferase reportergen. Luciferaseaktivitet bestemt i celleekstrakter forøget ved AZA og /eller TSA behandling og, slående, endnu mere ved tilsætning af troglitazon, en specifik PPARy-ligand (figur S3). For at demonstrere, at stigningen i luciferaseaktivitet var virkelig afhængig af re-aktiveret receptor, vi udsatte de transficerede celler til PPARy-antagonist, GW9662. En væsentlig reduktion af reportergen-aktivitet blev observeret på grund af GW9662 evne til irreversibelt interferere med transaktiverende evne af det modne protein (figur S3). Alle sammen disse data viser, at DNA-promotor methylering og histon modifikationer sandsynligvis samarbejde at nedregulere

PPARG

udtryk, hvilket tyder på, at epigenetiske behandlinger genetablere gentranskription og aktivitet.

Specifik undertrykkende kromatin mærker og DNA methylering er forbundet med

PPARG

transskription

at give indsigt i mekanismen (er), hvorved DNA methylering og histon modifikationer påvirker

PPARG

udtryk, kvantitative chip assays blev udført undersøge promotoren segment strækker sig fra -368 til -166 i HCT116 celler. I overensstemmelse med MeDIP data HDAC1 blev tæt bundet til

PPARG

promotor, mens RNA-polymerase II (RNAPol-II) og dens phosphorylerede form (P-RNAPol-II) var knap til stede i ubehandlede HCT116 celler (figur 3, panel A). Ved udsættelse for AZA og TSA i kombination, blev HDAC1 bemærkelsesværdigt udtømt sammen med en reduceret DNA-methylering (figur S2), hvorimod RNAPol-II og P-RNAPol-II var stærkt forbedret, hvilket indikerer transkription udvinding (Figur 3, panel A). Følgelig trimethyleret H3K4 og acetyleret H3K9, der er histon modifikationer normalt er forbundet med transkriptionel aktivitet, blev næsten reduceret i ubehandlede HCT116 celler og forøget signifikant med TSA, AZA eller deres kombination (figur 3, panel B). Notatet trimethyleret H3K9, en markør for tavshed kromatin, blev beriget ved

PPARG

promotor og progressivt forarmet efter epigenetiske behandlinger, mens trimethyleret H3K27 var signifikant kun reduceret med AZA /TSA kombineret behandling (Figur 3, panel C). Denne analyse viser, at DNA-methylering er tæt forbundet med undertrykkende kromatin mærker på

PPARG

promotor at forringe genekspression i CRC celler.

(A) Kvantitativ chip analyse i HCT116 celler blev udført før og efter behandlingen med AZA og TSA alene eller i kombination. Native kromatin blev inkuberet med antistoffer rettet mod de angivne proteiner. Den immunopræcipiterede DNA blev brugt som skabelon i qPCR reaktioner ved hjælp af specifikke primere til

PPARG

promoter region *

P

0,05, **

P

0,01. (B) chip assays blev udført som beskrevet ovenfor mod acetyleret H3K9 og trimethyleret H3K4 *

P

0,05, **

P

0,01 eller (C) trimethyleret H3K9 og H3K27 *

P

0,05. De tidspunkter for co-behandlinger var 72 hs til 5 uM AZA og 24 hs til 300 nM TSA, alene eller i kombination; CC angiver ubehandlede kontrolceller. Resultaterne er middelværdierne ± SD af tre uafhængige forsøg, hver udført i to eksemplarer.

siRNA-medieret knock-down af MeCP2 og EZH2 redninger

PPARG

udtryk i HCT116 kolon kræftceller

forbindelsen mellem DNA-methylering og histon modifikationer synes at være medieret af en gruppe af proteiner med methyl DNA bindende aktivitet omfattende methyl CpG bindende protein 2 (MeCP2) [14]. Disse proteiner lokalisere til methylerede promotorområder og rekruttere proteinkomplekser indeholdende HDAC, især HDAC1, og histon methyltransferaser (HMTs). Enhancer af Zeste 2 (EZH2) er medlem af den Polycomb repressor komplekse 2 (PRC2) med histon methyl-transferase aktivitet ved bestemte H3K27 sites [21]. Både MeCP2 og EZH2 er blevet rapporteret at være involveret i

Pparg

undertrykkelse i muse stjerneformede celler undergår lever fibrogenese [22]. *

P

0,05. **

P

0,01.