PLoS ONE: Mimulone-induceret Autophagy gennem p53-medieret AMPK /mTOR Pathway Øger Caspase-medieret apoptotisk celledød i A549 Menneskelig Lung Cancer Cells

Abstrakt

Anticancer egenskaber og mekanismer mimulone (MML),

C

-geranylflavonoid isoleret fra

kejsertræ

frugter, blev først belyst i denne undersøgelse. MML forhindret celleproliferation på en dosis- og tidsafhængig måde og udløste apoptose gennem ydre vej i A549 humane lunge adenocarcinom-celler. Endvidere MML-behandlede celler viste autophagic funktioner, såsom dannelsen af ​​autophagic vakuoler, en primær morfologisk træk ved autofagi, og akkumuleringen af ​​mikrotubulus-associeret protein 1 lette kæde 3 (LC3) puncta, andet typisk producent af autofagi, som bestemt ved FITC-konjugeret immunfarvning og monodansylcadaverin (MDC) farvning hhv. Ekspressionsniveauerne af LC3-I og LC3-II, specifikke markører for autophagy, blev også forøget med MML behandling. Autophagy inhibering med 3-methyladenin (3-MA), farmakologisk autophagy inhibitor og shRNA knockdown af Beclin-1 reducerede apoptotisk celledød induceret af MML. Autophagic flux blev ikke signifikant påvirket af MML behandling og lysosomale inhibitor, chloroquin (CQ) undertrykte MML-induceret autophagy og apoptose. MML-induceret autophagy blev fremmet af fald i p53 og p-mTOR niveauer og forøgelse af p-AMPK. Endvidere inhibering af p53 transaktivering med pifithrin-α (PFT-α) og knockdown af p53 forøget induktion af autofagi og endelig fremmes apoptotisk celledød. Samlet set viser resultaterne, at autofagi bidrager til cytotoksiciteten af ​​MML i cancerceller, der huser vildtype p53. Denne undersøgelse tyder på, at MML er en potentiel kandidat til en anticancermiddel målrettet både autofagi og apoptotisk celledød i menneskelig lungekræft. Desuden ville co-behandling af MML og p53-inhibitor være mere effektiv i human lungecancer terapi

Henvisning:. En H-K, Kim K-S, Lee J-W, Park M-H, Moon H-I, Park S-J, et al. (2014) Mimulone-induceret Autophagy gennem p53-medieret AMPK /mTOR Pathway Øger Caspase-medieret apoptotisk celledød i A549 Menneskelig Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (12): e114607. doi: 10,1371 /journal.pone.0114607

Redaktør: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, USA

Modtaget: Juli 2, 2014 Accepteret: November 10, 2014; Udgivet: 9. december 2014

Copyright: © 2014 An et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Dong-A University forskningsfond. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den mest udbredte ondartet svulst, der repræsenterer en af ​​de førende årsager til den globale cancerassocieret død og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) opfanger næsten 85% af alle lungekræfttilfælde [1], [ ,,,0],2]. Trods betydelige fremskridt i lungekræft behandling, herunder kirurgi, strålebehandling og kemoterapi, er prognosen for patienter med lungekræft er stadig fattige, med mindre end 15% af den samlede 5-års overlevelse [1]. Især, kemoterapi under anvendelse platinforbindelser eller platinbaserede kombinationer er den hyppigst anvendte lungekræft terapi og anses for at være den optimale behandling hos patienter med fremskredent NSCLC [2], [3]. Imidlertid er effektiviteten af ​​kemoterapi i patienter med fremskreden lungecancer yderst begrænset på grund af lægemiddelresistens og toksiske bivirkninger af lægemidler [2], [3]. Det er således afgørende at udvikle mindre giftige og mere effektive kemoterapeutiske midler til behandling af avancerede lungekræftpatienter.

I de senere år har plante-afledte naturlige produkter modtaget omfattende opmærksomhed som hovedkilder til nye lægemidler til at reducere kemo- associerede bivirkninger, og de udøver deres anticancer effekter ved at udløse apoptose og autofagi [4] – [7]. Nylige undersøgelser har vist, at flere plantebaserede naturlige produkter, herunder plumbagin [8], glossogin [9], curcumin [10], celastrol [11], isolinderalactone [12], glycyrrhizin [13], polydatin [14], 6- shogaol [15], glycyrrhetinsyre [16] og embelin [17], inducere apoptose gennem den iboende og /eller ydre vej og aktivering af p38 /JNK i humane lungecancerceller. Desuden 6-shogaol forårsagede celledød gennem autophagy induktion ved inhibering af AKT /mTOR pathway i humane NSCLC A549-celler [18] og paclitaxel og feroniellin A udøvede deres cytotoksiske virkninger ved at inducere både autofagi og apoptose i human lunge cancer A549-celler [19], [20].

kejsertræ

Steud. (Scrophulariaceae) er løvfældende træ fordelt over hele Kina, Korea og Japan [21] og uddrag fra

P

.

tomentosa

er blevet anvendt til at lindre bronkitis, astmatisk angreb og slim i traditionel kinesisk medicin [22]. Tidligere undersøgelser viste, at

C

-geranylated flavonoider, de vigtigste bioaktive bestanddele af

P. tomentosa

, har neurobeskyttende virkninger, antiradikal og antibakterielle aktiviteter [23] – [26]. Desuden

C

-geranylated flavanoner fra

kejsertræ

frugter udstillet stærk cytotoksisk aktivitet i forskellige humane cancer cellelinjer [27], [28]. Det har også været nylig rapporteret, at geranylated flavanon tomentodiplacone B direkte inhiberer celleproliferation ved nedregulering af cyclin-afhængig kinase 2-aktivitet, hvilket fører til G1-fasen akkumulering i THP-1 humane monocytiske leukæmiceller [29]. Imidlertid er den underliggende mekanisme er ansvarlig for antitumoraktiviteten af ​​geranylated flavonoider ikke godt belyst.

Vi har for nylig isoleret af en forbindelse, der tilhører

C

-geranylated flavonoider, mimulone (MML) fra

kejsertræ

frugter. I den foreliggende undersøgelse, vi først undersøgt anticancer effekter af MML på humane lunge kræftceller og også præciseret sin virkningsmekanisme. Vi demonstrerer her, at MML udløser autofagi forud apoptose i humane NSCLC A549 celler, og autophagy hæmning nedsætter apoptose i MML-behandlede celler.

Materialer og metoder

Materialer

monodansylcadaverin ( MDC), 4 ‘, 3-methyladenin (3-MA), chloroquin (CQ), forbindelse C (forbindelse C) og 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO , USA). Z-VAD-FMK (pan-caspaseinhibitor), Z-DEVD-FMK (caspase-3-inhibitor), Z-IETD-FMK (caspase-8 inhibitor) og Z-LEHD-FMK (caspase-9-inhibitor) blev opnået fra Calbiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA, USA). 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), DAPI, puromycin-dihydrochlorid og chloroquin (CQ) blev opløst i dH

2O. 3-MA (100 mM), poly-L-lysin (0,1%) og polybren (20 mg /ml) opløst i phosphatbufret saltvand (PBS). Pifithrin-α (PFT-α), forbindelse C (forbindelse C) og MDC blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO). Antistoffer for ATG7, Beclin-1, LC3, caspase-3, caspase-8, caspase-9, Bid, p-p38, p38, p-AMPK-α, AMPK-α, p-ACC, ACC, p-mTOR, mTOR blev opnået fra Cell Signaling Technology (Dancers, Mass, USA); antistoffer for PARP-1/2, p53 (DO-1), p-ERK og ERK blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); antistof til P62 /SQSTM1 blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA); antistof til glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev opnået fra Millipore (Milford, MA, USA); Peberrod peroxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer blev købt fra cellesignalering Technology (dansere, Mass, USA) og Enzo Life Science (Farmingdale, NY, USA), henholdsvis; Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret sekundært antistof blev opnået fra Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit og BCA proteinassay-kit blev indkøbt fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA) og Thermo (Rockford, IL, USA), hhv. MML (fig. 1A) isoleret fra

P. tomentosa Salg frugter blev fremstillet som beskrevet i tidligere rapport [25], opløst i DMSO ved 40 mM for koncentration af stamopløsning og opbevaret ved -20 ° C.

(A) Molekylær struktur mimulone. Forskellige humane cancerceller, ikke-småcellet lungekræft A549 (B), brystcancer MCF7 (C), coloncancer HCT116 (D) og osteosarkom U2OS (E) celler blev behandlet med MML som viste koncentrationer (0-80 uM) i 12 timer eller 24 timer og derefter cellelevedygtigheden blev målt ved MTT-assayet. Søjlediagrammer angive den procentdel af levedygtighed. (F) A549-celler blev behandlet med den MML ved forskellige koncentrationer (0-80 uM) i 24 timer og levedygtige celler blev talt ved trypanblåt-farvning. Levende celler (ikke-farvede celler) blev beregnet ved anvendelse af hæmocytometer og søjlediagram viser procentdelen af ​​levedygtige celler. Alle data blev udtrykt som middel ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05 og ** p. 0,01 sammenlignet med kontrol

Cellekulturer

Menneskelig ikke-småcellet lungekræft A549, humant brystadenocarcinom MCF-7, menneskelige kolorektal carcinom HCT116 og humane osteosarcom U2OS cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; WelGENE Co, Daegu, Korea) indeholdende 10% (vol /vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS) og 1% PSA (WelGENE Co, Daegu, Korea) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 i luft.

cellelevedygtighed

til analyse af cellelevedygtighed, MTT-assay blev udført ved en fremgangsmåde svarende til den beskrevet tidligere [30]. Kort beskrevet blev celler podet i 24-brønds plade (5 x 10

4 celler /brønd) og dyrket i 24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med MML ved forskellige koncentrationer (0-80 uM) i 24 timer eller behandlet med 60 pM af MML for forskellige tidsforløb (0-24 h). Efter MML behandling blev celler inkuberet med medium /MTT (0,5 mg /ml) blanding i 3 timer. DMSO blev tilsat for at opløse den reducerede formazan krystal fra MTT og absorbansen blev aflæst ved 540 nm ved anvendelse af ELISA-pladelæser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). For at bekræfte virkningen af ​​MML på celleproliferation blev levende celler talt ved trypanblåt-farvning i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt blev A549-celler udpladet i 12-brønds plade og behandlet med MML som angivne koncentrationer i 24 timer. Efter behandling blev cellerne høstet under anvendelse af trypsin-EDTA (WelGENE Co, Daegu, Korea) og farvet med 0,4% trypanblåt-opløsning (Gibco, Carlsbad, CA). Levende celler blev talt ved hæmocytometer. Cellelevedygtighed blev vist i forhold til kontrollen.

Protein ekstraktion og western blot-analyse

helcelle-proteinekstrakter fra A549-celler blev fremstillet med en RIPA-buffer (Pierce, Rockford, IL, USA) indeholdende proteasehæmmer mix (GE Healthcare, Piscataway, USA) og phosphatase inhibitor cocktail (Thermo, Rockford, IL, USA). Proteiner fra hel-cellelysater blev kvantificeret under anvendelse af BCA-proteinassay-kit ifølge producentens instruktioner. Western blot-analyse blev udført som tidligere [30] beskrevne. Forøget kemiluminescens (ECL) detektionssystem (Amersham Bioscience, NJ, USA) blev anvendt til at detektere signalet og signalintensitet af detekterede proteinbånd blev målt ved anvendelse Scion Billede Instrument (Scion Co, Frederick, MD, USA). Lige belastning blev vurderet ved GAPDH som interne kontroller til Western blotting.

Immuncytokemi

Immunofluorescens farvning blev udført af en lignende fremgangsmåde som beskrevet tidligere [30]. Kort fortalt A549-celler blev dyrket på sterile dækglas og behandlet med MML i 24 timer, og derefter fikseret med 3% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved 37 ° C. Dernæst blev permeabilisering trin udføres med afkølet methanol (100%) i 10 minutter ved -20 ° C og derefter celler blev efterfølgende inkuberet i en blokeringsopløsning indeholdende 5% bovint serumalbumin (BSA) og 1% Triton-X 100 for 1 timer ved 37 ° C. Celler blev derefter inkuberet med det LC3 antistof i 12 timer ved 4 ° C efterfulgt af FITC-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved 37 ° C. Kerner blev farvet med DAPI (1 ug /ml) i 10 minutter ved 37 ° C. Fluorescens billeder blev taget til fange af LSM 700 konfokal laser scanning mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

MDC farvning

MDC farvning blev også udført af en lignende fremgangsmåde som tidligere beskrevet [30 ]. Celler blev fikseret med 3% PFA i 10 minutter ved 37 ° C, og derefter inkuberet med 50 pM monodansylcadaverin (MDC), en autofluorescerende forbindelse som mærker autophagic vakuoler ved 37 ° C i 10 min. Fluorescerende billeder blev taget til fange af Olympus BX51 fluorescens mikroskop (Center Valley, PA, USA).

Annexin V og PI farvning

Celler blev behandlet med så angivne koncentrationer af MML og /eller hæmmere (caspase inhibitorer, 3-MA, PFT-α) i 24 timer, og høstet ved anvendelse af trypsin-EDTA. Efter farvning med FITC-konjugeret Annexin V og propidiumiodid (PI) blev apoptotiske celler målt ved anvendelse af Beckman-Coulter Cytomics FC500 flowcytometer (Beckman-Coulter, Miami, FL, USA).

RNA-interferens

pLKO.1 lentiviral ekspressionsplasmid indeholdende shRNA mod Beclin-1 (TRCN0000033552) og p53 (TRCN0000003753), (Beclin-1; 5′-CCGGCTCAAGTTCATGCTGACGAATCTCGAGATTCGTCAGCATGAACTTGAGTTTTTG-3 ‘, p53; 5′-CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTT-3’) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Mission shRNA). Viruspartikler blev dannet i 294T ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev celler transficeret med pLKO.1 shBeclin-1, VSVG og Gag vektorer. Viral suppe blev derefter injiceret til A549-celle og inkuberet i 12 timer. Virusinficerede A549-celler blev selekteret ved puromycin-dihydrochlorid behandling og selekterede celler blev anvendt til eksperimenter. pLKO.1 shRNA kontrol vektor (Mission shRNA, SHC002) anvendes som kontrol.

Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middelværdi ± SEM af tre uafhængige forsøg i hver gruppe. Forskellene mellem hver gruppe blev evalueret med Students

t

-test og * p 0,05 blev anset for at vise statistisk signifikans

Resultater

Effekt af MML på celle levedygtighed. forskellige human cancer cellelinjer

for at vurdere virkningerne af MML på cellevækst af forskellige menneskelige kræftceller, menneskelig lungekræft A549 (fig. 1B), human brystcancer MCF-7 (fig. 1C), humane coloncancer HCT116 (fig. 1D) og human osteosarkom U2OS (fig. 1E) -celler blev behandlet med MML ved forskellige koncentrationer i 12 timer eller 24 timer og derefter fulgt af MTT-assays. MTT-assay Resultaterne viste, at MML behandling signifikant inhiberede celleproliferation på en dosis- og tidsafhængig måde i disse cancercellelinier. For yderligere at kontrollere effekten af ​​MML på celleproliferation af A549-celler, blev celler behandlet med MML ved forskellige koncentrationer i 24 timer og derefter underkastet trypanblå-farvning. Resultatet afslørede en signifikant inhibering af celleproliferation med MML behandling i en dosisafhængig måde (fig. 1F).

MML udløser caspase-afhængig apoptose i A549-celler

For at bestemme om MML- induceret cytotoksicitet i A549-celler skyldtes apoptose, efter MML behandling ved forskellige koncentrationer i 24 timer eller 60 uM MML behandling i forskellige tidsperioder, apoptotisk befolkning blev analyseret ved Annexin V /PI dobbelt farvning. Annexin V /PI-positive celler blev markant forøget på en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 2A-C), der angiver den apoptotiske virkning af MML på A549-celler. Flowcytometrisk analyse viste også, at MML behandling forøget akkumulering af celler ved den apoptotiske sub-G1-fasen på en dosis-afhængig måde. Antallet af celler ved G2 /M-fase steg også på en dosis-afhængig måde (S1 figur). For yderligere at bekræfte virkningen af ​​MML på induktionen af ​​apoptose i A549-celler, blev caspase-3-aktivering og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning undersøgt ved immunoblotting med deres antistoffer. Caspase-3, et centralt bøddel i den apoptotiske maskineri, spalter mange proteiner uundværlige for celleoverlevelse og aktiveres via spaltning i to fragmenter (17 kDa og 19 kDa) ved caspase-8 og /eller caspase-9 under apoptose [31], [32]. Aktiverede caspase-3 efterfølgende spalter cellulære proteiner, herunder PARP, hvilket fører til apoptotisk celledød. PARP spiller en afgørende rolle i at opretholde genomisk integritet og er den største protein, der skal proteolyseres af caspase-3 under apoptose [32]. Som vist i fig. 2D, caspase-3 og PARP spaltninger blev tydeligt forøget efter 60 uM MML behandling i 24 timer, hvilket indikerer, at MML apoptose gennem caspase-3-aktivering og PARP-spaltning i A549-celler. Caspase-8 og caspase-9 spiller afgørende roller i induktion af apoptose ved dødsfaldet receptor-medieret (extrinsic) og mitochondriale (iboende) baner henholdsvis [31], [32]. Spaltningen af ​​bud er nødvendig for krydstale mellem de ydre og indre veje [31], [32]. At optrævle den vej, ad hvilken MML inducerer apoptose i A549-celler, blev proteinindhold caspase-8 og caspase-9 analyseret ved immunoblotanalyse. Som vist i fig. 2D, MML behandling øget de spaltede former (18 kDa og 43 kDa) af caspase-8, men det gjorde ikke udløse caspase-9 og Bud spaltninger, hvilket indikerer, at MML inducerede aktivering af caspase-8 i A549 celler. For yderligere at bekræfte, om MML-induceret apoptose blev caspase-afhængig, blev procentdelen af ​​apoptotiske celler kontrolleret af Annexin V-PI dobbelt farvning efter en 24-h behandling med forskellige caspaseinhibitorer såsom Z-VAD-FMK (pan-caspaseinhibitor ), Z-DEVD-FMK (caspase-3-inhibitor), Z-IETD-FMK (caspase-8 inhibitor) og Z-LEHD-FMK (caspase-9-inhibitor). Som vist i fig. 2E, afslørede flowcytometrianalyse at MML-induceret apoptose blev reddet af pan-caspaseinhibitor, caspase-3 og caspase-8-inhibitorer sammenlignet med MML behandling alene, men ikke af caspase-9-inhibitor. Et lignende resultat blev også opnået fra MTT-assayet (fig. 2F). Taget sammen antyder disse resultater, at MML-induceret apoptose er primært drevet af ydre vej frem indre vej.

(A) A549-celler blev behandlet med den MML som viste koncentrationer (0-60 uM) i 24 timer og derefter farvet med FITC- konjugeret Annexin V og PI. Apoptotiske celler blev målt ved flowcytometer. (B) A549-celler blev behandlet med 60 pM af MML for en tidsafhængig måde. Apoptotiske celler blev derefter farvet med Annexin V og PI og påvist under anvendelse af flowcytometer. (C) Søjlediagram viser procentdelen af ​​apoptotiske celler (dosisafhængig måde; top, tidsafhængig måde; nederst). Apoptotisk befolkning blev evalueret ved Annexin V positiv, PI negativ (AV + /PI-, hvid bar) og Annexin V og PI dobbelt positive (AV + /PI +, sort bjælke) apoptotiske celler. (D) Celler blev behandlet med MML som viste koncentrationer (0-60 uM) i 24 timer og Western blot-analyse blev udført for at kontrollere apoptose markering, caspase-3, -8, -9, Bid og PARP-1/2, henholdsvis. GAPDH blev anvendt som ladningskontrol af Western blot analyse. (E) Celler blev forbehandlet med eller uden hver caspase inhibitor, Z-VAD-FMK (30 uM), Z-DEVD-FMK (30 uM), Z-IETD-FMK (30 uM) og Z-LEHD-FMK (30 uM) i 1 time og derefter behandlet med MML (60 uM) i 24 timer. Apoptotiske celler blev farvet med Annexin V og PI og derefter populationer blev detekteret ved flowcytometer. (F) Celler blev behandlet med caspaseinhibitorer og MML under de samme betingelser som flowcytometrisk analyse og derefter cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assayet. Søjlediagrammer angive den procentdel af cellernes levedygtighed (øverst) og procentdelen af ​​apoptotiske celler (nederst), hhv. Apoptotisk befolkning blev evalueret ved Annexin V positiv, PI negativ (AV + /PI-, hvid bar) og Annexin V og PI dobbelt positive (AV + /PI +, sort bjælke) apoptotiske celler. Alle data blev udtrykt som middel ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05 og ** p 0,01 sammenlignet med kontrol;

# p. 0,05 sammenlignet med MML-behandlede gruppe

MML udløser autofagi i A549 celler

Plant-afledte naturlige forbindelser er kendt for at udøve deres anticancer effekter ved at inducere autofagi i humane cancerceller [7]. Autophagy er en katabolisk proces danner dobbelt-membran vesikler, betegnet autophagosomes [33]. For at undersøge om MML udløser autofagi i A549 celler, blev de morfologiske ændringer efter MML behandling kontrolleret. Som vist i fig. 3A, omfattende cytoplasma vakuolisering og formationer af autophagosome-lignende vakuoler i MML-behandlede A549-celler blev observeret under fasekontrastmikroskopi. At bekræfte autophagy induktion af MML, MDC-farvning og mikrotubulus-associeret protein 1 lette kæde 3 (LC3) immunfarvning under anvendelse af fluorescerende antistoffer til LC3 blev udført. MDC og LC3 er kendt som specifikke markører for autophagic vakuoler og autophagosomes henholdsvis og puncta dannelse af LC3 i autophagosome kan observeres ved konfokal mikroskopi, som anvendes bredt som pålidelig metode kan detektere autofagi [33]. Som vist i fig. 3A, viste MML-ubehandlede kontrol celler diffust MDC-farvning, mens MML-behandlede A549 celler resulterede i en stigning i fluorescensintensitet indikerer omfattende MDC-positive autophagic vakuoler. Endvidere blev forøget subcellulær lokalisering af punktformig LC3 også påvist i MML-behandlede A549-celler sammenlignet med ubehandlede kontrolceller og LC3 puncta-dannelse blev forøget i en tidsafhængig måde (fig. 3B). For yderligere at konstatere autophagosome dannelse i MML-behandlede celler, ændringerne i de tre store Autophagy-relaterede markører, LC3-II, Beclin-1 og ATG7, blev analyseret ved immunblotting. ATG7 og LC3-II proteinniveauer blev bemærkelsesværdigt forøget i en dosisafhængig måde ved MML behandling, men Beclin-1-niveau var lidt augmented (fig. 3C). Tilsammen udgør disse data viser afgjort, at MML inducerer autophagosome dannelse i A549 celler.

(A) A549 celler blev behandlet med 60 pM af MML i 24 timer og derefter morfologiske billeder blev taget til fange af fasekontrast mikroskop (400 ×, PC). Pile angiver de endogene autophagosome-lignende vakuoler (venstre) og søjlediagram angiver antallet af vakuoler per celle. Celler blev behandlet med MML (60 uM, 24 timer), og derefter blev cellerne farvet med MDC og LC3 antistof hhv. MDC (lyse farver, midten) billeder blev taget til fange af fluorescens mikroskop og LC3 (grøn, højre) fluorescerende billeder blev opdaget ved konfokal mikroskop (bar, 10 um). Søjlediagram angiver fluorescensintensiteten af ​​LC3 FITC. (B) Celler blev behandlet med MML (60 uM) i forskellige tidsrum (0-24 timer) og LC3 immunfluorescensfarvning blev udført for at detektere autophagosomes. Kerner blev farvet med DAPI. Billeder blev taget med konfokalmikroskop (bar, 10 um). (C) A549-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af MML (0-60 uM) i 24 timer. Western blot-analyse blev derefter udført med antistoffer mod ATG7, Beclin-1 og LC3, hhv. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. Bar graf indikerer densitometrianalyse af LC3-II /GAPDH-forholdet. A549-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af MML (0-60 uM) i 24 timer (D) eller 60 uM MML for forskellige tidsforløb (E) og derefter immunoblotanalyse blev udført under anvendelse af antistoffer mod p62 og LC3, hhv. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (F) A549-celler blev præinkuberet med eller uden chloroquin (CQ, 25 uM) i 1 time, derefter behandlet med MML (60 uM) i 24 timer. Western blot-analyse blev udført under anvendelse af antistoffer som anført ovenfor. GAPDH blev anvendt som ladningskontrol af Western blotting. Alle data blev udtrykt som middel ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05 og ** p. 0,01 sammenlignet med kontrol

Det er kendt, at autophagosomes også akkumulere når autophagic flux angiver hele processen med autofagi er ineffektiv [35], [46]. At vurdere, om MML påvirker autophagic flux i A549-celler, blev niveauet af p62-protein, som bruges til at overvåge autophagic flux [35], [46] kontrolleres ved immunoblotting med antistoffet. Som vist i fig. 3D og 3E, blev p62 niveauet markant reduceret med MML behandling på en dosis- og tidsafhængig måde. Endvidere at vurdere virkningerne af MML på autophagic vesikel omsætning blev proteinniveauer af P62 og LC3 II kontrolleres ved immunoblotting efter en 24-h behandling med chloroquin (CQ), kaldet lysosomal nedbrydning inhibitor. Som vist i fig. 3F, forbehandling med CK steget markant niveauerne af P62 og LC3 II sammenlignet med MML behandling alene. Disse resultater tyder klart, at MML behandling ikke forstyrre autophagic vesikel omsætning. Kollektivt, disse resultater sikkert viser, at MML induceret autophagy uden forringelse af autophagic flux i A549 celler.

Hæmning af autophagy ved autophagy hæmmer eller knockdown af Beclin-1 undertrykker MML-medieret apoptotisk celledød

det er for nylig blevet dokumenteret, at autophagy inhibering med en specifik autophagy inhibitor, såsom 3-methyladenin (3-MA), kan fremme apoptose i humane cancerceller [35] – [38]. Således har vi undersøgt virkningen af ​​3-MA på dannelsen af ​​LC3 puncta og autophagic vakuoler i MML-behandlede A549-celler. Den punktformige LC3 fordeling og dannelse af MDC-positive autophagosomes i MML-inducerede celler blev mærkbart undertrykt af 3-MA behandling (fig. 4A). Derudover co-behandling med MML og 3-MA signifikant inhiberede ikke kun LC3-II akkumulering, men også caspase-3 og PARP spaltninger (fig. 4B). Derefter kontrolleres vi effekten af ​​3-MA på apoptoseinduktion under anvendelse Annexin V /PI dobbelt farvning. Annexin V /PI-positive celler blev markant nedsat i celler co-behandlet med MML og 3-MA, sammenlignet med dem behandlet med MML alene (fig. 4C). Lignende resultater blev opnået ved co-behandling af MML med CK (fig. 4D). Disse resultater naturligvis afsløre, at autophagy inhibering med 3-MA og CQ kunne undertrykke MML-induceret apoptose i A549-celler.

(A) A549-celler blev præinkuberet med eller uden 3-MA (10 mM) i 3 h og derefter inkuberet med MML (60 uM) i 24 timer. Celler blev farvet med MDC (lys farve) eller LC3 (grøn) antistof hhv. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Fluorescerende billeder blev opnået under anvendelse af konfokal mikroskop (bar; 10 um). (B) Celler blev forbehandlet med eller uden 3-MA i 3 timer før behandling af MML (60 uM) i 24 timer. Western blot-analyse blev udført med antistoffer mod LC3, PARP-1/2 og caspase-3. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. Søjlediagrammer angiver forholdet mellem spaltede caspase-3 /GAPDH og LC3-II /GAPDH hhv. (C) A549-celler blev forbehandlet 3 timer med eller uden 3-MA og behandlet med MML (60 uM) i 24 timer og celler blev farvet med FITC-konjugeret Annexin V /PI og derefter målt ved FACS. Søjlediagram viser procentdelen af ​​apoptotiske celler. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev evalueret ved Annexin V positiv og PI negativ (AV + /PI-, hvid bar) og Annexin V og PI dobbelt positive (AV + /PI +, sort bjælke) apoptotiske celler. (D) Celler blev forbehandlet med eller uden CQ i 1 time og derefter inkuberet med MML i 24 timer. Immunoblotting-analyse blev udført under anvendelse af antistoffer som indikeret før. Celler blev behandlet med CK og MML under de samme betingelser som nævnt før og derefter cellelevedygtigheden blev vurderet ved MTT-assay (nederst). Søjlediagram angiver den procentdel af cellelevedygtighed. Alle data blev udtrykt som middel ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05 og ** p 0,01 sammenlignet med kontrol;

# p. 0,05 sammenlignet med MML-behandlede gruppe

Mere specifik hæmning af autophagy vej kan opnås ved knockout eller knockdown af autofagi-relaterede (

ATG

) gener og

Beclin-1

gen. For yderligere at bekræfte, om autophagy kan regulere apoptose, Beclin-1, en kritisk regulator af autophagy, blev slået ned med lille hårnål RNA (shRNA) og derefter ændringer af endogene autophagosomes blev kontrolleret af LC3 immunfarvning. Som vist i fig. 5A er endogen LC3 fordeling markant nedsat i MML-behandlede Beclin-1 Knockdown celler (shBeclin-1) sammenlignet med MML-behandlede shControl celler. Som vist i fig. 5B, knockdown af

Beclin-1

genet markant undertrykt Beclin-1-protein-ekspression og akkumulering af LC3-II i forhold til shControl. I overensstemmelse med resultaterne under anvendelse af 3-MA og CQ, caspase-3 og PARP spaltninger blev også signifikant inhiberet af undertrykkelse af autophagy gennem knockdown af

Beclin-1

genet. MTT-assay resultat viste også, at den cytotoksiske virkning af MML var signifikant reduceret med knockdown af

Beclin-1

genet (fig. 5C). Tilsammen disse resultater viser tydeligt, at autophagy hæmning af 3-MA og CQ eller Beclin-1 knockdown forhindrede MML-induceret apoptose i A549 celler.

(A) Kontrol og Beclin-1 Knockdown celler blev behandlet med MML (60 uM) i 24 timer og derefter LC3 immunfluorescensfarvning blev udført til påvisning autophagosomes. Kerner blev farvet med DAPI. Billeder blev fanget af konfokalt mikroskop (bar; 10 um). (B) Knockdown celler (shControl, shBeclin-1) blev behandlet med MML (60 uM) i 24 timer. Western blot-analyse blev udført med antistoffer mod Beclin-1, LC3, PARP-1/2 og caspase-3. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. Søjlediagrammer angiver forholdet mellem LC3-II /GAPDH og spaltes caspase-3 /GAPDH hhv. (C) Kontrol og Beclin-1 Knockdown celler blev behandlet med MML (60 uM) i 24 timer og derefter cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assayet. Søjlediagram repræsenterer procentdelen af ​​cellelevedygtighed. Alle data blev udtrykt som middel ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05 og ** p 0,01 sammenlignet med kontrol;

# p. 0,05 sammenlignet med MML-behandlede gruppe

MML inducerer autophagy gennem fald i p53 niveauer

Det er for nylig blevet rapporteret, at p53 spiller en afgørende rolle i regulering af autophagy [39] – [41]. For at undersøge om p53 er involveret i MML-medieret autophagy dermed niveauerne af p53 og LC3-II-protein blev undersøgt ved immunoblotting. Som vist i fig. 6A, MML behandling bemærkelsesværdigt reduceret p53-niveauer sammenlignet med ubehandlede kontrolceller, men steg LC3-II niveauerne. Desuden blev caspase-3 og PARP spaltninger også forøget med MML behandling. Desuden blev LC3-II niveauer og spaltede caspase-3 og PARP niveauer steget betydeligt i celler co-behandlet med MML og pifithrin-α (PFT-α), en farmakologisk p53-inhibitor, sammenlignet med dem behandlet med MML eller PFT-α alene . Disse resultater viser tydeligt, at reduktionen i p53 niveauer ved MML kunne øge induktion af autofagi og apoptose i A549 celler, der huser vildtype p53. For yderligere at bekræfte rolle af p53 i MML-induceret autophagy blev autophagosomes undersøgt ved LC3 immunfarvning. Som vist i fig. 6B, en betydelig akkumulering af LC3 puncta blev observeret i celler co-behandlet med MML og PFT-α, hvilket indikerer augment af autophagy induktion af p53 tab. Derudover er procentdelen af ​​Annexin V /PI-positive celler var ca. 10% højere i celler co-behandlet med MML og PFT-α end dem behandlet med MML alene (fig. 6C). Disse resultater tyder stærkt på, at MML-induceret autophagy og apoptose er tæt forbundet med p53 tab.

(A) A549 celler blev co-behandlet med eller uden pifithrin-α (PFT-α, 20 uM) og MML ( Kerner blev farvet med DAPI (blå). Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig.