PLoS ONE: Fald i miR-202-3p Expression, en roman tumorsuppressor, i Gastric Cancer

Abstrakte

Nye undersøgelser har vist, at microRNA er involveret i udvikling og progression af cancer. Her fandt vi, at miR-202-3p blev ofte nedreguleret i mavekræft væv. Overekspression af miR-202-3p i gastriske kræftceller MKN-28 og BGC-823, markant undertrykt celledeling og induceret celle apoptose både

in vitro

in vivo

. Endvidere Gli1 ekspression var ofte positive i gastrisk cancer væv og omvendt korreleret med MIR-133b ekspression. Vi viser, at det transkriptionelle faktor Gli1 var et mål på miR-202-3p og spiller en vigtig rolle som formidler af de biologiske virkninger af miR-202-3p i mavekræft. MIR-202-3p inhiberede også ekspressionen af ​​γ-catenin og BCL-2. Tilsammen tyder disse resultater på, at miR-202-3p kan fungere som en ny tumor suppressor i gastrisk kræft og dens anti-tumor aktivitet kan tilskrive den direkte målretning og hæmning af Gli1

Henvisning:. Zhao Y, Li C, Wang M, Su L, Qu Y, Li J, et al. (2013) Nedsættelse af miR-202-3p Expression, en roman tumorsuppressor, i Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10,1371 /journal.pone.0069756

Redaktør: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: Februar 28, 2013; Accepteret: 11 Juni 2013; Udgivet: 25 Juli 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81.072.012, 81.101.847, 81.172.324, 91.229.106 og 81.272.749), Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (nr. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 og 12PJ1406300), centrale projekter i National Science and Technology Pillar Program Kina (nr 2011BA203191), forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (nr 20110073110071), Key Project Shanghai uddannelsesudvalg (nr. 12ZZ102, 12ZZ105) og Innovation Foundation for ph.d. Kandidater fra Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er en af ​​de mest almindelige maligne lidelser og den anden mest almindelige årsager til kræft dødsfald på verdensplan [1]. Selvom fremskridt i behandlingen, overlevelsesraten for patienter med GC er skuffende, det er primært på grund af mangel på specifikke terapeutiske mål. Derfor er det afgørende at identificere de molekylære mekanismer der ligger til grund for udviklingen af ​​mavekræft.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små (18-25 nukleotider), ikke-kodende, enkelt-strengede endogene RNA. De undertrykker proteinekspression ved at interagere med perfekt eller uperfekte komplementære sekvenser placeret i 3′-utranslaterede regioner (3’UTRs) af målgener. Undersøgelser i de seneste år har vist, at dysregulerede miRNA spiller vigtige roller i forskellige kræftformer [1] – [4], herunder GC [5] – [13]. Data fra undersøgelsen om miRNA og deres mål gener kan give spændende terapeutiske muligheder [3].

Vi har for nylig identificeret en række miRNA dereguleret i GC, såsom nedregulering af miR-126 [14], miR-409-3p [15], miR-625 [16], og opregulering af miR-21 [17], miR-301a [18]. Selv om mange miRNA er blevet identificeret associere med GC, skal stadig undersøges mekanismen i disse miRNA i gastrisk tumorigenese. I vores tidligere arbejde, blev talrige putative miRNA, der viste differentiel ekspression mellem GC væv og deres tilgrænsende ikke-tumorvæv fra 28 patienter identificeret [19]. Blandt dem, MIR-202-3p var en af ​​de mest faldt betydeligt miRNA. Men rollen som miR-202-3p i GC er sjældent undersøgt.

MIR-202-3p, tidligere navngivet HSA-miR-202, som ligger inden for en kromosomal skrøbelig websted i 10q26. Sletning af den skrøbelige websted er blevet forbundet med endometriecancer [20], hjernetumorer [21], [22]. MIR-202 er blevet rapporteret at blive dereguleret i brystcancer [23], [24], cervikal planocellulært [25], colorectal cancer [26] og follikulært lymfom [27]. Petrocca et al. fandt, at MIR-202 blev nedreguleret i kronisk gastritis [28]. MIR-202 har vist sig at være nedreguleret med 4-hydroxynoneal (HNE) i HL-60-leukæmiceller [29]. En nylig undersøgelse viste også, at MIR-202 direkte målrettet proto-onkogen MitCN, hvilket resulterer i inhibering af neuroblastoma celleproliferation [30].

Her viser vi et generelt fald i MIR-202-3p ekspressionsniveau i 150 GC væv sammenlignet med de ikke-tumorvæv og opdager, at de miR-202-3p niveauer er forbundet med tumorstørrelse og patienter alder. Desuden opdagede vi, for første gang, at MIR-202-3p kunne hæmme væksten og inducere apoptose af GC-celler både

in vitro

in vivo Salg ved direkte målretning transskriptionsfaktoren Gli1 og hæmme ekspressionen af ​​Gli1 målgener γ-catenin og BCL-2.

Materialer og metoder

Etik Statement

skriftligt informeret samtykke er indhentet fra alle deltagere. Undersøgelsen blev godkendt af Human Research Ethics Committee of Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), Laboratoriet Dyreetiske Komité Ruijin Hospital (elektrolytkondensatorer 11-062). procedurer Animal blev udført i henhold til en protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kina.

Cell Kultur

Menneskelig GC cellelinjer SGC -7901 og BGC-823 blev købt fra Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). MKN-45 og MKN-28 cellelinier blev opnået fra japanske Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan). NCI-N87, AGS, KATO III og SNU-1 cellelinier blev oprindeligt erhvervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Humane embryonale nyre cellelinje 293T (HEK-293T) blev bevaret i vores institut. Celler blev opbevaret, udvundet fra kryopræservering i flydende nitrogen og anvendes på tidlige passager. Alle celler blev holdt i RPMI-1640 medium plus 10% føtalt bovint serum (FBS) og dyrket i 5% CO2 befugtet atmosfære. Eksponentielt voksende celler blev anvendt til eksperimenter.

Patient Væv

Primære GC væv og matchede ikke-tumorvæv blev opnået fra 150 GC patienter, der gennemgår radikale gastrektomi ved Institut for Kirurgi, Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University. Prøver blev lynfrosset direkte efter operationen. Alle prøver blev bekræftet af uafhængige patologisk undersøgelse. Ingen af ​​patienterne modtog præoperativ behandling. For alle patienter, klinisk-patologisk oplysninger var til rådighed. klassificering Tumor ifølge Den Internationale Union Against Cancer (2009).

RNA Isolation og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)

Total RNA blev ekstraheret fra cellelinjer og vævsprøver ved hjælp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) ifølge producentens anvisninger. Koncentrationer og renhed af RNA-prøver blev målt ved elektroforese og spektrofotometriske metoder. Ekspressionsniveauerne af MIR-202-3p og U6 lille nukleare RNA (RNU6B) blev analyseret i triplikater af hårnåle-RT-PCR-metode under anvendelse af Hairpin-it ™ miRNA qPCR kvantificeringskit (GenePharma, Shanghai, Kina) med specifikke primere formiR-202-3p og U6 lille nukleare RNA (RNU6B). Relativ miRNA ekspression af MIR-202-3p blev normaliseret mod den endogene kontrol, U6, ved hjælp af DDCt metoden. MRNA-niveauer af Gli1 og GAPDH blev målt i triplikater under anvendelse af SYBR Green real time PCR (Applied Biosystems, USA) ifølge producentens instruktion. Kvantificering blev udført ved hjælp af DDCt relative kvantificering metode med menneskelige GAPDH som en intern kontrol. Følgende primere blev anvendt: Gli1 (sense: 5′-GGA AGT CAT ACT CAC GCC TCG A-3 ‘; antisense: 5′-CAT TGC TGA AGG CTT TAC TGC A-3′) [31] og GAPDH (sense: 5’-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3 ‘; antisense: 5′-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3’.)

Transient transfektion af miRNA Efterligner

MiR- 202-3p efterligner (dsRNA oligonukleotider) og negative kontrol mimics1 (NC) (forstand: 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ‘, antisense: 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’), blev købt fra GenePharma (Shanghai, Kina). Celler blev podet i plader med 6 brønde dagen før transfektion at sikre 40% cellekonfluens på tidspunktet for transfektion. Transfektion af miRNA efterligner i celler blev udført med Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i overensstemmelse fabrikantens procedure. MiRNA efterligner blev anvendt ved en slutkoncentration på 100 nM.

celleproliferationsassay

Ved 24 timer efter transfektion med miRNA efterligner, celler (2 x 10

3 celler /brønd ) blev podet i plader med 96 brønde og inkuberet i 72 timer. Celleproliferation blev vurderet i triplikater af vandopløseligt tetrazoliumsalt (WST) under anvendelse af celle Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) og målt ved at følge fabrikantens instruktion.

blød agar-kolonidannelse Assay

miRNA efterligner transficerede celler blev resuspenderet med 0,3% blød agarose (A9045, lav geleringstemperatur, Sigma-Aldrich, USA) i RPMI 1640 indeholdende 10% FBS og lagdelt på 0,4% størknede agar i RPMI 1640 indeholdende 10% FBS i 6-brønds plader (1 × 10

3 celler /brønd) ved 24 timer efter transfektion. Pladerne blev inkuberet i 2 uger. Kolonier indeholdende mindst 50 celler blev talt.

Apoptose Analyse

En dag før transfektion med miRNA efterligner, 1 x 10

6 celler blev podet i plader med 6 brønde. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne høstet og farvet med AnnexinV /PI dobbelt farvning Kit (BD Biosciences, USA) i henhold til fabrikantens protokol. Apoptotiske celler blev vurderet i tre eksemplarer og gentaget tre gange uafhængigt ved flowcytometri på en FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).

retroviral transfektion til stabile cellelinier

genomiske region, der indeholdt det primære transkript af mIR-202-3p blev klonet i EcoRI-Xhol-stedet i det modificerede pMSCV-GW-RfA-PGK-EGFP retroviral vektor. Negative kontrolprøver vektorer havde intet insert. HEK 293T-celler (1 x 10

6 /brønd) blev podet i plader med 6 brønde dagen før transfektion. Ti ug retroviral konstrukt indeholdende enten MIR-202-3p eller intet insert, 2 ug gag /pol og 2 ug VSVG blev co-transficeret ind i HEK 293T-celler under anvendelse af Lipofectamine ™ 2000 reagent og Opti-MEM I reduceret serum mediet i hver plade. Vira blev høstet ved 48 timer og 72 timer efter transfektion ved viral samling medium (RPMI-1640 med 10% varmeinaktiveret FBS + 1% glutamin +20 mM HEPES). Infektioner af MKN-28-celler blev udført i nærvær af 8 ug /ml polybren i hver brønd i en 6-brønds plade. Celler blev spin-inficeret ved 1500 rpm i 30 min ved stuetemperatur. Virusholdige supernatant blev fjernet efter 2 timer. Positive celler blev udvalgt til GFP-ekspression ved FACS-sortering og navngivet RV-miR-202-3p og RV-miR-kontrol hhv. MIR-202-3p udtryk blev bekræftet ved QRT-PCR.

tumorvækst i nøgne mus

Male BALB /c nu /nu mus, i en alder af seks uger (Institute of Zoology Chinese Academy of Sciences), blev opstaldet på en SPF-miljø i Animal Laboratory Unit, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kina. Mus fik human pleje og undersøgelsens protokoller blev udført i overensstemmelse med en protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kina. Celler (100 ul, 2 × 10

6 celler) fra stabile transfekterede linjer RV-miR-202-3p eller RV-miR-kontrol blev indsamlet og inokuleret subkutant i mus. Seks mus blev anvendt for hver gruppe. Mus blev tjekket ugentligt, og tumorknuder blev målt med en passer. Tumorvolumen (V) blev estimeret ved anvendelse af ligningen V = 4 /3π × L /2 × (W /2)

2, hvor L er midterakse længde, og W er den midterakse width.The tumorceller fik lov til vækst 5-uger og tumorvækst kurver og inhiberende blev beregnet. Efter musene blev aflivet, blev alle tumor transplantater udskåret, vejet, høstet, fikseret og indlejret. Hvert forsøg blev udført to gange.

TUNEL analyse

Den terminale nukleotidyltransferase-medieret nick endemærkning assay (TUNEL) blev udført ved at følge producentens instruktioner for deadend ™ Kolorimetrisk TUNEL System kit (Promega, USA). Væv blev fikseret i 10% neutraliseret formalin og indlejret i paraffinblokke. Sektioner (4 pm) blev derefter forberedt til undersøgelse. Efter afparaffinering blev snittene behandlet med 20 g /ml proteinase K i 10 minutter, med 0,3% H

2O

2 i methanol i 10 minutter og 0,1% Triton X-100 i 0,1% natriumcitrat i 2 min på is. Derefter blev snittene inkuberet med TUNEL reaktionsblandingen i 60 minutter ved 37 ° C. Yderligere inkubation med peroxidase-konjugeret antistof blev udført i 30 min ved 37 ° C. Snittene blev farvet med diaminobenzidin opløsning i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter modfarvet med hæmatoxylin.

Immunhistokemi

Sektioner (tykkelse 6 mm) af formalin-fikseret, paraffin-embedded tumor specimenswere afparaffineres i xylen og rehydratiseret i gradueret alkohol. Endogen peroxidase blev blokeret under anvendelse af 3% H

2O

2 i 10 min. Efter antigen-genvinding i citratbuffer (pH 6,0), blev vævssnittene inkuberet med normalt gedeserum til at blokere ikke-specifik antistofbinding (20 minutter ved stuetemperatur). Snittene blev derefter inkuberet med Gli1 antistoffer (1:50, sc-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) ved 37 ° C i humidchambers i 2 timer. Efter vask med PBS tre gange blev sektionerne inkuberet med peroxidase-konjugeret anti-kanin IgG i 1 time ved stuetemperatur. Dernæst blev objektglassene skyllet med PBS og inkuberet i 5 minutter med DAB-substrat i mindre end 30 min. Hæmatoxylin blev anvendt til kontrastfarvning.

Konstruktion af plasmider og luciferaseaktivitet Assay

A 203-bp fulde længde af vildtype (WT) Gli1-3’UTR eller mutant Gli1-3 ‘ UTR (mut), der indeholder den formodede miR-202-3p bindingssted blev syntetiseret (Sangon, Shanghai, Kina). Efter fordøjelse af Spel og HindIII, blev fragmenter af vild-type og mutante Gli1-3’UTR klonet ind i Spel og HindIII-stederne i pMIR-Rapport Luciferase vektor (Applied Biosystems) og opkaldt pMIR /Gli1 og pMIR /Gli1 /mut, henholdsvis. DNA-sekventering blev anvendt til at verificere konstruktionerne.

HEK-293T-celler blev podet i plader med 24 brønde 24 timer før assay performance. I hver brønd, 100 ng pMIR /Gli1 eller pMIR /Gli1 /mut, 2 ng pRL-TK (Promega, Madison, WI, USA) indeholdende Renilla luciferase og 100 nM miRNA efterligner cotransficeredes under anvendelse af lipofectamin ™ 2000 reagens og Opti-Memi reduceret serum medium. Relativ luciferaseaktivitet blev beregnet 48 timer efter cotransfektion under anvendelse Dual-Glo Luciferase assay (Promega, USA) ifølge producentens procedure. Ildflueluciferaseaktivitet, blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet.

Western blot-analyse

Celler og tumor blev lyseret ved hjælp af M-PER reagenser og Halt proteaseinhibitorcocktail kits (Pierce, USA). Proteinkoncentrationen af ​​cellelysaterne blev kvantificeret under anvendelse af et BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA). Protein blev adskilt ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese og blottet på 0,22 um polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, MA, USA). Følgende specifikke antistoffer blev anvendt: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-catenin (1:2000, BD Biosciences, USA), BCL-2 (1:2000, EPITMICS, USA), og GAPDH (1: 20000, Abcam, UK). Proteinniveauer blev normaliseret til total GAPDH

Konstruktion af Gli1 ekspressionsplasmid og transfektion

Ved amplifikation cDNA of MKN-28 under anvendelse af følgende primere:. Sense (5’AGT TGA ACA TGG GAT ATC AT-3 ‘) og antisense (5’ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3’), fuld-længde Gli1 blev opnået, fordøjet af EcoR V og Not i og klonet ind pcDNA3.1-vektoren (Invitrogen) og betegnet pcDNA3 0,1-Gli1. DNA-sekventering blev anvendt til at verificere konstruktionerne.

Celler blev podet i plader med 6 brønde dagen før transfektion at sikre 80-90% cellekonfluens på tidspunktet for transfektion. I hver brønd, cellerne blev transficeret med 250 pmol MIR-202-3p efterligner eller kontrol, sammen med 4 ug pcDNA3.1-Gli1 eller pcDNA3.1 tom vektor, ved anvendelse af lipofectamin 2000. WST-assay blev udført ved 24 timer efter transfektion, mens apoptose analyse blev udført ved 48 timer efter transfektion.

Statistisk analyse

kontinuerlige variabler blev sammenlignet ved hjælp af Students

t

test for normalfordelte variabler og Wilcoxon rank-sum test for nonnormally fordelte variable. Forholdet mellem MIR-202-3p ekspressionsniveauer og clinicopathologic parametre blev analyseret ved anvendelse af Pearson Chi-square test. Alle værdier er vist som middelværdi ± SDS. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse PASW Statistics 18,0 software (IBM, USA). En to-tailed værdi på

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Udtrykket af miR-202-3p er faldet i GC og korrelerer med Clinicopathologic Parametre

udtryk af miR-202-3p blev undersøgt ved QRT-PCR i tumorvæv og de matchede ikke-tumorvæv fra 150 GC patienter (fig. 1A). Resultaterne viser, at ekspression af MIR-202-3p var signifikant nedreguleret i tumorvæv sammenlignet med matchede ikke-tumorvæv i 68% (102/150) af GC-patienter. (P 0,001;. Figur 1A, B)

(A) Relativ udtryk for miR-202-3p i 150 GC patient væv sammenlignet med de tilstødende ikke-tumorvæv. QRT-PCR Resultaterne er vist som -ΔΔCT værdier. (B) Boksene repræsenterer den 25. gennem 75. percentiler. De vandrette linjer repræsenterer medianerne. De whiskers repræsenterer den 10. og 90. percentiler. ***,

P

. 0,001

For yderligere at belyse sammenhængen mellem udtryk niveau af miR-202-3p og clinicopathologic faktorer i menneskets GC, de 150 sager blev yderligere analyseret (tabel 1). På grundlag af relativ MIR-202-3p ekspression blev de 150 sager stratificeret i 3 grupper: MIR-202-3p lav ekspression (tumor /non-tumor-forhold 0,66, n = 85), MIR-202-3p moderat ekspression (tumor /non-tumor forhold 0,66-1,5, n = 34) og mIR-202-3p høj ekspression (tumor /non-tumor forhold 1,5, n = 31). MIR-202-3p ekspressionsniveauer var negativt korreleret til tumorstørrelse og positivt korreleret til alder hos disse patienter, med MIR-202-3p lav ekspression udviste signifikant større tumorstørrelse (p = 0,013) og ældre alder sammenlignet med moderat eller høje ekspressionsniveauer grupper (p = 0,028). Desværre fik miR-202-3p ekspressionsniveauerne ikke nogen sammenhæng med køn, differentiering, tumor placering, tumor lokal invasion, lymfeknude metastaser eller TNM stadie.

Overekspression af miR-202-3p Forhindrer GC Cell Proliferation

da miR-202-3p er faldt betydeligt i GC, kan det fungere som en tumor suppressor. Derfor har vi undersøgt, om overekspression af miR-202-3p i GC celler påvirket cellevækst. MKN-28 og BGC-823 cellelinjer, hvis ekspression af MIR-202-3p var de laveste i de otte testede GC cellelinjer (fig. 1 C), blev valgt til de efterfølgende expreiments. Syntetiske miR-202-3p efterligner og negative kontrol efterligner molekyler (NC) blev transficeret ind i MKN-28 og BGC-823 celler hhv. Den ektopiske udtryk for miR-202-3p i celler blev bekræftet ved QRT-PCR.

WST celle-vækst assay viste signifikante celle vækst hæmninger i MKN-28 celler transficeret med miR-202-3p (fig. 2.A). Lignende resultater blev observeret i BGC-823-celler (Fig. 2.B). For yderligere at karakterisere virkningen MIR-202-3p på cellevækst, udførte vi blød agar-kolonidannelse assayet i transficerede celler. Vi fandt, at antallet af kolonier fra MKN-28-celler transficeret med de MIR-202-3p efterligner var næsten halvdelen af ​​den fra kontrol- og parentale gruppe (fig. 2C). Lignende resultater blev observeret i BGC-823-celler (Fig. 2.d). Disse resultater viser, at MIR-202-3p kan undertrykke celleproliferation af GC celler

in vitro

.

Celleproliferation blev vurderet ved WST-assay i MKN-28-celler (A) og BGC -823 celler (B). Celler blev transficeret med MIR-202-3p efterligner eller NC ved 24 timer efter transfektion blev underkastet WST-assay sammen med parentale celler. Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± S.D. *,

P

0,05. Virkningen af ​​MIR-202-3p på celleproliferation blev vurderet af kolonidannelse assayet i MKN-28-celler (C) og BGC-823-celler (D). Celler transficeret med 100 nM MIR-202-3pmimics eller kontrol podedes på plader med 6 brønde sammen med parentale celler. Antallet af kolonier blev talt på den 14. dag efter podning. Repræsentative fotografier af kolonier er vist i venstre paneler. Relevant kvantificering af resultaterne er vist i søjlediagrammer (højre paneler). Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± S.D. *,

P

. 0,05

Overekspression af miR-202-3p inducerer GC Cells Apoptose

Da væksthæmning måske grundet blokeret cellecyklusprogression eller øget apoptose, vi næste præformede celledelingscyklussen assay og apoptose ved flowcytometri. Vores data viste, at de apoptotiske satser af begge MKN-28 og BGC-823-celler transficeret med MIR-202-3p efterligner var signifikant opreguleret (fig. 3A, B). Der var imidlertid ingen signifikant forskel i cellecyklus mellem forskelligt behandlede grupper (data ikke vist). Disse resultater viste, at overekspression af miR-202-3p inducerer apoptose i GC celler kan bidrager til væksthæmmende egenskaber af miR-202-3p.

(A) Repræsentative histogrammer skildrer apoptose af MKN-28 celler forbigående transficeret med 100 nM miR-202-3p efterligner eller NC og forældrenes celler (venstre paneler). Procentdelen af ​​apoptotiske celler fra tre uafhængige eksperimenter ± S.D. er vist i søjlediagrammerne (højre paneler). (B) Repræsentative histogrammer skildrer apoptose af BGC-823 celler forbigående transficeret med 100 nM miR-202-3p efterligner eller NC og forældrenes celler (venstre paneler). Procentdelen af ​​apoptotiske celler fra tre uafhængige eksperimenter ± S.D. er vist i søjlediagrammer (højre paneler).

Overekspression af miR-202-3p Hæmmer Tumorigenicitet og Øger Apoptose

in vivo

Da miR- 202-3p hæmmer væksten GC celler og inducerer apoptose

in vitro

, vi næste undersøgt, om miR-202-3p kunne undertrykke tumorvækst og inducere apoptose

in vivo

. Celler af MKN-28, RV-MIR-202-3p (MKN-28 celler med retrovirus-medieret MIR-202-3p stabil ekspression) eller RV-MIR-kontrol (MKN-28 celler med den tomme vektor) blev opnået som beskrevet i Materiale og metoder. Celler blev injiceret subkutant i nøgne mus. Tumordannelse blev overvåget. Tumoren latenstid viste en signifikant forskel mellem mus injiceret med RV-MIR-NC-celler og RV-MIR-202-3p celler (fig. 4A). Det er af stor interesse at tumorer afledt fra RV-MIR-202-3p celler voksede væsentligt langsommere end RV-MIR-kontrolgruppe hele tumorvækst (fig. 4B). Gennemsnitsvægten af ​​tumorer som følge af RV-MIR-202-3p var signifikant mindre end tumorer afledt fra RV-MIR-kontrol (fig. 4C, D).

(A) Tumor latenstiden var antallet af dage til indtræden af ​​håndgribelig tumor og værdierne er angivet som middel ± SD *,

P

0,05. (B) Tumor vækstkurver blev målt efter injektion. Tumordiametre blev målt hver 7. dag. (C) Tumorvægt; værdierne er givet som middel ± S.D. *,

P

0,05. (D) Fotografiet viser repræsentative for tumorxenoplantater 35 dage efter podning. (E) Repræsentative billeder af TUNEL analyse af tumorxenoplantater af mus (venstre paneler). Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev talt (højre paneler). Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± S.D. *,

P

. 0,05

Derudover blev TUNEL analyser af tumorvæv udført. Som vist i fig. 5E, RV-miR-202-3p celler viste en mere tumor celle positiv farvning og en signifikant højere apoptotisk indeks end RV-miR-kontrol celler (

P

0,01). Disse resultater tyder på, at miR-202-3p hæmning af tumorgenicitet tilskrives øget apoptose

in vivo

.

(A) Relativ udtryk for miR-202-3p og Gli1 i otte GC cellelinjer blev udført af QRT-PCR. Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± S.D. (B) Sekvens af Gli1 3’UTR viser miR-202-3p bindingssted og mutation af Gli1 3’UTR bindingssted at skabe Gli1-mut. (C) miR-202-3p efterligner nedreguleret luciferaseaktiviteter kontrolleret af vildtype Gli1 3’UTR (

P

0,01), men påvirkede ikke luciferaseaktivitet styret af mutant Gli1 3’UTR. Resultaterne er gennemsnit af tre independentexperiments ± S.D. (D) Gli1 mRNA i MKN-28-celler blev analyseret ved QRT-PCR ved 48 timer efter transfektion med MIR-202-3p efterligner og NC. (E) Repræsentative Western blotting billeder af angivne protein i MKN-28 celler (venstre paneler), med relevant kvantificering (højre panel). Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± S.D. *,

P

0,05. (F) Gli1 protein blev påvist i RV-miR-kontrol eller RV-miR-202-3p celler fra subkutan tumor i nøgne mus (venstre paneler), med relevante kvantificering (højre panel). Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± S.D. *,

P

. 0,05

MIR-202-3p Direkte Target Gli1

For at forstå den mekanisme bag de tumor-hæmmende egenskaber af miR-202 -3p i GC, vi søgte for sine formodede målgener med potentielle pro-onkogene funktioner ved hjælp online søgeværktøjer (RNAhybrid og Miranda algoritmer), og generne forudsagt af begge de bioinformatiske værktøjer blev valgt som kandidat målgener af miR-202 -3p. Blandt de hundredvis af kandidatgener forudsagte, transkriptionen aktivator Gli1 er af særlig interesse (Figur S1). Det formodede sekundære struktur af RNA-hybrid til human MIR-202-3p og Gli1 er vist i figur S2. Gli1 er blevet rapporteret stærkt udtrykt i GC [32], [33]. Det foreslås, at faldende udtryk for Gli1 resulterede i GC cellelinjer væksthæmning og apoptose [33].

En yderligere vink om den potentielle rolle for miR-202-3p i reguleringen af ​​Gli1 udtryk kom fra analysen af otte forskellige gastrisk cancer cellelinier (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-1, KATO III, BGC-823 og MKN-28). Statistisk analyse viste en signifikant omvendt mønstre udtryk mellem miR-202-3p og Gli1 ((r = -0,345,

P

. . 0,001, figur 5A)

For at vurdere den kliniske relevans af disse fund undersøgte vi sammenhængen mellem udtrykkene for Gli1 med mIR-202-3p ekspression i GC væv. vi fandt, at Gli1 og mIR-202-3p udviser invers ekspressionsmønster i GC væv (tabel 2). disse resultater understøtter den forudsætning, at nedregulering af miR-202-3p øger niveauet af Gli1 gen i mavekræft.

luciferasereporteren analyser blev udført for at verificere en direkte interaktion mellem miR-202-3p og 3’UTR af Gli1. Luciferase reportere blev konstrueret indeholdende enten en vildtype Gli1 3’UTR-sekvensen inklusive mIR-202-3p bindingssted (pMIR /Gli1), eller et muteret Gli1 3’UTR (pMIR /Gli1 /mut) (fig. 5B ). den pMIR /Gli1 og pMIR /Gli1 /mut luciferase reporterkonstruktioner blev transficeret ind HEK-293T-celler, sammen med MIR-202-3p eller NC efterligner. den relative luciferase aktivitet af pMIR /Gli1 reporter blev markant undertrykt sammenlignet med af pMIR /Gli1 /mut i en mIR-202-3p-afhængig måde (fig. 5C). Dette resultat indikerer kraftigt, at 3’UTR af Gli1 bærer de direkte bindingssteder af miR-202-3p.

For at bestemme på mRNA-niveau eller proteinniveau miR-202-3p nedreguleret Gli1, opdaget vi Gli1 udtryk ved QRT-PCR og Western blot. Som vist i fig. 5E, det Gli1 proteinniveauet blev reduceret i MIR-202-3p efterligner-transficerede MKN-28 celler sammenlignet med NC efterligner-transficerede og parentale MKN-28-celler. I mellemtiden var der ikke nogen effekt af MIR-202-3p på Gli1 mRNA-niveau (fig. 5D). Disse resultater tyder stærkt på, at miR-202-3p negativt regulerer Gli1 udtryk på det translationelle niveau.

Blandt generne rapporteret at hæmme apoptose af GC, γ-catenin (plakoglobin) og BCL-2 er direkte transkriptionelle mål af Gli1 [34], [35]. Som vist i fig. 5E, protein niveauer af γ-catenin og BCL-2 blev markant reduceret i MKN-28 celler transficeret med MIR-202-3p efterligner.

Derudover undersøgte vi ekspressionen af ​​Gli1 protein i subkutane tumorer afledt fra RV-miR-kontrol og RV-miR-202-3p i nøgne mus ved western blot analyse. Den Gli1 proteinniveauet i tumorer fra RV-MIR-202-3p demonstrerede nedregulering sammenlignes med den i RV-MIR-kontrol (fig. 5F). Disse resultater tyder stærkt på, at miR-202-3p negativt regulerer Gli1 udtryk post-transkriptionelt.

Overekspression af Gli1 redder Effekt af miR-202-3p i GC Celler

Siden miR-202-3p nedreguleret Gli1 at inhibere celleproliferation og inducere apoptose, er det begrundet at overekspression af Gli1 kunne vende dette fænomen i det mindste delvis. Faktisk, når Gli1 overekspression plasmid (pcDNA3.1-Gli1) blev indført i MKN-28 eller BGC-823 celler transient transficeret med MIR-202-3p efterligner blev den inhibitoriske virkning af MIR-202-3p på cellevækst delvist vendt, der blev observeret ved WST cellevækst assay (fig. 6A, B). Desuden progression mod apoptose blev også hindret, da Gli1 blev overudtrykt i MKN-28 eller BGC-823 celler kortvarigt transficeret med miR-202-3p efterligner (fig. 6C, D) .Disse data dokumenterer, at væksthæmning og celle apoptose induceret af miR-202-3p mindst delvist relateret til dens virkning på Gli1 udtryk.

Efter transficeret med Gli1 ekspressionsvektor (pcDNA3.1-Gli1), MKN-28 celler (A) og BGC-823 celler ( B) blev delvist reddet fra mIR-202-3p væksthæmmende egenskaber. Celler blev transficeret med MIR-202-3p efterligner eller kontrol, sammen med pcDNA3.1-Gli1or pcDNA3.1 tom vektor (pcDNA3.1) ved 24 timer efter transfektion blev underkastet WST-assay. Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± S.D. *,

P

0,05. Repræsentative histogrammer skildrer apoptose MKN-28-celler (C) og BGC-823 celler (D) transficeret med miR-202-3p efterligner eller kontrol, sammen med pcDNA3.1- Gli1) eller pcDNA3.1 ved flowcytometri (venstre paneler). Procentdelen af ​​apoptotiske celler fra tre uafhængige eksperimenter ± S.D. er vist i søjlediagrammer (højre paneler).

Diskussion

Akkumulerende beviser har vist dysregulering af specifik miRNA i GC [4], [13], [36].