PLoS ONE: Cell Surface-Associated Anti-MUC1-Afledt Signal peptid Antistoffer: Konsekvenser for Cancer Diagnostics og Therapy

Abstrakt

MUC1 tumor associeret antigen er overudtrykt på en række tumorer. Dens brede distribution på primære tumorer og metastaser gør det til et attraktivt mål for immunterapi. Efter syntese MUC1 spaltes, hvilket giver en stor opløselig ekstracellulær alfa-subunit indeholdende tandemgentagelser array (TRA) domæne specifikt bundet, via ikke-kovalent interaktion, til en mindre betaunderenhed indeholdende de transmembrane og cytoplasmatiske domæner. Hidtil har resultatløse virkningsfuldhed blevet rapporteret for anti-MUC1 antistoffer rettet mod det opløselige a-underenhed. Målretning cellen bundet beta-subunit, kan omgå begrænsninger i forbindelse med cirkulerende TRA domæner. MUC1 signal peptid (SP) domæne promiskuøst binder flere MHC klasse II og klasse I-alleler, som efter vaccination, genereret robust T-celle-immunitet mod MUC1-positive tumorer. Dette er en første demonstration af ikke-MHC forbundet, MUC1 specifikke, celleoverflader tilstedeværelse for MUC1 SP domæne. Polyklonale og monoklonale antistoffer dannet mod MUC1 SP domæne specifikt binder et stort udvalg af MUC1-positive humane faste og hæmatologiske tumorcellelinier; MUC1-positive knoglemarvsceller afledt plasma celler opnået af multipelt myelom (MM) -patients, men ikke MUC1 negative tumorer celler og normale naive primære blod og epitelceller. Membranal MUC1 SP vises primært som en selvstændig enhed, men også co-lokaliseret med fuld MUC1-molekylet. MUC1-SP specifik binding i BM-afledte plasmaceller kan hjælpe ved udvælgelsen af ​​patienter der skal behandles med anti-MUC1 SP terapeutisk vaccine, ImMucin. Et terapeutisk potentiale af de anti-MUC1 SP-antistoffer blev foreslået af deres evne til at støtte af komplement-medieret lyse af MUC1-positive tumorceller, men ikke MUC1 negative tumorceller og normale naive primære epitelceller. Disse resultater tyder på en roman celle overflade tilstedeværelse af MUC1 SP domæne, en potentiel terapeutisk fordel for anti-MUC1 SP-antistoffer i MUC1-positive tumorer og et udvalg redskab for MM patienter at blive behandlet med anti-MUC1 SP-vaccine, ImMucin.

Henvisning: Kovjazin R, Horn G, Smorodinsky NI, Shapira MY, Carmon L (2014) Cell Surface-Associated Anti-MUC1-afledt Signal peptid Antistoffer: Konsekvenser for Cancer Diagnostics og terapi. PLoS ONE 9 (1): e85400. doi: 10,1371 /journal.pone.0085400

Redaktør: Stefan Dübel, Technical University Braunschweig, Tyskland

Modtaget: 9 oktober, 2013; Accepteret: December 5, 2013; Udgivet: 8. januar 2014

Copyright: © 2014 Kovjazin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling nr 48.447 fra den israelske Chief Scientist af Ministeriet for Industri Handel og Labor. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: Lior Carmon er grundlægger og CEO og Riva Kovjazin, og er seniorforsker på Vaxil Biotherapeutics Ltd., en start-up virksomhed, der er ved at udvikle ImMucin, en anti-MUC1 SP terapeutisk vaccine mod MUC1-positive tumorer. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. De andre forfattere erklærer nogen interessekonflikt.

Introduktion

MUC1 er en mucin-lignende glycoprotein overudtrykt på en række epiteliale carcinomer, herunder lunge-, bryst-, ovarie, prostata og tyktarm, som samt på overfladen af ​​hæmatologiske tumorer, såsom multipelt myelom (MM) [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Dens brede distribution på både primær tumor og metastase, herunder kræft stamceller [7], har etableret det som en bredt udforsket mål for immunterapi [1], [8], [9], [10]. Faktisk blev MUC1 opført af National Cancer Institute pilotprojekt som den anden mest lovende mål fra en liste med 75 mulige tumorassocierede antigener (TAA) [11].

MUC1 findes i en række isoformer [12 ], hvor den mest omfattende undersøgt formular er den polymorfe type i transmembranprotein (MUC1-TM), der består af et ekstracellulært domæne indeholdende 20-125 20-aminosyre-lange tandemgentagelse arrays (TRA) efterfulgt af et transmembrandomæne og en kort cytoplasmatiske hale [13], [14]. MUC1 bearbejdes i den sekretoriske pathway, hvilket giver en stor ekstracellulær a-underenhed indeholdende TRA domæne, ikke-kovalent bundet til en mindre beta subunit indeholder molekylets transmembrane og cytoplasmatiske domæner [15]. Til dato, mens de fleste anti-MUC1 antistoffer rettet mod RSA-domænet af det ekstracellulære alfa-subunit [16], [17], [18], undersøgelser har vist modstridende resultater vedrørende det immunterapeutiske effekt af sådant antistof-baserede TRA-epitop målretning [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Disse inkonsistente resultater foreslås at være en følge af den ikke-kovalente binding af TRA-domænet til tumorcelleoverfladen; den opløselige, cirkulerende form, fungerer som afledning for anti-TRA-antistoffer, hvilket begrænser deres evne til at nå MUC1-udtrykkende tumorceller [23], [25]. Derfor målretning MUC1 noncirculating epitoper udelukkende udtrykt på tumor celle overflader kunne potentielt omgå disse begrænsninger. Til dette formål epitoper fra de ekstracellulære og intracellulære segmenter omkring MUC1 TRA domæne, sammen med epitoper i MUC1 signal peptid (SP) domæne, blev identificeret [20], [21], [27], [28].

SP’er er korte 13-50 aminosyrerester lange lipofile sekvenser typisk placeret ved amino-terminalen af ​​proteiner bestemt til sekretion eller til integration i cellulære membraner [29]. Når proteintranslation er afsluttet, SP’er inkorporeret i det endoplasmatiske reticulum (ER) membran generelt fjernet fra det modne protein, men kan stadig indtaste ER lumen og binder MHC-molekyler, enten direkte, på grund af den unikke proteaseaktivitet af ER-membran- associerede signalpeptid peptidase (SPP) [29], eller indirekte, ligesom andre nedbrudte sekvenser, via transportøren forbundet med antigenbehandling (TAP) maskiner [30]. Alligevel ER lokalisering og MHC bindende sprogfærdighed SP’er [31] bygger både på deres hydrofobe natur og specifik sekvens. Nemlig sideløbende vedligeholdelse af konsensus-motivet kræves som et målrettet signal, forskellige SP’er udviser høj variabilitet og antigenspecificitet [29], [32], [33]. Følgelig kan SP domæner tjene som vaccinekandidater (VCS), inducere antigenspecifikke immunresponser i en stor del af befolkningen.

21-mer SP domæne af MUC1 (MUC1 SP), heri den MUC1- SP-L eller VXL100 peptid eller det formulerede terapeutisk vaccine, ImMucin [28], behandles og præsenteres i association med multiple MHC klasse i og II på celleoverfladen af ​​både antigenpræsenterende celler og forskellige MUC1-positive tumorceller, som kan generere robust T-celle-immunitet mod MUC1-positive tumorer [28]. Desuden kan en MUC1-specifik humoral respons genereres mod MUC1 SP, manifesteret ved signifikant forhøjelse af naturlige autoantistoffer i blodet af MM patienter, men ikke hos raske donorer [34]. Da opløseligt MUC1 SP ikke blev detekteret i patientsera [34], blev det overvejet, de naturligt frembragte autoantistoffer blev primet af ikke-MHC-begrænset, MUC1-associeret tumor cellebundne SP. Den aktuelle undersøgelse udforskede denne mulighed ved at generere specifikke polyklonale og monoklonale antistoffer mod MUC1-SP-L. Celle-overflade tilstedeværelse af MUC1 SP blev detekteret under anvendelse af de hævede antistoffer, på tumor cellelinier og primære tumorer, men ikke på naive primære celler. Udover deres direkte anti-tumor terapeutisk potentiale, kan disse antistoffer forbedre kriterierne i MM patienter havde til formål at blive behandlet med den ImMucin anti-MUC1 SP terapeutisk vaccine udvælgelse.

Materialer og metoder Salg

Peptide Synthesis

MUC1-SP-L, MUC1-SP-M, MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2, MUC1-SP-S3, MUC1-SP-S4, MUC1-SP-S5 og TB-Rv0476 /4941-SP-L blev syntetiseret ved automatiseret, fast-fase peptid syntese under anvendelse fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) /tBu-strategi og Rink-amid-polystyrenharpiks (EMC Microcollections, Tyskland og Almac Sciences, UK). MUC1-TRA-L og BAGE-SP-L blev syntetiseret ved hjælp af samme metode (GL Biochem, Kina). Peptidrenhed og identitet var . 95%, bestemt ved HPLC og massespektrometri analyser

Tumor Cell-linjer og Hybridomer

humane B-lymfatisk leukæmi linjer Raji og Ramos , den humane mM-cellelinjer U266, og RPMI8226 og humant PC leukæmilinie ARH-77 blev dyrket i suspension i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1% ikke-essentielle aminosyre, 1 mM HEPES og 50 ug /ml gentamycin. Den humane ovariecarcinom line OVARCAR-3 blev dyrket som en adhærent monolag i RPMI-1640 medium suppleret med 20% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 50 ug /ml gentamycin. Den humane ovariecarcinom line ES-2, blev melanoma SK-MEL-28, og de brystcancercellelinier MCF7, MDA-231 og MDA-453 dyrkes som adhærente monolag og human melanoma SK-MEL-1 blev dyrket i suspension i DMEM, suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 50 ug /ml gentamycin. Alle cellelinier blev indkøbt fra ATCC (Manassas VA, USA). Alle hybridomaer anvendt i denne undersøgelse, blev dyrket i DMEM suppleret med 10% hesteserum, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 50 ug /ml gentamycin. Alle kultur reagenser blev købt fra Biological Industries, (Bet-HaEmek, Israel).

Antistoffer

Den anti-MUC1 TRA mAb H23, rejst mod human brystcancer cellelinje T47D, [35 ], der anerkender ikke-glycosylerede MUC1-epitop APDTRP, tjente som en positiv kontrol. Muse-anti-ged eller kanin-anti-muse-IgG-FITC (Jackson ImmunoResearch, USA) tjente som en negativ kontrol for FACS analyser. Normale mus eller kanin IgG-antistoffer (Chemicon, Millipore, USA) blev anvendt til komplement-afhængig cytotoksicitet (CDC) analyser.

Dyr Salg

Otte uger gamle BALB /c-mus (Tel Aviv University avl facilitet) og to måneder gamle kaniner (Harlan, Jerusalem, Israel) blev opretholdt i universitetets dyreforskning facilitet.

Alle eksperimentelle procedurer, der involverer mus og kaniner blev godkendt af Tel Aviv University Animal Care Udvalg.

Patient knoglemarv (BM) aspirater og Primær Naïve raske celler

BM aspirater (2-3 ml) blev trukket fra fire patienter (i alderen 50-75) med langsomt skrider, asymptomatisk MM, der var blevet screenet for tilmelding til ImMucin s fase i klinisk /II forsøg (protokol VAXIL-001). Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for Hadassah University Hospital, Jerusalem, Israel den israelske sundhedsministerium og blev registreret på PRS som NCT01232712. Analysen af ​​BM-afledte PC blev udført inden for rammerne af screeningsprocessen af ​​undersøgelsen og skriftligt informeret samtykke fra MM patienterne blev opnået for at bruge deres prøve til forskning. Frisk normal human BM (katalog nr. 1 M-105) og humant NHEC (katalog nr. CC-2251), blev indkøbt fra Lonza Bioresearch (Somerset, NJ, USA). Normale hvide blodlegemer menneskelige blev isoleret fra buffy-coat prøver doneret af den israelske National Blood Bank, fra 3 naive donorer.

Produktion af anti-MUC1 SP polyklonale antistoffer

Fire kaniner (R22, R23, R32 og R33) blev subkutant immuniseret fire gange, med to ugers intervaller, med 500 ug keyhole limpet hæmocyanin (KLH) -konjugeret MUC1-SP-M, emulgeret i komplet Freunds adjuvans i den første immunisering og i ukomplet Freunds adjuvans i efterfølgende immuniseringer. KLH-peptid konjugation blev udført ved Adar Biotech (Rehovot, Israel) ved hjælp af glutaraldehyd-drevet tværbinding. Syv dage efter den sidste immunisering blev kaninsera undersøges for tilstedeværelsen af ​​MUC1-SP-M-specifikke antistoffer; positive sera (titer 1:12,800) blev opsamlet og poolet. IgG fraktioner af kanin R23, betegnes R23IgG, anvendes til alle immunologiske assays, undergik ammoniumsulfat (40%) nedbør før brug, som tidligere beskrevet [36].

Produktion af anti-MUC1 SP mAbs

Fire BALB /c-mus blev subkutant immuniseret som beskrevet ovenfor. To uger efter den sidste immunisering blev mus sera vurderet for tilstedeværelsen af ​​MUC1-SP-M-specifikke antistoffer. Miltceller fra den højeste positive sera-bærende mus blev høstet og fusioneret med den murine NSO myelom partner cellelinie, ved anvendelse af polyethylenglycol (molekylvægt 1500) (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). Hybridomer blev selekteret i 2 uger i hybridoma-vækstmedium suppleret med 2% hypoxanthin-aminopterin-thymidin og blev yderligere dyrket i hybridoma-vækstmedium suppleret med 2% hypoxanthin-thymidin. ELISA blev udført til skærmen kultursupernatanter for tilstedeværelsen af ​​anti-MUC1-SP-M IgG Abs. Positive prøver blev screenet igen ved ELISA og blev yderligere subklonet og udvidet. Storstilet Ab produktion af udvalgte kloner blev opnået ved oprensning af mAb’er under anvendelse af et anti-muse-IgG-agarose-søjle (Sigma, Israel;. Kat ingen A6531). Isotypebestemmelse af mAbs blev udført ved hjælp af en Isostrip kit (Roche,.. Kat nr 1.493.027).

ELISA-baserede Screening af Mouse Hyperimmunt Sera og anti-MUC1-SP-M IgG-producerende hybridomaer

ELISA-plader (F96 Maxisorp, Nunc, Danmark) blev aktiveret i 1 time med 0,1% glutaraldehyd (Sigma, Israel) i carbonatbuffer, pH = 9. Dernæst blev pladerne overtrukket med 50 ul peptid (5 ug /ml), i carbonatpuffer (natten over, 4 ° C), efterfulgt af blokering (2 timer, stuetemperatur) med PBS suppleret med 5% FBS og 0,04% Tween 20 (ICN Biomedical Inc., USA). Serumprøver fra MUC1-SP-M-immuniserede mus blev derefter fortyndet i den blokerende buffer, mens prøver fra hybridomkulturer ikke blev fortyndet. Alle prøver blev inkuberet (2 timer, stuetemperatur), før omfattende vask og behandling (1H, stuetemperatur) med HRP-konjugeret anti-muse-IgG (Jackson ImmunoResearch, USA; 50 ul /brønd) efter en 1:10,000 fortynding i blokeringsbuffer. Efter omfattende vask blev pladerne fremkaldt med TMB /E-opløsning (CHEMICON, Millipore, USA), ifølge producentens anvisninger.

I peptidantistof kompetitive assays, hyperimmune sera og hybridoma-vækstmedium blev inkuberet med 1 ug /godt peptider i 96-brønds ELISA-plader (F96 Maxisorp, Nunc, Danmark) aktiveret med glutaraldehyd. Resten af ​​assayet blev udført som beskrevet ovenfor. Et fald på mindst 50% i OD blev betragtet et positivt resultat.

flowcytometri og Imagestream

For at bekræfte overflade farvning af MUC1 på tumorcellelinjer og co-ekspression af MM markører og MUC1 på BM aspirater, cellerne blev vasket og inkuberet i 30 minutter i farvning puffer, bestående af PBS suppleret med 3% FBS, 10% human AB sera og 0,1% natriumazid. BM “store celler” blev indledningsvis gated om side vs. forward scatter. Derefter blev cellerne farvet med en eller flere af de følgende: anti-humant CD138-APC kommercielt konjugeret Ab’er (IQ Products, Holland), anti-human kappa let kæde-eFluor 450 og anti-human lambda-let kæde-PE (eBioscience, USA) og /eller in-house-forberedt FITC- eller PE-konjugeret anti-human MUC1 (anti-MUC1-TRA H23), anti-MUC1 SP R23IgG, SPmAb-6 og SPmAb-2.1-antistoffer. FITC og PE-konjugering blev udført ifølge producentens protokol (Belysning link R-Phycoerythrin Konjugation Kit, Innova Biosciences, USA). Mærkede celler blev vasket to gange, fikseret i BD CellFIX (Becton Dickenson, USA), ifølge fabrikantens protokol, og opbevaret ved 4 ° C indtil analyse. Mindst 1 × 10

6, og 3 × 10

4 hændelser blev erhvervet for flowcytometri og image stream hhv. For imagestream analyse blev cellekerner farvet med Hoechst farveopløsning (3030145), ifølge fabrikantens protokol (MP Biomedicals, CA, USA). Flowcytometri-analyse blev udført med LSR II (Becton Dickenson Immunocytometry Systems, USA) og blev analyseret under anvendelse FlowJo software (TreeStar, USA). Colokalisering analyse blev udført med den Imagestream systemet (ImageStreamX flowcytometer, Amnis Corp) og analyseret ved hjælp af IDEAS lighed Bright Detail funktionen (IDEAL 6.0; Amnis Corp). Ligheden score er et mål for den grad, i hvilken to billeder er lineært korreleret.

immunfluorescensmikroskopi

Adhærente celler (5 x 104 celler /brønd) blev udpladet på dækglas (Marlenfeld GmbH piezo-kontrollerede Z-fase alle under kommando af Slidebook ™. Billeder blev anskaffet med en Evolve EMCCD kamera (Photometrics; 100 × linse, 1 × 1 Binning, pixelstørrelse: 0,16 mikron).

CDC

Forskellige tumor linjer og HMEC (Target celler) ( 1 × 10

6 celler /ml) blev mærket med 2 uCi /ml 3 [H] -thymidin (Amersham, UK), i 18 timer ved 37 ° C. Derefter blev cellerne vasket tre gange med PBS og inkuberet (2 timer, stuetemperatur) med 100, 50 eller 10 ug /ml H23, R23IgG, SPmAb-6 eller SPmAb-2.1-antistoffer. Celler blev derefter vasket med PBS, og 1 x 10

4-celler blev inkuberet (5 timer, 37 ° C) i 4 ml rør med 20 ul, 10 ul eller 5 ul humant serum komplement (Sigma, Israel). Celler blev derefter vasket tre gange med PBS, resuspenderet i 300 ul PBS og udsået i 100 ul /brønd tre eksemplarer, i plader med 96 brønde (Griner, De Groot, Tyskland). Cellehøst blev udført ved anvendelse unifilter 96-brønds plader (PerkinElmer, USA). Radioaktivitet blev bestemt i en beta-tæller (PerkinElmer, IL, USA). For spontan lysis blev celler inkuberet under de samme betingelser, men uden tilsætning af komplement. For total lyse blev 10% triton X100, hvormed de mærkede celler. Procentdel af specifik lyse blev beregnet som følger:. (CPM i eksperimentel godt – CPM i spontan prøve) /(CPM i samlede stikprøve – CPM i spontan prøve) × 100

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse t-test. I alle forsøg blev det minimum af betydning for en 2-halet test sat til p. 0,01

Resultater

Generering af MUC1 SP-specifikke antistoffer

For at fremme udforskning af arten, specificitet og placering af antigenet, der fører til dannelsen af ​​autoantistoffer til MUC1-SP-L blev KLH-konjugeret 17-mer MUC1-SP-M-peptid (tabel 1) anvendes til at generere polyklonale og mAb’er. MUC1-SP-M blev valgt baseret på et in silico forudsigelse for høj densitet MHC klasse II og B-celleepitoper og på den betydelige koncentration af autoantistoffer imod dette peptid, der findes i sera fra MM patienter [34]. Anti-MUC1-SP-M polyklonale antistoffer (positive sera titer på ≤1:25,000) blev opnået i mus (data ikke præsenteret) og i to immuniserede kaniner R23 og R32 (positiv ved titer ≤1:12,800) (tabel 1 og Fig . 1A venstre panel). Den anti-MUC1 humorale respons viste begrænset krydsreaktivitet (titre af 1:800 fortyndinger) til både eukaryot (BAGE-SP-L, tabel 1 og figur 1A midterste panel.) Og prokaryote (TB-Rv0476 /4941-SP- L, tabel 1 og fig. 1A højre panel) SP’er. De MUC1-SP-M indre epitoper mest anerkendte af R23 var MUC1-SP-S1 og MUC1-SP-S2 (tabel 1, fig. 1B), der begge ligger på MUC1 SP C-terminalen. Konkurrence analyser evaluering specificiteten af ​​de polyklonale antistoffer påvist 50% hæmning af både R23- og R32-afledte antistoffer ved MUC1-SP-M og dens indre epitop MUC1-SP-S2 (figur 1C.). Inhibering af 10% blev opnået ved andre MUC1 SP-epitoper, især MUC1-SP-S4 og MUC1-TRA-L, og af BAGE SP domæne BAGE-SP-L. Baseret på disse resultater, er den minimale epitop af R23 og R32 ligger inden for MUC1-SP-S1 og MUC1-SP-S2-sekvenser, dvs., aminosyrer 12-21.

Specificiteten og defineret minimal epitop af den genererede anti-MUC1 SP polyklonale antistoffer (A-C) og mAbs SPmAb-2.1 og SPmAb-6 (D-E) blev evalueret mod det immuniserende peptid MUC1-SP-M og dens interne epitoper MUC1-SP-S1 til S5, i ELISA-assays. MUC1 s TRA epitop, MUC1-TRA-L, og den ikke-MUC1 SP domænenavn BAGE-SP-L, blev anvendt i disse analyser som negative kontroller.

Efter etablering af MUC1-SP -M immunogenicitet i kaniner, valgte vi at generere mAb i mus. Sera indsamlet fra MUC1-SP-M-immuniserede mus No. 1 (M1) stærkt bundet immuniseringspeptidet, MUC1-SP-M ( 1:12,800 titer) (Fig 1D.), Moderat bundet MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2 og MUC1-SP-S3 ( 1:1800-3600 titre) og svagt bundne MUC1-SP-S4 og MUC1-SP-S5 ( 1:800 titer). Sera undladt at binde MUC1-TRA-L. Bindende eksperimenter med sera fra mus No. 2 demonstreret de højeste titre ( 1:1600) til peptider MUC1-SP-S4 og MUC1-SP-S5 (data ikke vist). Kloningsprocedurerne indsats gav to mAb’er, et med en Ig-y1 isotype, betegnet SPmAb-2.1, og den anden med en Ig-gamma2a isotype, betegnet SPmAb-6. mAb-specificitet blev valideret ved binding og kompetitive assays (fig. 1E) med forskellige frie peptider (tabel 1). MUC1-SP-S2 mest potent hæmmet SPmAb-2.1, mens MUC1-SP-S4 mest effektivt hæmmede SPmAb-6 binding, både definerer de minimale epitoper af de respektive antistoffer.

Anti-MUC1 SP antistoffer binder til MUC1 -positive tumorceller

flowcytometrianalyse demonstrerede moderat-høj SPmAb-2.1, SPmAb-6 og R23IgG binding til MUC1-udtrykkende faste og hæmatologiske tumorer (tabel 2). Den anti-MUC1 TRA mAb H23 [35], der tjente som en positiv kontrol MUC1, viste utvetydigt reaktivitet, med bindingsstyrke svarende til den af ​​de R23IgG antistoffer. I modsætning hertil MUC1-negative melanoma cellelinier, SK-MEL-28 og SK-MEL-1, og MUC-1-negative ovarie cellelinje, ES-2, konsekvent undladt at reagere (lav geometrisk middelværdi) med alle testede antistoffer (tabel 2), hvilket viser antistof selektivitet for MUC1 SP. Yderligere støtte af tumor celle- og MUC1 SP-specificitet af antistofferne, blev leveret af fravær af binding af SPmAb-2.1, SPmAb-6 mAbs og R23IgG antistoffer mod humane hvide blodlegemer, især til CD3

+ T -celler, CD20

+ B-celler og CD14

+ myeloide celler samt til naive normale humane mammae epitelceller (HMEC) (tabel 2).

Anti-MUC1 SP antistoffer lokalisere til membranerne af MUC1-positive tumorceller

lokaliseringen af ​​antigenet genkendt af de forskellige MUC1 SP-antistoffer blev bestemt via imagestream analyse. MUC1 SP tilstedeværelse blev observeret under anvendelse af PE-konjugeret SPmAb-2.1, SPmAb-6-mAb og APC-konjugeret H23 MUC1 TRA mAb, på celleoverfladen af ​​MUC1-positive ovariecellelinie OVCAR-3, mens ingen ekspression iagttoges på MUC1 -negativ ovariecellelinie ES-2 (fig. 2A). De fusionerede billeder af 30000 celler indikerer, at MUC1 SP og MUC1 TRA lokalisere hovedsageligt alene på membranen af ​​cellerne. MUC1 SP blev observeret som en selvstændig membranal domæne, som det fremgår af en enkelt PE

lyse membranal farvning, i 47% og 56% af de analyserede celler, ved behandling med SPmAb-6 og SPmAb-2.1 hhv. En lokalisering af MUC1 SP og MUC1 TRA-molekyler, demonstreret ved en dobbelt PE

lyse /APC

lyse membranal farvning, var minimal, og observeret i 18% og 27% af cellerne udsættes for SPmAb-6 og SPmAb- 2.1, henholdsvis (data ikke vist). En høj lighed mellem MUC1 SP og MUC1 TRA-farvning (ligheden koefficienter 1,0) blev observeret (data ikke vist), hvilket indikerer colokalisering af disse molekyler på meget få udvalgte celler. Yderligere bekræftelse af MUC1-specificiteten af ​​disse antistoffer blev opnået ved specifik binding af anti-MUC1 SP mAb SPmAb-2.1 og den MUC1 TRA mAb H23 til ES-2 MUC1-negative ovarieceller kun efter deres transfektion med MUC1-TM-ekspression konstruere (figur 2B).

celleoverfladen tilstedeværelse og ligheden analyse af MUC1 SP-domænet og MUC1 TRA blev evalueret på OVACAR-3 MUC1-positive og ES-2 MUC1-negativ tumor cellelinier ved imagestream analyse ved anvendelse PE- og APC-mærket anti-MUC1 SP mAb’er SPmAb-2.1, SPmAb-6, og anti-MUC1 TRA H23-mAb (A). Fluorescens mikroskopi analyse blev også udført på ES-2 MUC1-transficeret æggestokkene celler vs. moderselskabet MUC1-negative celler (B). BF står for lyse felt og sekundær står for anti-mus IgG antistoffer.

Anti-MUC1 SP antistoffer binder MUC1-udtrykkende MM plasmaceller i Fresh knoglemarvsaspirater

Frisk opnået knogle marv (BM) aspirater af fire MM patienter blev anvendt til at undersøge, om R23IgG antistoffer binder selektivt primære tumorceller i en ex-vivo, heterogen indstilling. Formodede plasmaceller (PC) blev gated (fig. 3 kolonne A), og deres fænotype blev verificeret ved farvning for kappa let og lambda-kæder (data ikke vist). Den låge population blev næste analyseret for ekspression af MUC1 TRA (fig. 3 kolonne C) og MUC1 SP (fig. 3 kolonne E) på CD138-positive celler. Species-matchede antistoffer for MUC1 farvning kontrol blev anvendt til hvert eksperiment (fig. 3 kolonner B og D). Den CD138-positive PC af BM aspirater af MM patienter # 1, # 2 og # 3 bundet R23IgG (78,2%, 66,3%, 95,9%, henholdsvis af den analyserede cellepopulation) og H23 (78,3%, 59,2%, 93,2% henholdsvis af den analyserede cellepopulation) (fig. 3 kolonner C og E). I modsætning hertil fjerde aspirat (P # 4) viste lav reaktivitet til både H23 og R23IgG (0,37% og 0,45% af henholdsvis den analyserede population), trods moderat CD138 ekspression (74,9% og 39,9% af celler, henholdsvis) i denne aspirat. Som en kontrol, kørte vi en lignende flowcytometri analyse på en BM aspirat afledt af en naiv, rask donor. Celler i denne analyse blev gated for kappa og lambda udtryk, som CD138 ekspressionen var negativ (fig. 3 kolonner F). Resultater (fig. 3 kolonne G og H) bekræftede minimal binding af ~ 1% for både MUC1-TRA og MUC1 SP på begge kappa og lambda-kæder. Sammenfattende disse resultater viser, at R23IgG og H23 specifikt at genkende maligne PC, rendering MUC1 SP et antigen egnet til udvælgelse behandling og overvågning.

Tilstedeværelsen af ​​MUC1 SP domæne celleoverfladen blev evalueret ved gated FACS-analyse på PC celler i friske BM aspirater opnået fra MM patienter (A-E) og normal naive prøve (F-H). Polyklonalt anti-MUC1 SP (R23IgG) blev anvendt til bestemmelse MUC1 SP-ekspression; MUC1 TRA domæne ekspression blev bestemt med H23 mAb. For hvert eksperiment blev species-matched kontrol antistoffer for MUC1-farvning anvendes: enten normalt muse-IgG-FITC (B), eller normalt kanin-IgG-FITC (D). Anti-MUC1 SP mAb (SPmAb-2.1) blev anvendt til bestemt MUC1 SP udtryk; MUC1 TRA domænenavn udtryk blev bestemt med H23 mAb.

Kompliment-afhængig cytotoksicitet medieret af Anti-MUC1 SP antistoffer

oversættelighed af antigen og tumor særlige forhold anti-MUC1 SP antistoffer mod funktionel immunterapeutisk potentiale blev vist ved en effektiv lyse af MUC1-udtrykkende celler ved R23IgG (fig. 4A), SPmAb-2.1 og SPmAb-6 (fig. 4B), hvilket indikerer deres potentiale som anti-tumor effektorer. R23IgG antistoffer medierede 60-100% lyse af faste OVACAR-3 ovarieceller, og af hæmatologiske, U266, RPMI 8226, MM, ARH-77 og Ramos Leukæmi tumorceller. På en tilsvarende måde, SPmAb-2.1 og SPmAb-6 udløst yderst specifik lysis af 90% og 60-80% af henholdsvis de samme cellelinjer. Til sammenligning H23 inducerede lysis af 80-90% af de testede cellepopulationer (fig. 4B). Lysis induceret af alle anti-MUC1 antistoffer var stærkt signifikant (p 0,001 i t-test) i MUC1-udtrykkende tumorcellelinjer, sammenlignet med den ovariecellelinie ES-2, melanomacellelinien SK-MEL-1 og NHEC, tre MUC1-negative cellelinjer. Generelt CDC lysis effekt stærkt korreleret med MUC1 celleoverfladeekspression niveauer, vurderet ved hjælp af flowcytometri-analyse (tabel 2), med undtagelse af SPmAb-6-mAb, der viste høj celleoverflade tilstedeværelse, men moderat CDC.

cytotoksiske egenskaber af anti-MUC1 SP polyklonalt R23IgG (A) og monoklonalt SPmAb-2.1, SPmAb-6-mAb (B) blev evalueret ved CDC-analyse under anvendelse af forskellige faste, ikke-fast, MUC1-positive og -negative tumorer og HMEC. Den MUC1 TRA domænespecifikke mAb H23, NMS og NRS og ingen (W /O) antistoffer blev evalueret som kontroller.

Diskussion

På trods af omfattende forskning vedrørende immunterapeutiske potentiale MUC1 , er der stadig ingen licens produkt mod dette mål. Manglende isolere cellebundne, uopløselige MUC1 epitoper har hindret udviklingen af ​​en effektiv MUC1-relateret immunterapeutisk middel. Betydeligt fremskridt blev foretaget af Rubinstein og kolleger [37] og senest ved Pichinuk og kolleger [24], der producerede antistoffer mod alfa /beta krydset af cellulære MUC1s. Disse antistoffer viste meget selektiv MUC1 binding og induceret cytotoksicitet af MUC1-positive tumorer, når den er bundet til et toksin [24]. Baseret på vores tidligere observationer af naturligt genererede anti-MUC1 SP autoantistoffer i MM patienter, men ikke i naive raske donorer, [34] den aktuelle undersøgelse vedtaget en anden strategi til at målrette den uopløselige MUC1 SP domæne. De R23IgG, SPmAb-2.1 og SPmAb-6-antistoffer vi rejst, specielt bundet MUC1 SP, uden bindende ubeslægtede SP’er (fig. 1A) og MUC1-TRA-epitoper (fig. 1B-E). De minimale epitoper genkendt af disse antistoffer blev placeret i det carboxyterminale af MUC1 SP (fig. 1C og 1E).

Tidligere observationer tyder på, at SP-domæner kunne potentielt direkte proteiner til enten cellemembranen eller det ekstracellulære rum [33]. Uspaltede SP domæner, som i tilfælde af proteaseinhibitorer, såsom plasminogenaktivator inhibitor-2 [38] eller dens chick homolog, ovalbumin [39], guide proteinet til ER og undlader at støtte membran docking, hvilket gav sekretion af det intakt protein. I tilfælde af lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV) precursor glycoprotein C, insertion af proteinet i ER-membranen medieret af en usædvanlig 58 aminosyre-lange SP bærer en udvidet N-terminale region.