PLoS ONE: Cancer Cells Acquire Mitotiske Drug Resistance Properties Gennem Beta I-tubulin Mutationer og Ændringer i Angivelse af Beta-tubulin isotyperne

Abstrakt

Baggrund

Anti-mitotiske forbindelser (mikrotubuli de-stabilisatorer) såsom vincristin og vinblastin har vist klinisk succes med behandling af forskellige kræftformer. Men udvikling af lægemiddel-resistens celler begrænser deres effektiviteter i kliniske situationer. Derfor blev udført forsøg for at bestemme mulige lægemiddel resistensmekanismer i forbindelse med anvendelsen af ​​anti-mitotisk cancerbehandling.

vigtigste resultater

En KB-afledt mikrotubuli de-stabilisator-resistente KB-

L30

cancer cellelinje blev genereret for denne undersøgelse. KB-

L30

celler viste krydsresistens over for forskellige mikrotubuli de-stabilisatorer herunder BPR0L075, vincristin og colchicin gennem flere-drug resistente (MDR) -uafhængige mekanismer. Overraskende, KB-

L30

celler viste hyper-følsomhed til mikrotubuli-stabilisator, paclitaxel. Resultaterne af RT-PCR-analyse afslørede, at ekspressionen af ​​både gruppe II og III β-tubulin blev nedreguleret i KB-

L30

celler i forhold til dens forældre KB cancerceller. Endvidere DNA-sekventering analyse afslørede seks hidtil ukendte mutationssteder stede i exon fire af βI-tubulin-gen. Datamodellering viste, at der er en direkte sammenhæng mellem βI-tubulin mutationer og ændringer i mikrotubulussamling og dynamisk ustabilitet i KB-

L30

celler og denne forudsagte model blev støttet af en øget mikrotubulussamling og reduceret mikrotubuli dynamisk ustabilitet i KB-

L30

celler som vist ved Western blot-analyse.

konklusioner og Signifikans

Vores undersøgelse viste, at disse hidtil ukendte mutationer i exon fire af βI-tubulin induceret resistens til mikrotubuli de-stabilisatorer og hyper-følsomhed over for mikrotubulus stabilisator gennem en ændring i mikrotubulussamling og dynamik i cancerceller. Vigtigt er det, den nuværende undersøgelse viser, at cancerceller kan erhverve lægemiddelresistens evne til antimitotiske forbindelser gennem flere ændringer i mikrotubulus-netværk. Denne undersøgelse yderligere tilvejebragt molekylær information i lægemiddel-selektion til patienter med specifikke tubulin mutationer

Henvisning:. Cheung CHA, Wu S-Y, Lee T-R, Chang C-Y, Wu J-S, Hsieh H-P, et al. (2010) Cancer Cells Acquire Mitotiske Drug Resistance Properties Gennem Beta I-tubulin mutationer og ændringer i ekspression af beta-tubulin isotyperne. PLoS ONE 5 (9): e12564. doi: 10,1371 /journal.pone.0012564

Redaktør: Wen-Liang Zhou, Sun Yat-Sen University, Kina

Modtaget: Juni 21, 2010; Accepteret: August 12, 2010; Udgivet: 3 September, 2010

Copyright: © 2010 Cheung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af murene tilskud NSC98-3114-M-006 til 002 og NSC98-2323-B-400-004 fra National Science Rådet, Taiwan, Kina, DOH99-TD-C-111-004 fra Department of Health , Taiwan, Kina og CA-097-PP-02 fra National Health Research Institutes, Taiwan, Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mikrotubuli er protein filamenter af cytoskelettet bestående af α-tubulin og p-tubulin molekyler. I celler, mikrotubuli filamenter hurtigt vekslende mellem faser af vækst og krympning (dynamisk ustabilitet) under cellecyklussen [1]. Da mikrotubuli spiller afgørende roller i reguleringen af ​​det mitotiske apparat, kan afbrydelse af mikrotubuli inducerer cellecyklusstop i M fase, dannelsen af ​​abnorme mitosespindler, og endelig udløsning af signaler for apoptose. Opdagelsen af, at den cytotoksiske aktivitet af forskellige forbindelser er gennem indgreb mitosespindelen apparat har tiltrukket megen opmærksomhed inden for de sidste to årtier, og mikrotubuli er blevet en attraktiv farmakologisk mål for anticancer drug discovery. Antimitotiske forbindelser, såsom vincristin, vinblastin (mikrotubulus-destabiliserende

Vinca

alkaloid) og paclitaxel (mikrotubulus-stabiliserende taxan) er blevet udviklet til at målrette kræft klinisk [2], [3]. Selvom taxaner og

Vinca

alkaloider er effektive for forvaltningen af ​​forskellige maligniteter, er deres potentiale begrænset af udviklingen af ​​multiresistens (MDR) [4], [5]. MDR er mange faktorer, med én, der fører til resistens medieret af overekspression af transmembrane efflukspumper, nemlig

M

R 170.000 P-glycoprotein (P-gp170 /MDR) og multilægemiddelresistens protein (MRP) [5], [6]. Udover ekspressionen af ​​MDR, yderligere resistensmekanismer til antimitotiske lægemidler er også blevet beskrevet tidligere. Disse omfatter ændringer i tubulin isotype udtryk og mutationer i tubulin-genet [7], [8]. Celler indeholdende mutationer såsom D45Y, S172A, D197N, D224N, S234N, L240I og K350N i klasse I beta-tubulin, har vist sig resistente over for colchicin og

Vinca

alkaloid [7]. På den anden side har celler indeholdende mutationer såsom P173A, Q292E og Y422C i klasse I beta-tubulin vist sig resistente over for epothilon (mikrotubulus stabiliserende middel) [9]. Interessant, overekspression af βIII-tubulin er blevet vist i paclitaxel-resistente celler [10], [11], [12]. Imidlertid kombineres ændringer (vekslinger i i tubulin isotype-ekspression og mutationer i β-tubulin-genet) i mikrotubuli net sjældent påvist i anti-mitotiske resistens over for lægemidler cancerceller.

I denne undersøgelse en mikrotubulus de -stabilizer-resistent cancer cellelinje blev anvendt til at undersøge hidtil ukendte stede i celler, der var i stand til at inducere modstandsdygtighed over for antimitotiske forbindelser ændringer. KB-

L30

er en KB-afledt BPR0L075 (mikrotubuli de-stabilisator) resistent cancer cellelinje. Vores offentliggjort undersøgelse viste, at KB-

L30

celler overudtrykt survivin, hvilket fører til en stabilisering af mikrotubuli netværk og resulterer i modstand mod mikrotubuli de-stabiliserende forbindelser [13]. Men nedregulering af survivin kun delvis genoprettet lægemiddel-følsomhed for mikrotubulus de-stabilisatorer colchicin og BPR0L075, hvilket antyder, at yderligere resistente mekanisme er til stede i denne cellelinie [13]. Her undersøgte vi yderligere mekanismer, der kan være ansvarlig for lægemiddel-resistens over for mikrotubuli de-stabilisatorer i KB-

L30

celler.

Resultater

KB-

L30

celler viser lægemiddel-resistens over for mikrotubuli de-stabilisatorer og hyper-følsomhed til mikrotubuli stabilisator

En KB-afledt BPR0L075-resistent cancer cellelinje, KB-

L30

blev genereret i vores laboratorium. Kort fortalt, KB-

L30

var et monoklonalt cellelinie selekteret for resistens ved kontinuerlig eksponering af den parentale cancercellelinie, KB, at stigende koncentrationer af mikrotubulus de-stabiliserende forbindelse, BPR0L075. KB-

L30

celler dyrkes i mediet med 30 nM BPR0L075 at opretholde sin resistente karakteristiske lægemiddel. Denne specifikke lægemiddelresistent cancer cellelinie er 6 gange mere resistent over for BPR0L075 i forhold til dens parentale celler (tabel 1) (figur 1A). Desuden KB-

L30

celler udviser krydsresistens med en anden mikrotubulus de-stabiliserende midler, colchicin (7 gange resistent) og vincristin (7 gange resistent) (tabel 1) (figur 1B og C) . Overraskende dette lægemiddel-resistent cancer cellelinie er 5 gange mere følsom over for mikrotubulus stabiliserende middel paclitaxel som sammenlignes med KB-celler (tabel 1) (figur 1D).

KB og KB-

L30

celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af BPR0L075 (A), colchicin (B), vincristin (C) og paclitaxel (D) i 3 dage og cellelevedygtighed blev målt ved MTT celleviabilitetstest.

Multiple-drug resistent protein (MDR) ikke er til stede i KB-

L30

celler

Forrige undersøgelse viste, at mikrotubuli de-stabiliserende forbindelse BPR0L075 var lige så effektiv i både MDR /MRP negative og positive cancerceller [14], indirekte antyder, at BPR0L075-modstand KB-

L30

celler udviser drug resistens egenskaber gennem MDR /MRP-uafhængig mekanisme. For yderligere at understøtte ovenstående konklusioner blev RT-PCR udført for at bestemme, om KB-

L30

celler overudtrykt MDR-1. RT-PCR-analyse viste, at hverken KB eller KB-

L30

celler udtrykker MDR-1 (figur 2A). I modsætning hertil blev MDR-1 udtrykt i den vincristin-resistente cancercellelinie, KB-VIN10 (positiv kontrol) (figur 2A). Desuden resultater fra den kvantitative realtids-PCR viste, at en anden vigtig stof efflux pumpe, MPR-1, var ikke over-udtrykt i KB-

L30

celler som i forhold til sine forældre KB-celler (Figur 2B). I modsætning hertil MRP-1 blev overudtrykt i den positive kontrol cellelinie, KB-20a (figur 2B). Tilsammen disse resultater antydede, at KB-

L30

celler induceret resistens til mikrotubuli de-stabilisatorer gennem MDR-uafhængige mekanismer.

ekspressionen af ​​MDR-1 i KB, KB-

L30

og KB-VIN10 celler blev analyseret ved RT-PCR (A). Ekspressionen af ​​MRP-1 i KB, KB-

L30

og KB-20a-celler blev analyseret ved real-time PCR (B). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol i både RT-PCR og real time PCR-analyser.

KB-

L30

celler viser ændringer i beta tubulin isotype udtryk

da KB-

L30

celler induceret BPR0L075 og colchicin-modstand gennem MDR /MRP-uafhængig mekanisme, har andre lægemiddel-resistensmekanismer blevet undersøgt. Det er blevet almindeligt påvist, at ændringer i ekspressionen af ​​p-tubulin isotyper på mRNA-niveauet er relateret til induktion mitotiske lægemiddel-resistens i cancerceller [15], [16]. Her, ekspression af p-tubulin isotyper i KB og KB-

L30

celler blev analyseret ved RT-PCR. På mRNA niveau blev ekspressionen af ​​klasse II og III β-tubulin isotyper reduceret i KB-

L30

celler i forhold til de mikrotubuli de-stabilisatorer følsomme KB-celler (figur 3A). Mængden af ​​klasse II og III beta-tubulin isotyper udtrykt i KB-

L30

celler blev reduceret med 35% og 40% i forhold til sine forældre celler. I modsætning hertil var der ingen signifikant forskel i ekspressionen af ​​klasse I, IV

a og IV

b p-tubulin isotyper mellem de to cellelinjer (figur 3A).

Ekspressionen af ​​forskellige β-tubulin-isotyper i KB og KB-

L30

celler blev analyseret ved RT-PCR. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol (A). RT-PCR og nested-PCR-analyser af exon 1, 2, 3 og 4 i klasse III-β-tubulin gen af ​​KB og KB-

L30

celler. Første bane, KB-celler og anden vognbane, KB-

L30

celler (B). PCR-SSCP analyser af exon 1, 2, 3 og 4 i klasse III-β-tubulin gen af ​​KB og KB-

L30

celler. Første lane, KB celler og anden vognbane, KB-

L30

celler (C).

KB-

L30

celler udviser multiple mutationer i exon fire af βI-tubulin-genet

bidraget af p-tubulin punktmutationer i inducere resistens over for forskellige anti-mitotiske forbindelser blev også beskrevet tidligere [7], [8], [17]. Da klasse I p-tubulin udgør -90% af den samlede intracellulære pool i celler, gensekvensen af ​​βI-tubulin af KB-

L30

celler blev analyseret. Først blev RT-PCR udført for at bestemme om nogen stor skala sekvens insertion eller deletion var til stede i exon 1, 2, 3 og 4 i βI-tubulin-genet fra KB-

L30

celler. Resultater af RT-PCR og gelelektroforese viste ingen signifikante forskelle i den molekylære størrelse (længde) ifølge ethvert af exonerne af βI-tubulin-genet mellem KB-

L30

og KB-celler (figur 3B). Dette resultat indikerede, at stor skala sekvens insertion eller deletion ikke var til stede i βI-tubulin-genet fra KB-

L30

celler. Vi bestemt tilstedeværelsen af ​​enkelt punkt mutation i KB-

på L30

celler ved at udføre Single-konformationspolymorfisme (SSCP) analyse. SSCP er den elektroforetiske separation af enkeltstrengede nukleinsyrer baseret på små forskelle i sekvens (ofte et enkelt basepar), hvilket resulterer i en anden sekundær struktur og en målelig forskel i mobilitet gennem en gel. Her, resultaterne af SSCP-analyse af βI-tubulin genomisk DNA viste ingen mobilitet båndforskydning af exon 1, 2 og 3 i KB-

L30

, sammenlignet med den for KB-celler (figur 3C). Overraskende SSCP analyse viste et mønster skift i exon 4 i βI-tubulin i KB-

L30

celler.

DNA sekventering blev udført til at re-bekræfte ovenstående resultater. I overensstemmelse med resultaterne af både RT-PCR og SSCP-analyse, DNA-sekventering af den βI-tubulin af KB-

L30

celler viste ingen tilstedeværende mutation i dens exon 1, 2 og 3 regioner (data ikke vist). Interessant, DNA-sekventering afslørede multiple mutationer til stede i exon 4 i βI-tubulin af kB-

L30

celler. De sekventering data er resultaterne af mindst to forsøg. Seks punktmutationer blev fundet ved nukleotid 947 fra T til A (sense), 1114 fra A til T, 1145 fra C til T, 1213 fra G til A, 1294 fra G til A og 1310 fra G til T (figur 4A). Disse mutationer svarer til aminosyre mutationer V316D, T372S, S382L, E405K, E432K og G437K (figur 4B).

DNA sekventering af βI-tubulin genomisk DNA afslører seks punktmutationer forekommer i exon 4 (A) . Oversat aminosyresekvens af det muterede exon 4 i βI-tubulin-genet (B). Udtrykket af det muterede βI-tubulin protein og dets inkorporering i mikrotubuli netværk blev afsløret ved immuno-fluorescerende mikroskopi. Celler blev undersøgt med anti-βI-tubulin-antistof (C). Transfektion af det muterede βI-tubulin-gen i KB-celler reducerede lægemiddelfølsomhed til BPR0L075 in vitro (D).

Immunfluorescensfarvning blev udført for at bestemme, om den muterede βI-tubulin-genet havde oversætte til proteiner, blev efterfølgende indarbejdet i mikrotubuli netværk i kB-

L30

celler. KB-

L30

celler blev farvet med anti-βI-tubulin antistof og FITC-konjugeret sekundært antistof. Resultater af immunfluorescerende mikroskopi afslørede, at det muterede βI-tubulin protein var til stede som en del af mikrotubuli net (figur 4C). For at demonstrere at tubulin mutationer var faktisk, som forårsager BPR0L075-resistent fænotype, gen transfektion og overekspression af βI-tubulin-mutant, som indeholder de ovennævnte mutationer blev udført i KB-celler. MTT celleviabilitetstest afslørede, at KB-celler transficeret med det muterede βI-tubulin viste øget resistens mod BPR0L075 (IC

50 11 nM) sammenlignet med celler transficeret med kontrol tom plasmid (IC

50 7 nM) og vildtype βI-tubulin (IC

50 7 nM) (figur 4D). Således udtryk for det muterede βI-tubulin gjorde spille en rolle i narkotika følsomhed over for BPR0L075 i KB-celler.

Computer modellering undersøgelser for βI-tubulin mutationer i BPR0L075 modstand

tubulin mutationer kan være forbundet med enten ændret lægemiddel-bindingssted eller ændringer i mikrotubuli stabilitet. Her blev datamodellering ansat til at give strukturelle indsigt. Den tredimensionale tubulin struktur (PDB-kode: 1SA0) blev anvendt [18] og programmet Discovery Studio 2.1 (Accelrys, Inc) blev påført for at bygge model ved at mutere rester og udføre energiminimering. I denne model det V318D rest (svarende til V316D i KB-

L30

) er placeret i colchicin-bindingsstedet på βI-tubulin (figur 5A). Val318 (vildtype) dannet hydrofobe interaktioner med colchicin. Men den muterede rest (V muteret til D) forskydninger væk fra colchicin til dannelse af en hydrogenbinding med rest R320, hvilket resulterer i tab af hydrofob interaktion med colchicin (figur 5A) i modelundersøgelse. Dette resultat indikerer, V318D kan svække bindingsaffiniteten af ​​colchicin til p-tubulin. På den anden side, mutationer af rest 392 (placeret i Helix 11) og rest 382 (placeret i sløjfen nær Helix 11) ændrer konformationen af ​​Helix 11, som kan øge de langsgående interaktioner og dermed ændre stabiliteten af ​​mikrotubuli (figur 5B ) [19]. E415K (svarende til E405K i KB-

L30

) er placeret i H11-H12 region nær dimer interface, der er involveret i langsgående kontakter. Rest 415, muteret fra Glu til Lys, bryder brint-bond interaktioner med rester K402 og dermed fører til flytning af K402 tættere på α-tubulin. Skiftet af K402 rest (figur 5C) fører til at lukke kontakter med rester? V260, Y262 og W346 i α-tubulin, øge samspillet mellem β-tubulin og α-tubulin. Helix 11 er placeret i grænsefladen af ​​α-tubulin og β-tubulin dimer. Konklusionen er, at datamodellering undersøgelse viser, at tubulin mutationer i KB-

L30

celler kan øge mikrotubulussamling og stabilitet.

KB-

L30

celler udviser øget mikrotubulussamling og reducerede mikrotubulusdynamik

for at afgøre, om stabilitet og dynamik mikrotubuli i KB-

L30

celler blev påvirket af mutationer i βI-tubulin, som bygger af beregningsmæssige analyse, Western blot-analyse blev udført. Her afslørede Western blot-analyse, at mængden både α- og β-tubulin pellets stede i KB-

L30

celler blev øget sammenlignet med dens parentale KB-celler (figur 6A). I modsætning hertil den opløselige form af β-tubulin stede i KB-

L30

celler blev reduceret sammenlignet med KB-celler (figur 6A). Immunofluorescens-farvning blev også anvendt til yderligere at støtte den ovennævnte resultat. Mikrotubuli blev mærket med rodamine-konjugeret anti-β-tubulin-antistof og celler blev set under mikroskop. KB-

L30

celler synes at have højere mikrotubulus indhold sammenlignet med KB-celler (figur 6B). Desuden er anvendelsen af ​​mikrotubulus de-stabilisator, BPR0L075, var i stand til at reducere mikrotubulus indhold i KB-

L30

celler (figur 6B). Tilsammen vores resultater foreslog, at KB-

L30

celler udviste øget mikrotubuli forsamling.

Mængden af ​​opløselige og uopløselige α- og β-tubulin i KB og KB-

L30

celler blev analyseret ved Western blotting. Actin blev anvendt som en loading kontrol (A). Integriteten af ​​mikrotubuli netværk i KB og KB-

L30

celler viste ved immuno-fluorescerende mikroskopi. Celler blev undersøgt med anti-β-tubulin-antistof (B). Mikrotubulusdynamik i cellerne blev analyseret ved western blot-analyse. Acetyleret α-tubulin blev anvendt som en indirekte indikator for mikrotubulusdynamik og mængden af ​​acetyleret α-tubulin blev analyseret i BPR0L075 og paciltaxel-behandlede KB-celler ved Western blotting. Alpha-tubulin (total form) blev anvendt som indlæsning kontrol (C). Mængden af ​​det endogent acetyleret α-tubulin i KB og KB-

L30

celler blev analyseret ved Western blotting. Alpha-tubulin (total form) blev anvendt som indlæsning kontrol (D).

mikrotubulus dynamisk ustabilitet er kendetegnet ved bratte stokastiske overgange mellem faser af udvidelse og afkortning. På molekylært niveau, er forøget α-tubulin acetylering anses for at være en markør for den reducerede dynamik mikrotubulus. Her, afslørede Western blot-analyse, at mængden af ​​acetyleret α-tubulin blev reduceret i BPR0L075-inkuberet KB-celler i en koncentrationsafhængig måde (figur 6C). I modsætning hertil blev mængden af ​​acetyleret α-tubulin steg i paclitaxel-inkuberet celler (Figur 6C). Mikrotubulus de-stabilisator blev fundet at fungere i inducere mikrotubulus dynamisk ustabilitet og mikrotubulus stabilisator blev fundet fungerer reducere mikrotubulus dynamisk ustabilitet [20], [21]. Således kan mængden af ​​acetyleret α-tubulin stede i celler være relateret til følsomheden af ​​celler til forskellige antimitotiske forbindelser. For at bestemme om KB-

L30

celler udviste reducerede mikrotubulusdynamik, Western blot-analyse blev anvendt til at bestemme niveauet af α-tubulin acetylering stede i lægemiddel-resistente celler. Her afslørede Western blot-analyse, at mængden af ​​acetyleret α-tubulin blev forøget i KB-

L30

celler, sammenlignet med KB-celler (Figur 6d). I overensstemmelse med forudsigelsen fra den beregningsmæssige model, afslørede vores resultater, at KB-

L30

celler udviste både forbedret mikrotubuli stabilisering og reducerede mikrotubulusdynamik. Endvidere indikerer vore data, at ændringen af ​​mikrotubulus stabilitet og dynamisk i KB-

kan L30

celler være forårsaget af tilstedeværelsen af ​​muterede βI-tubulin, hvilket resulterer i modstanden mod mikrotubuli de-stabilisatorer og hyper-følsomhed over for mikrotubuli stabilisatorer.

Discussion

Anti-mitotiske forbindelser har vist succes til behandling af forskellige cancerformer. Men udvikling af lægemiddel-resistens celler begrænser deres effektiviteter i kliniske situationer. Derfor er det vigtigt at bestemme mulig medikamentresistens mekanisme vedrørende anvendelsen af ​​anti-mitotisk cancerterapi. Positiv korrelation mellem ekspressionen af ​​multiresistens proteiner MDR-1, MRP-1 og induktion af lægemiddelresistens til antimitotiske forbindelser i cancere er blevet bredt rapporteret tidligere [4], [5]. Imidlertid menes lægemiddelresistens til antimitotiske forbindelser i cancerceller at være multifaktoriel. Her viste vi, at BPR0L075-resistente KB-

L30

celler udtrykker ikke MDR-1 og MRP-1. Vigtigt er det nuværende studie indentifies hidtil ukendte lokaliteter af mutation i exon 4 i βI-tubulin, som er i stand til at inducere både medikamentresistens til mikrotubuli de-stabilisatorer og hyper-følsomhed til mikrotubulus-stabilisatorer gennem begge ændringer i den lægemiddel-bindingssted og mikrotubulus stabilitet.

BPR0L075-resistente KB-

L30

celler, der anvendes i denne undersøgelse synes at erhverve resistente egenskaber gennem MDR /MRP-uafhængige mekanismer. For det første gjorde KB-

L30

celler ikke udtrykke to af de mest almindelige narkotika efflukspumper, MDR-1 og MRP-1. Derudover, i modsætning til traditionelle mikrotubuli inhibitorer, såsom vincristin og paclitaxel, BPR0L075 er effektive til at undertrykke cellevækst af begge MDR /MRP-positive og -negative tumorcellelinjer [14].

In vivo

viste BPR0L075 kraftig aktivitet mod vækst af xenograft tumorer i gastrisk carcinoma MKN-45, humant cervikalt carcinom KB, og KB-afledt P-gp170 /MDR -overexpressing KB-VIN10 celler i nøgne mus [14]. Imidlertid BPR0L075 var ineffektiv til induktion død KB-

L30

celler i denne undersøgelse. Derfor er vores undersøgelse viste, at MDR /MRP ikke spillede en vigtig rolle i modstanden mod mikrotubuli de-stabilisatorer som BPR0L075, colchicin og vincristin i KB-

L30

celler.

Da MDR og MRP ikke spiller en vigtig rolle i induktionen af ​​lægemiddelresistens i KB-

L30

celler, andre lægemiddelresistensmekanismer skal være til stede i cellerne. Tubulin-bindende forbindelser, såsom vincristin, colchicin og paclitaxel, hæmmer udviklingen af ​​cellemitose gennem hæmning af den dynamiske dannelse af mitotiske spindel under G

2 /M-fasen. Derfor mutationer i lægemiddeltarget, tubulin, kan påvirke effektiviteten af ​​anti-mitotiske forbindelser. Faktisk har mutationer i både α- og β-tubulin i ovarieceller fra kinesisk hamster vist sig at resultere i resistens mod colchicin og vinblastin [8]. Desuden har mutationer i β-tubulin i ovariecancerceller blevet vist at resultere i resistens over for epothilon og taxaner [22]. I denne undersøgelse blev seks nye mutationssteder fundet stede i βI-tubulin-genet fra KB-

L30

celler. Disse mutationer svarer til aminosyre mutationer V316D, T372S, S382L, E405K, E432K og G437K. Disse mutationssteder er vist i exon fire regioner i stedet for exon et, to og tre, der tidligere er blevet identificeret [7]. Dette er særligt vigtigt, da mutationer i exon fire i forårsager antimitotisk lægemiddelresistens er mindre demonstreret ved sammenligning med exon 1, 2 og 3. I denne undersøgelse overekspression af de mutante tubulins (indeholdt flere muterede-sites) i KB-celler reducerede lægemiddelfølsomhed til mikrotubulus de-stabiliserende forbindelse BPR0L075 sammenlignet med celler transficeret med tom vektor eller vildtype tubulin. De små forskelle mellem celler transficeret med muteret-tubulin og vildtype tubulin var sandsynligvis på grund af den store mængde af det endogent udtrykte vildtype tubulin til stede i de transficerede KB-celler. Transfektion af konstruktioner, der indeholder β-tubulin med forskellige single site mutation i KB-celler blev også udført for at bestemme, hvorvidt en specifik enkelt sted mutation i genet var faktisk nok til at forårsage lægemiddelresistens til BPR0L075 (data ikke vist). Men resultaterne af vores undersøgelse viste ingen signifikant forskel i lægemiddelfølsomhed mellem celler transficeret med mutant (single site mutation) og vildtype βI-tubulin (data ikke vist). Dette resultat kan muligvis forklares ved de følgende: 1) de mutationssteder ikke direkte placeret på specifikt lægemiddel bindingssteder og 2) den tredimensionelle struktur af βI-tubulin blev ikke signifikant ændret ved enhver enkelt site mutation, som blev afsløret i denne studere. I stedet kan alle seks mutationer til stede på exon 4 sammen bidrager til ændring af βI-tubulin tre dimensionelle strukturer, hvilket resulterer i ændringer af narkotika følsomhed i KB-

L30

celler.

Med brugen af ​​datamodellering, blev mutant regioner i den beregningsmæssige model, som vi forudsagde analyseret for at sammenligne med stigningen eller faldet af samspillet før og efter mutationer. I vores model, blev placeringen af ​​βI-tubulin mutationer identificeret, og de deraf kropsbygning ændringer i βI-tubulin protein blev bygger med potentielle virkninger på mikrotubuli samling og stabilitet. Efter aftale med den beregningsmæssige model, blev forøget tubulin polymer niveauer observeret i BPR0L075-resistente KB-

L30

celler i forhold til dens narkotikarelaterede følsomme parentale celler (Figur 6A og 6B). Desuden blev niveauet af acetyleret α-tubulin også steget i KB-

L30

celler (figur 6D), hvilket indikerer, at reduceret mikrotubulus dynamisk ustabilitet var til stede i dette specifikke cellelinie. En rolle for ændrede mikrotubulus polymerniveauer i vincristin modstand af akut lymfoblastisk leukæmi er blevet påvist

in vivo

tidligere [23]. Desuden blev en vincristin-resistente xenograft med høje niveauer af polymeriseret tubulin vist relativt følsom over for mikrotubulus, polymeriserende lægemiddel paclitaxel [23]. Desuden rapporteret, også en undersøgelse, at den dynamiske ustabilitet af mikrotubuli af paclitaxel-resistente A549-T12 kræftceller blev væsentligt forøget i forhold til sine forældre celler [24]. Således forbedrede mikrotubulus-polymerisation og reduceret dynamisk ustabilitet forårsaget af tubulin mutationer kan repræsentere en overlevelse mekanisme mod mikrotubuli de-stabiliserende forbindelser. På den anden side kan den forstærkede mikrotubulus polymerisation og reduceret dynamisk ustabilitet forbedre effektiviteten af ​​mikrotubuli-stabiliserende forbindelser, såsom paclitaxel. Faktisk vor offentliggjorte undersøgelse viste, at nedregulering af survivin (IAP) induceret mikrotubulus de-polymerisation, hvilket resulterer i øget medikament følsomhed KB-celler til colchicin og BPR0L075 [13]. Endvidere samme behandling delvist gendannet følsomhed KB-

L30

celler til BPR0L075 gennem processen mikrotubulus de-polymerisation [13]. Men nedregulering af survivin ikke påvirker aktiviteten af ​​caspaser [13]. Tilsammen disse resultater viste, at balancen mellem polymeriseret og ikke-polymeriseret tubulin kan være en vigtig faktor for reaktion på anti-mitotiske kemoterapi.

Det er også værd at bemærke, at nedregulering af βII- og βIII-tubulin isotyper blev observeret i KB-

L30

celler. Litteratur afslørede, at overekspression af βIII-tubulin induceret paclitaxel- og docetaxel-modstand i cancerceller [7], [10], [16]. Højt niveau af βIII-tubulin ekspression blev også vist at være associeret med resistens over for paclitaxel og nedsat overlevelse hos patienter med carcinom [25]. Interessant, en nylig undersøgelse fra Tseng

et al.

Har givet en mulig forklaring på dette fænomen. Matematiske og beregningsmodeller af deres undersøgelse viser, at mikrotubuli de-stabiliserende midler, colchincine og dets derivater, binder stærkest til βIII-tubulin som sammenlignes med andre b-tubulin isotyper [26]. Således kan ændringer i ekspressionen af ​​βIII-tubulin ændre følsomheden til colchicinderivater der inhiberer polymerisationen af ​​mikrotubuli. Derfor kan nedregulering af βIII-tubulin også medvirke til at øge følsomhed over for paclitaxel og nedsat følsomhed over for colchicin /BPR0L075 i KB-

L30

celler.

Som konklusion viste vi at nye mutationer i exon 4 i βI-tubulin induceret resistens til mikrotubuli de-stabilisatorer og hyper-følsomhed over for mikrotubulus stabilisator gennem ændring i mikrotubulussamling og dynamik i cancerceller. Denne rapport indikerer endvidere, at cancerceller kan ændre stabiliteten og dynamikken i mikrotubuli netværk via flere mekanismer, såsom tubulin mutationer og differential isotype udtryk samtidigt, hvilket resulterer i resistent over for anti-mitotisk cancerterapi. Resultaterne af denne undersøgelse giver molekylær information i udvælgelsen lægemiddel til patienter med specifikke tubulin mutationer og har også stor betydning for udviklingen af ​​fremtidens antimitotiske forbindelser, der er i stand til at målrette resistente kræftceller. Ikke desto mindre er der behov for yderligere undersøgelser for at fastslå, om disse specifikke βI-tubulin mutationer kan findes i kliniske prøver (efter behandling), og dens korrelation til resistens.

Materialer og metoder

Cellelinjer , antistoffer og reagenser

Humane orale carcinomceller (KB) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Denne specifikke cancer cellelinje blev også beskrevet som en HeLa kontaminant af ATCC. KB og KB-afledte kB-

L30

celler blev dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco, Grand Island, NY), suppleret med 5% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og L-glutamin (0,29 mg /ml) ved 37 ° C. Antistofferne anvendt i denne undersøgelse omfattede: et muse-anti-αtubulin antistof (Upstate cellesignalering, Lake Placid, NY), en muse-anti-βtubulin antistof (BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ) og et muse-anti-actin-antistof (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA).

Etablering af KB-afledte BPR0L075-resistent cellelinje

Humane orale carcinomceller (KB) blev dyrket i RPMI 1640 medium som tidligere beskrevet.