PLoS ONE: nedregulering af Claudin-18 er forbundet med proliferativ og invasive potentiale mavekræft på Invasive Front

Abstrakt

Baggrund

Claudins er kendt som stramme junction proteiner, og deres ekspressionsmønster i mavekræft er stadig kontroversiel. Forholdet mellem udtrykket mønstre af tight junction proteiner og tumor spredning i begyndelsen mavekræft er stadig langt fra klart.

Mål

For at undersøge udtrykket mønstre af claudin-18 og Ki-67 i tidlig mavekræft på den invasive front og omgivende normale maveslimhinden og undersøge den biologiske funktion af claudin-18 i spredning og invasion af kræftceller.

Metoder

Seventy-fem tidlig mavekræft læsioner fjernet via endoskopisk slimhinde resektion eller endoskopisk submucosa resektion blev evalueret. Alle mavekræft læsioner blev diagnosticeret som differentieret adenokarcinom ved hjælp af den japanske Klassificering af gastrisk karcinom. For at vurdere epitelproliferation, immunfarvning med Ki-67 blev udført, og indekset mærkning blev beregnet. For at vurdere ekspressionen af ​​epiteliale tight junctions proteiner, blev immunfluorescensfarvning af claudin-18 udført. Immunoreaktiviteten af ​​claudin-18 blev gradueret i forhold til antallet af farvede celler. Korrelation analyse blev udført ved Spearman rang korrelationskoefficient. Transfektion af claudin-18 lille interfererende RNA (siRNA) udførtes i MKN74, en claudin-18-positive gastrisk cancercellelinie, at undersøge effekten af ​​claudin-18 på proliferation og invasion af cancerceller.

Resultater

Claudin-18 var signifikant nedreguleret i mavekræft i forhold til omgivende gastrisk normal slimhinde eller tarm metaplasi. Ki-67 mærkning indeks mavekræft på invasiv fronten var omvendt korreleret med claudin-18 niveau, men at der på slimhinde læsionen ikke var korreleret. Claudin-18 knockdown væsentligt fremmet udbredelsen af ​​MKN74 sammenlignet med kontrol siRNA-transficerede celler. MKN74 invasion steg markant med claudin-18 siRNA transfektion sammenlignet med kontrol siRNA transfektion.

Konklusioner

Nedregulering af claudin-18 er forbundet med den proliferative potentiale på den invasive foran mavekræft, tyder på, at den har en central rolle i gastrisk kræft progression

Henvisning:. Oshima T, Shan J, Okugawa T, Chen X, Hori K, Tomita T, et al. (2013) nedregulering af Claudin-18 er forbundet med proliferativ og invasive potentiale mavekræft på Invasive Front. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10,1371 /journal.pone.0074757

Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 28. maj 2013; Accepteret: August 6, 2013; Udgivet: 20 September, 2013

Copyright: © 2013 Oshima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan gennem en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) 2010-2012 (nr 22.590.691). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindeligt diagnosticeret malignitet og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1], [2]. Intramucosal GC kan kurativt behandlet ved endoskopisk behandling. Desuden har endoskopiske submukøse dissektion (ESD) teknik udvidet indikationerne for endoskopisk behandling og aktiveret en bloc resektion af intramucosal store og lidt submukøst invasiv tidlig GC’er [3]. En en bloc resektion af ESD muliggør nøjagtig diagnose af kræft dybde [4].

Stramme vejkryds (TJs) er specialiserede membran domæner på den mest apikale region af polariseret epitelial og endotelceller [5]. Claudins er de store TJ proteiner; de består af mindst 27 medlems proteiner og udtrykkes i et væv-specifik måde [6], [7]. De regulerer paracellulær permeabilitet og etablere epitelcelle polaritet ved deres hegn funktion [6], [8]. En voksende mængde nye oplysninger tyder på, at claudins er vigtige strukturelle og funktionelle komponenter af TJ tråde [6], [9], og de kan spille en afgørende rolle i tumorigenese og inflammation [10], [11].

Den gastriske epithel udviser en række ændringer i claudin udtryk fra normal slimhinde til tarm metaplasi og adenocarcinom. Selvom GC’er nylig blev klassificeret af mucin-baserede udtryk [12], [13], er også blevet foreslået en claudin-baserede GC klassifikation [14]. Vi har også rapporteret, at nedregulering af claudin-3 var relateret til spredning af intramucosal GC [15]. For nylig blev claudin-18 knock-out mus vist at have gastrisk mucosal atrofi og paracellulær H

+ ion lækage [16]. Claudin-18a2 blev vist at være ofte nedreguleret i GC af en intestinal fænotype, hvilket antyder, at claudin-18a2 ville være en god markør for GC [17]. Men den biologiske funktion af claudin-18, der kan være involveret i cancer celle adfærd, er aldrig blevet undersøgt. Endvidere er det ikke klart, hvilken karakteristisk for GC-celler ved den invasive fronten er relateret til den hurtige vækst eller aggressivitet invasion.

I den foreliggende undersøgelse, ekspressionsniveauet af claudin-18 i GC på den invasive foran og omgivende maveslimhinden blev undersøgt for første gang, og sammenhængen mellem de claudin-18 niveau og Ki-67 mærkningsindeks (LI) i GC blev evalueret. Effekten af ​​claudin-18 om spredning og invasivitet

in vitro

blev også undersøgt.

Materialer og metoder

Patienter

En fortløbende serie af 74 patienter med tidlig GC blev undersøgt (tabel 1). GC læsioner (n = 75), som var undergået helbredende EMR eller ESD blev evalueret. GCS med submukøse invasion (n = 31) blev inkluderet i denne undersøgelse. Dobbelt kræftformer blev opdaget kun i en mandlig patient. Alle af GC blev klassificeret som differentieret adenocarcinom ved hjælp af den japanske klassificering af gastrisk karcinom [18]. Patient anonymitet blev bevaret. Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki og blev godkendt af den etiske komité /Institutional Review Board of Hyogo College of Medicine. Emnet gav skriftligt informeret samtykke.

Immunhistokemi

Prøver blev fikseret med 10% formalin løsning og indlejret i paraffin. Snit blev skåret til 3 um tykkelse og blev farvet med hematoxylin og eosin (HE). For at vurdere epitelproliferation blev prøver inkuberet med Ki-67 monoklonalt antistof (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) efterfulgt af inkubation med biotinyleret heste-anti-muse-sekundært antistof (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Streptavidin-biotin kompleks metode (Vector Laboratories) blev anvendt til at visualisere immunoreaktiviteten. Kerner blev modfarvet med hematoxylin.

immunfluorescensfarvning af forbindelsesepitoper Proteiner Salg

Rabbit anti-claudin-18-polyklonalt antistof (Invitrogen) og Cy3-konjugeret gede anti-kanin IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove , PA, USA) sekundært antistof blev anvendt til at visualisere immunoreaktivitet. Specificiteten af ​​reaktionen blev testet ved inkubering med ikke-immunt kaninserum (Dako, Glostrup, Danmark).

Scoring af immunfarvning af Claudin-18 og Ki-67

Immunoreaktivitet blev vurderet ved to uafhængige observatører (T.Ok., XC), og begge var blinde for de klinisk-patologiske træk og kliniske resultater er forbundet med hver prøve. Ikke neoplastisk maveslimhinden uden tarm metaplasi (ikke-IM) og med intestinal metaplasi (IM) og kræft regioner blev vurderet. Immunoreaktiviteten af ​​claudin-18 blev bedømt efter følgende kriterier: 0, fravær af membranfarvning; 1+, færre end 10% af tumorcellerne med komplet membran plet; 2+, 10% og 50% af tumorcellerne med komplet membranfarvning; 3+, mere end 50% til 75% af tumorcellerne med komplet, stærk membran farvning; og 4+, mere end 75% af celler med komplet, meget stærk membran farvning. Fem high-power felter blev analyseret i hver region af sagerne, og den gennemsnitlige score blev beregnet. Alle snit blev scoret to gange for at bekræfte reproducerbarheden af ​​resultaterne. Ki-67 LI blev beregnet efter tælling 1000 kræftceller.

Små interfererende RNA (siRNA) Knockdown eksperimenter

For siRNA lyddæmpning af menneskelig claudin-18, ON-TARGET plus SMARTpool og en ikke -specifik kontrol siRNA blev indkøbt fra Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). Den MKN74 cellelinje (japansk Indsamling af Research Bioressourcer Cell Bank, Osaka, Japan), som er

CLDN18

-positiv, blev valgt til at undersøge virkningerne af claudin-18 knockdown på spredning og invasion egenskaber GC celler . Celler blev transficeret med 25 nM siRNA hjælp DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Kontrol- og kontrol siRNA grupper blev behandlet med de transfektionsreagenser uden siRNA og transfektionsreagenser med ikke-specifik kontrol siRNA hhv. Assays blev udført 3 dage efter de MKN74 celler blev transficeret.

celleproliferationsassay

Celleproliferation blev bestemt ved en kolorimetrisk assay af cellelevedygtighed baseret på spaltningen af ​​tetrazoliumsaltet WST-1 ved mitokondrie dehydrogenaser (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). Absorbansen af ​​den formazan farvestof dannet, som korrelerer med antallet af metabolisk aktive celler i kulturen, blev målt ved 450 nm 1 time efter tilsætning af reagens.

Invasion Assay

MKN74 celleinvasion blev analyseret i 24-brønds BioCoat Matrigel invasion kamre (8 um, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) ifølge fabrikantens protokol. De nedre kamre blev fyldt med RPMI1640 med 10% FBS, og cellerne (2 × 10

5) blev anbragt i indsatsen kamre, som indeholdt RPMI1640 uden FBS. Efter 24 timers inkubation blev ikke-invasive celler fjernes med en vatpind. De celler, der er migreret gennem membranen og fastgjort til den nedre overflade af membranen blev fikseret med 10% formalin og farvet med hematoxylin. For kvantificering blev cellerne talt under et mikroskop i fem tilfældige high-power felter. Analyser blev udført tre gange. Invasionen ratioen til kontrolmedium blev beregnet.

Statistical Analysis

Statistisk evaluering blev udført under anvendelse SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Korrelation analyse blev udført ved Spearman rang korrelationskoefficient (RS). Multiple sammenligninger blev udført under anvendelse af Kruskal-Wallis test efterfulgt af Scheffe test. Single sammenligninger blev udført af Mann-Whitney-test.

P

. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Angivelse af Claudin-18 i maveslimhinden og Carcinoma

I alt 75 differentierede GC sager blev analyseret i denne undersøgelse. Snittene blev farvet med claudin-18, og niveauet af farvning blev gradueret. Claudin-18 blev påvist i høje niveauer i gastriske epitelceller ved de apikale og laterale side grænser i ikke-IM, men ikke i IM eller differentierede adenocarcinomceller (fig. 1A). Niveauerne af claudin-18 var signifikant lavere i cancerceller end i ikke-IM og IM, såvel som betydeligt lavere i IM sammenlignet med ikke-IM (fig. 1B).

(A) HE farvning af maveslimhinden med ikke-intestinal metaplasi (ikke-IM), intestinal metaplasi (IM), og cancer. Claudin-18 påvises i maveslimhinden med ikke-IM ved overfladen grænsen og lateral membran af epithelcellerne, men ikke med IM eller cancer. Hvid bar = 100 um, Gul bar = 50 um. (B) Claudin-18 niveau er betydeligt lavere i GC end i ikke-IM eller IM. Niveauet er også betydeligt lavere i IM end hos ikke-IM.

#

P

0,05 vs. IM. **

P

. 0,01 vs. non-IM

Påvisning af Claudin-18 i GC’ers med Submukøs Invasion

Repræsentative GC tilfælde med submucosa invasion viste at tætte claudin-18-farvning var tydelig ved den invasive foran submukøst invaderede-cancerceller, og Ki-67 LI var lav på læsionen (fig. 2A). I en sag med lav claudin-18 farvning på den invasive foran submukøse invaderet-cancerceller, var Ki-67 LI høj ved læsionen (fig. 2A).

HE farvning viser tilfælde af submukøse invasiv GC. Ki-67 positive kerner opdages i kræftcellerne. Ki-67 LI er lav i et tilfælde af submukøst-positive claudin-18-farvning (3+) (venstre) og høj i et tilfælde af submukøst-negative claudin-18-farvning (0) (højre). Bar = 100 um. (B) Ki-67 LI er omvendt korreleret med den claudin-18 niveau (rs = -0.550,

P

= 0,0010).

Korrelation af Claudin-18 niveau og Ki-67 LI

Ki-67 LI af GC i mucosa og submucosa blev bestemt ved procentdelen af ​​Ki-67-positive kerner. At bestemme korrelationen mellem Ki-67 LI og claudin-18 niveau, udførtes korrelationsanalyse. Den mucosale Ekspressionsniveauet af claudin-18 blev ikke signifikant korreleret med Ki-67 LI (rs = 0,07,

P =

0,60). På den anden side blev det submukøse claudin-18 ekspressionsniveauet signifikant omvendt korreleret med det submukøse Ki-67 LI (rs = -0,550,

P

= 0,0010) (fig. 2B).

Effekt af claudin-18 siRNA om spredning og invasion af GC Celler

En GC-cellelinje, MKN74, konstitutivt udtrykte claudin-18, og mRNA niveau af claudin-18 blev signifikant reduceret med siRNA mod claudin- 18 (fig. 3A). Immunofluorescens farvning med claudin-18 også faldt efter transfektion (fig. 3B). I claudin-18 nedreguleret MKN74, cellevækst blev signifikant forøget (fig. 4A), og invasionen af ​​cellerne blev signifikant forøget (fig. 4B).

(B) Farvning af claudin-18 er reduceret med claudin-18 siRNA behandling. Bar = 50 um. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SD af 3 uafhængige forsøg. **

P

0,01 vs. kontrol eller kontrol siRNA

(A) Claudin-18 siRNA behandling signifikant inducerer celleproliferation.. (B) claudin-18 siRNA-transficerede MKN74 celler viser en signifikant højere invasion forholdet sammenlignet med kontrol eller kontrol siRNA-transficerede celler. Typiske billeder præsenteres på toppen. Bar = 500 um. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SD af 3 uafhængige forsøg. **

P

. 0,01 vs. kontrol eller kontrol siRNA

Diskussion

Ændret udtryk for claudins på submukøse invasive fronten kan være relateret til progression af GC. Nylige undersøgelser tyder på, at selv i lidt submukøse invasiv GC uden lymfe og vaskulær invasion, kan ESD være muligt som en helbredende operation [19]. Men det er stadig ikke klart, hvilke tilfælde af lidt submukøse invasiv GC kan følges uden yderligere operation efter ESD. I den foreliggende undersøgelse blev det konstateret, at der var en omvendt korrelation mellem claudin-18 niveau og Ki-67 positivitet på den invasive foran submukøst invasiv GC, og at claudin-18 reguleret GC celleinvasion og proliferation. Ki-67 immunhistokemi er blevet erstattet af mitotisk tælling ved vurderingen tumorcelleproliferation. Undersøgelser har vist, at Ki-67 er korreleret med udifferentierede og metastatiske celler i maligniteter [20]. I denne undersøgelse blev kun EMR /ESD-resekteret GC hvori indikationen er begrænset til den differentierede type GC undersøgt. Derfor er disse data viste, at Ki-67 niveau ved invasiv fronten var relateret til metastatiske celler i maligniteter, og at tab af claudin-18 var en af ​​markørerne for GC aggressivitet og kan være relateret til udvikling af metastase, hvilket nødvendiggør yderligere kirurgi efter ESD behandling

Claudins er unormalt reguleret i en række forskellige maligniteter såsom GC, hepatocellulært carcinom, galdevejene karcinom, brystcancer, renalcellecarcinom, og mesotheliom [15], [21] -. [ ,,,0],25]. Ændringen i claudins i kryds er forbundet med tab af stram vedhæftning og polaritet i epithel. Tab af polaritet er forbundet med øget celleproliferation og epitel-til mesenkymale overgang, mens forstyrrelser i tight junction komplekser ændre celle-celle interaktioner, som er relateret til invasion og metastase [23], [26], [27]. I observationsstudier fald i claudin-3 og -4 er blevet rapporteret i GC celler på den invasive front og viste sig at korrelere med kræft progression og metastase [14]. Nedregulering af claudins er også blevet rapporteret i nogle andre epiteliale tumorer, herunder tab af claudin-1 i brystkræft [28] og colon cancer [29], samt tabet af claudin-7 i brystkræft [30] og hoved- og halscancer [31]. Med hensyn til invasion af tumorceller, reduceret ekspression af claudin-7 ved den invasive foran viste sig at være korreleret med dybden af ​​invasion og lymfe involvering i pladecellecarcinom i spiserøret [32]. Selvom claudin-3 og claudin-7 udtryk var lavere i det submukøse invasiv foran end i slimhindelæsioner i vores tidligere undersøgelse blev claudin-3 og claudin-7 niveauer på invasive fronten ikke korreleret med Ki-67 LI [15]. På den anden side blev claudin-18 ved den invasive fronten omvendt korreleret med Ki-67 LI i den foreliggende undersøgelse. Disse data kan være relateret til de fund, claudin-3 og claudin-4 ikke var relateret til lymfeknude metastaser [33]. Desuden kan disse observationsstudier ikke forklare, om disse ændringer direkte påvirker tumor invasion og metastase.

Claudin-18 er hovedsageligt udtrykkes i maven og lunge epitelceller. Claudin-18a2 er den form for maven, og isoformer er lidt anderledes. I en tidligere rapport, blev gastrisk typen claudin-18 tabt i GC’er [17]. Men under intestinal metaplasi, ekspressionsmønsteret for claudins allerede afviger fra den normale gastriske epiteler. Forsvinden af ​​claudin-18 viste sig at være forbundet med intestinal metaplasi i maven [17]. Derfor kan tabet af claudin-18 ekspression i avanceret GC [17] ikke blot demonstrere karakter af canceren. Selv i færd med GC progression, kan ekspressionsniveauet ændres. At udforske funktionen af ​​disse mål-molekyler, vi troede, det var vigtigt at undersøge tumorer på samme stadie, og vi evaluerede niveauet for claudin-18, der kan påvirke invasion og metastase, i lidt submukøse invasive GC læsioner. Endvidere kan maveslimhinden claudin-18 ikke fungere på TJs, fordi det udtrykte lokalisering på celleoverfladen ikke var lige på TJs. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge fysiologiske og patofysiologiske TJ protein udtryk ved den laterale membran.

For at undersøge, om de ændringer i claudin-18 niveauer på submukøse invasive fronten bidraget til spredning og invasion af kræftceller, en siRNA fremgangsmåde blev anvendt til at knockdown proteinet i MKN74 GC-cellelinien, hvilket er positivt for claudin-18. Den foreliggende undersøgelse viste for første gang funktionen af ​​claudin-18 i GC ved anvendelse af en genetisk tilgang, og at tab af claudin-18 var involveret i både proliferation og invasion af GC-celler. Sammen med disse data, tab af claudin-18 på det submukøse invasive fronten angivet erhvervelsen af ​​mere aggressive egenskaber og kan tillade celle-celle dissociation under invasionen. en begrænsning af denne undersøgelse var, at kun MKN74 kunne undersøges, fordi det var den eneste differentierede gastrisk cancer cellelinie, som udtrykte claudin-18 så vidt vi undersøgt. Derfor kan lignende fænomener ikke gengives med andre gastrisk cancer cellelinjer.

Både opregulering og nedregulering af claudins er blevet rapporteret at være involveret i kræft proces [34], [35]. Til analyse af funktionen af ​​claudins i cancerceller, er også blevet rapporteret genetiske tilgange til claudins i forskellige cancerceller. Knockdown af claudin-1 ved siRNA resulterede i hæmning af migration i colon cancerceller [36]. Overekspressionen af ​​claudin-6, claudin-7, eller claudin-9 forøgede invasive potentiale af en gastrisk adenocarcinom cellelinie [37]. En sådan claudin proliferation og invasion kan virke paradoksalt, fordi claudins er kendt for at være involveret i forsegling epitel vejkryds. Disse kontroversielle data tyder på, at funktioner claudins er både subtype- og celletype-specifik.

Som en begrænsning af denne undersøgelse, er det stadig ikke klart, at dette faldt claudin-18 niveau ved submukøse invasive front er faktisk er involveret i kræft metastaser, fordi det er svært at følge den naturlige historie af tidlig GCS. Men data i denne undersøgelse viste, at en lavere claudin-18 niveau ved invasive fronten var forbundet med større proliferativ tendens. Det er nødvendigt at undersøge, om prospektivt dette fald i claudin-18 niveau kan anvendes som en metastatisk og prognostisk biomarkør efter endoskopisk resektion i en fremtidig undersøgelse.

Sammenfattende er det blevet vist for første gang, at claudin-18 er heterogent udtryk på det submukøse invasiv foran tidlig GC, og nedregulering af claudin-18 er forbundet med den proliferative og invasive potentiale GC. Disse resultater viser, at claudin-18 har en central rolle i udviklingen af ​​GC og kan være kandidat biomarkør for sygdomsprogression. En claudin-18 knockdown eksperiment bekræftede, at undertrykkelse af junktionel claudin-18 fremmet spredning og invasion af GC celler.

Tak

Vi takker Ms Noriko Kamiya til teknisk bistand.