PLoS ONE: SOX2 Forbedrer Migration og invasion af ovariecancerceller via Src kinase

Abstrakt

Kræft i æggestokkene er den hyppigste dødsårsag blandt gynækologiske kræftformer og er den femte hyppigste årsag til alle kræftrelaterede dødsfald blandt kvinder. Udviklingen af ​​hidtil ukendte molekylære mål er derfor vigtigt at mange patienter. For nylig har SRY-relaterede transskription faktor SOX2 blevet bredt rapporteret at være involveret i flere patofysiologiske sygdomme, herunder vedligeholdelse af stamceller egenskaber og carcinogenese. Hidtil har SOX2 hovedsagelig blevet vist at fremme udviklingen af ​​cancer, selv om dens inhibitoriske roller i cancer er også blevet rapporteret. Men den rolle SOX2 i kræft i æggestokkene er stort set ukendt. I den foreliggende undersøgelse påvist vi ekspressionen af ​​SOX2 i 64 humane serøse ovariecarcinom (SOC) væv og parret tilsvarende metastatiske prøver vha immunhistokemi. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​SOX2 i primære tumorer er meget lavere end i de tilsvarende metastatiske læsioner. Vi fandt endvidere, at SOX2 overekspression fremmer proliferation, migration og invasion, mens inhibering adhæsion evner SOC celler. Endelig fandt vi, at SOX2 målretter Src-kinase, en ikke-receptortyrosinkinase, der regulerer cellemigrering, invasion og adhæsion i SOC-celler. Sammen disse resultater antydede, at Src kinase er et centralt molekyle i SOX2-medieret migration og invasion af SOC celler

Henvisning:. Wang X, Ji X, Chen J, Yan D, Zhang Z, Wang Q, et al. (2014) SOX2 Forbedrer Migration og invasion af ovariecancerceller via Src kinase. PLoS ONE 9 (6): e99594. doi: 10,1371 /journal.pone.0099594

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: 9. februar 2014 Accepteret: 15. maj 2014 Udgivet: 17 Jun 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC nr 81.272.883, No. 81020108027 og nr 81.172.478). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

æggestokkene epitelial kræft udgør 80-90% af alle æggestokkene kræft og er den førende dødsårsag blandt alle gynækologiske maligniteter [1]. På grund af mangel på tidlige symptomer, er ovariecarcinom normalt diagnosticeres på et fremskredent metastatisk stadie. Udbredt metastaser er de vigtigste årsager til dårlig prognose hos patienter med ovariecancer. Selvom overlevelse er steget en smule i løbet af de seneste 25 år, fem år overlevelsesrater forblive under 50% [1]. Derfor studerer de metastatiske mekanismer i kræft i æggestokkene har været fokus på verdensplan.

SOX2, et medlem af SRY-relaterede høj mobilitet gruppe kasse familie, blev oprindeligt fundet at opretholde den embryonale stamceller pluripotens [2] . For nylig SOX2 blev vist at være involveret i en række maligniteter. Talrige undersøgelser har vist, at SOX2 fremmer celledeling, migration, invasion og tumormetastaser i flere tumortyper såsom glioblastomer [3], kolorektal cancer [4], prostatakræft [5], brystkræft [6], [7] og osteosarkomer [8]. Endvidere høje ekspressionsniveauer af SOX2 korrelerer med tumorprogression eller dårlig prognose af flere cancertyper. I modsætning hertil blev tumor-undertrykkende rolle SOX2 også rapporteret i gastrisk kræft [9], og pladecellekræft lungecancer [10].

For nylig har flere undersøgelser vist, at SOX2 udtryk øges betydeligt i æggestokkræft væv sammenlignet med normale ovarie væv under anvendelse immunhistokemi [11], [12]. Multivariat analyse yderligere påvist, at SOX2 overekspression er en dårlig prognostisk faktor i ovariecancer [13], [14]. Disse resultater antydede, at SOX2 kan virke som et tumorfremmende gen i ovariecancer. Men de funktionelle roller og præcise mekanismer er stadig undvigende i kræft i æggestokkene. For at klarlægge, hvilken rolle og underliggende mekanismer i SOX2 i æggestokkene epitelial kræft, undersøgte vi ekspressionen af ​​SOX2 i serøs ovariecarcinom (SOC) og matches metastatiske væv, såvel som i SOC cellelinjer. Desuden har vi analyseret effekten af ​​SOX2 genet på formering, migrering og vedhæftning evner SOC celler.

Materialer og metoder

Menneskelige SOC prøver og kliniske oplysninger

SOC primær og matchede metastatiske væv (omentum) blev opnået fra Institut for Patologi på First Folkets Hospital i Shanghai. Anvendelse af prøverne blev godkendt af menneskelige Investigation Etisk udvalg af første Folkets Hospital af Affiliated Shanghai Jiao Tong University. Alle disse prøver blev opnået med skriftligt informeret samtykke. De specifikke anvendte prøver i denne undersøgelse, er beskrevet i tidligere publikation [15]. I alt 64 serøs cystadenocarcinoma med omentum metastaser (fase III) blev undersøgt. Alderen af ​​patienter med ovariecancer varierede fra 34 til 81 år (median på 61,2). Der er 55 tilfælde med overgangsalderen. De formaldehyd-fikseret og paraffin-embedded vævsprøver fra 64 tilfælde af SOC blev indsamlet i perioden fra januar 2003 til december 2010. Patienter med strålebehandling eller kemoterapi, blev udelukket. Patologiske diagnoser af de ovennævnte æggestokkene læsioner blev foretaget af to gynækologiske patologer ved hjælp af WHO klassifikation.

immunhistokemisk (IHC) farvning og evaluering

IHC analyse for SOX2 proteinekspression blev udført som tidligere beskrevet. Kort fortalt blev SOX2 ekspression detekteret ved anvendelse af et kanin-monoklonalt anti-humant SOX2 (Cell Signal Technology, Danvers, MA, USA). Snittene blev inkuberet med anti-SOX2 (1:100 fortynding) i en fugt kammer i 2 timer efterfulgt af en 60-minutters inkubation med et biotinyleret sekundært antistof. Procentdelen af ​​positivt farvede celler og intensiteten af ​​farvningen i disse objektglas blev vurderet i en blindet måde. Positive celler blev indikeret ved tilstedeværelsen af ​​brune farvning i både kernen og cytoplasmaet. IHC resultater blev evalueret under et lysmikroskop og scorede som følger: 0 5% positive celler; 1 5-25% positive celler; 2 26-75% positive celler; og 3 76% positive celler. Stain intensitet blev bedømt som: 0, ingen farvning; 1, sarte gule; 2, brun-gul; og 3, mørkebrun. Ekspressionsniveauet (plus de to scorer) blev klassificeret som: – (0), + (1-2), ++ (3-4), og +++ (5-6). Scores ≥3 blev defineret som højniveau-ekspression og snesevis 3 blev defineret som lav-niveau ekspression. Individuelle IHC score for hvert tilfælde blev anvendt til statistisk analyse. Alle IHC slides blev revideret uafhængigt af to efterforskere.

cellelinjer og cellekultur

Ovariecancer cellelinjer Hey, HO8910, og HO8910-pm blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket baseret på retningslinjerne fra lageret. Cellerne blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) /F12 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). De MCV152 og Moody cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af Dr. Wenxin Zheng (Arizona University, Tucson, AZ, USA). SKOV3 celler blev købt fra Beijing Union Medical College (Beijing, Kina). De tre SOC cellelinjer og HEK-293T blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, natriumpyruvat og L-glutamin ved 37 ° C med 5% CO2.

RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad. CA. USA). Gratis DNA (cDNA) blev syntetiseret med Prime-Script RT reagens kit (Takara, Japan). Fold induktioner blev beregnet ved hjælp af formlen 2- (ddCt) ved hjælp af GAPDH som en intern kontrol-gen. Real-time PCR blev udført under anvendelse af SYBR Premix Ex Taq (Takara, Japan). De genspecifikke primerpar var som følger: SOX2 (F) 5′-CGG CAA CCA GAA AAA CAG C-3 ‘, SOX2 (R) 5′-TCT CCG TCT CCG ACA AAA GT-3′; GAPDH (F) 5’-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3 ‘, GAPDH (R) 5′-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3’.

Transient transfektion af SOX2 lille interfererende RNA (siRNA) og Src siRNA

Ho8910-pm og SKOV3-celler blev udpladet i seks-brønds plader ved en densitet på 4 x 10

5 celler /brønd. Efter 24 timers dyrkning blev mediet erstattet med Opti-MEM (Invitrogen) i fravær af antibiotika og dyrket. siRNA svarende til genet blev udformet og syntetiseret ved Genepharma (Shanghai, Kina). I alt 100 pmol siRNA blev transficeret under anvendelse 5 pi af lipofectamin RNAiMax reagens (Invitrogen). Efter inkubering i yderligere 48 timer blev de behandlede celler anvendt til at undersøge effekten af ​​gen udtømning anvendelse af Western blot-analyse eller transwell og adhæsionsassays. SiRNA-sekvenserne mod SOX2 inkluderet: (1) 5′-CUGCAGUACAACUCCAUGATT-3 ‘; (2) 5’-GGACAUGAUCAGCAUGUAUTT-3 ‘; (3) 5’-CCA UGG GUU CGG UGG UCAA TT-3 ‘. SiRNA-sekvenserne mod Src inkluderet: (1) 5’-CAG GCU GAG GAG UGG UAU UTT-3 ‘; (2) 5’-GCC UCA ACG UGA AGC ACU ATT-3 ‘; (3) 5’-CUC GGC UCA UUG AAG ACA ATT-3 ‘

Plasmidkonstruktion

SOX2 ORF sekvens blev amplificeret fra den SOX2 vektor, som blev produceret af Shanghai R . S Biotechnology Co. Ltd (Shanghai, Kina). Integriteten af ​​cDNA blev bekræftet ved sekventering. Den SOX2 ORF sekvensen blev indsat i EcoRI-BamHI-stedet i pWPXL plasmidet og ligeret ind i vektoren (en gave fra Dr. Didier Trono). Primersekvensen af ​​SOX2 inkluderet: SOX2 (F) 5′- CGC GGA TCC ATG TAC AAC ATG ATG GAG ACG GAG C-3 ‘; SOX2 (R) 5’-CCG GAA TTC GAT TTA TCG CGT CGA CTC ACA TG-3 ‘.

lentivirus produktion og celle transduktion

Emballagen plasmid psPAX2 og konvolutten plasmidet pMD2.G var gaver fra Dr. T. Didier Trono. pWPXL-SOX2 vektor blev cotransficeret med psPAX2 og pMD2.G ind HEK293T celler under anvendelse lipofectamin 2000 (Invitrogen). Vira blev høstet 48 timer efter transfektion og virustitere blev bestemt. Ho8910 celler blev inficeret med 1 x 10

6 rekombinante lentivirus transduktion enheder i nærvær af 6 ug /ml polybren (Sigma, MO. USA).

celle- ekstracellulære matrix (ECM) adhæsion assay

evnen af ​​ovariekarcinomceller at overholde ECM komponenter blev kvantificeret som tidligere beskrevet [16]. Plader med 96 brønde blev overtrukket med 1 mg /ml matrigel (BD, USA), 10 ug /ml plasma fibronectin (Millipore, Billerica, MA, USA), 10 ug /ml type I collagen (Millipore, Billerica, MA, USA) , 10 ug /ml laminin (Millipore, Billerica, MA, USA), eller med 100 ug /ml bovint serumalbumin (BSA; Sigma, USA) og inkuberet natten over ved 4 ° C. Efterfølgende blev ikke-specifikke bindingssteder blokeret med 1% BSA i phosphatbufret saltvand (PBS) i 4 timer ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C, hvorefter pladerne blev vasket ved PBS to gange. Cellerne (4,0 x 10

4cells /100 pi) fortyndet med DMEM blev tilsat til de coatede plader med 96 brønde og inkuberet ved 37 ° C i 30~60 minitus i en CO2 inkubator. Ikke-adhærente celler blev fjernet ved vask med PBS. Vedhæftede celler blev analyseret under anvendelse af et Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan) ifølge producentens instruktioner, og den optiske densitet blev målt ved 450 nm. Disse forsøg blev udført tredobbelt og gentaget to gange.

celleproliferation assays

Celler blev podet ved en densitet på 2000 celler per brønd i plader med 96 brønde og inkuberet. En portion på 10 pi CCK-8 blev tilsat til brøndene og inkuberet i 2 timer. Absorbansen blev målt ved 450 nm for at beregne antallet af levedygtige celler i hver brønd. Hver måling blev udført tredobbelt, og forsøgene blev gentaget to gange.

I kolonidannelse assays blev celler podet i seks-brønds plader ved en densitet på 200 celler per brønd og dyrket ved 37 ° C i to uger. Ved slutningen af ​​inkubationen blev cellerne fikseret med 100% methanol og farvet med 0,1% (w /v) krystalviolet. Megascopic cellekolonier blev talt under anvendelse Image-Pro Plus 5.0 software (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Hver måling blev udført tredobbelt, og eksperimenterne blev hver udført mindst tre gange

Migration og invasion assays

cellemigrationsassay:. 4 × 10

4 celler blev suspenderet i 200 pi serumfrit DMEM-medium og podet ind i det øvre kammer af hver indsats. Derefter blev 500 pi DMEM indeholdende 10% FBS tilsat til en plade med 24 brønde. Efter inkubering ved 37 ° C (Ho8910: 12-14 h Ho8910-pm: 12-14 h SKOV3: 12-14 h), de celler, der migrerede blev fikseret og farvet i 30 minutter i en 0,1% Crystal Violet opløsning i PBS

Cell invasion assay:. kamre blev jævnt dækket med 60 uL Matrigel fortyndet med DMEM til en vis procentdel og inkuberes ved 37 ° C i 2-4 timer. Derefter 4 × 10

4 celler blev suspenderet i 200 pi DMEM og podet i de øvre kamre, og 500 pi DMEM indeholdende 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubering ved 37 ° C (Ho8910:24-26 h; Ho8910-pm: 24-26 h SKOV3 24-26 h)., Cellerne blev fikseret og farvet

Western blot-analyse

De behandlede celler blev lyseret med radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoxycholsyre, natrium, 0,1% SDS). Cellelysater blev adskilt ved 7,5 til 12,5% SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, USA), og blokeret med PBS indeholdende Tween-20 og 5% fedtfri mælk i 1 time. Proteiner af interesse blev inkuberet med tilsvarende primære antistoffer natten over ved 4 ° C. De blev derefter vasket tre gange med vaskebuffer (0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvand) og inkuberet med det passende sekundære antistof ved stuetemperatur i 1 time. Antistoffet kompleks blev påvist under anvendelse af forøget kemiluminescens Kit (Pierce, Rockford, 1 L. USA). Følgende primære antistoffer SOX2, FAK, phospho-FAK (Y397), Src, phospho-Src (Y416), p130cas, phospho-p130cas, Erk1 /2, phospho-ERK1 /2-, MMP2 og MMP9, blev købt fra Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA).

Statistical Analysis

Alle resultater er vist som middelværdi ± standardafvigelse på middelværdien. Statistiske analyser blev udført med Fishers eksakte test i tabel 1. For overlevelse analyse blev Kaplan-Meier-overlevelseskurver konstrueret og forskelle mellem dem blev testet ved log-rank test. Ellers var forskelle mellem grupper analyseret ved anvendelse t-test (to-halet).

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Expression af SOX2 i primære tumorer og tilsvarende metastatiske læsioner i SOC

æggestokkene. cancer vævsprøver fra 64 patienter blev anvendt i denne undersøgelse, og ekspressionen af ​​SOX2 blev analyseret i disse væv ved hjælp af immunhistokemiske (IHC) farvning. Som vist i tabel 1, 21 ud af 64 (32,8%) af primære læsion væv havde relativt lave ekspressionsniveauer af SOX2 protein, hvorimod 15 ud af 64 (23,4%) af de metastatiske væv udviste lav ekspression af SOX2 protein. Men 43 ud af 64 (67,2%) af primære læsion væv havde relativt høje ekspressionsniveauer af SOX2 protein, hvorimod 49 ud af 64 (76,6%) af metastatiske væv udviste høje ekspressionsniveauer af SOX2 protein. Især ekspressionsniveauerne af SOX2 var højere i metastatiske læsioner end dem i deres parrede primære tumorvæv (figur 1A og figur 1B).

(A), (B) repræsenterer to eksempler på 64 tilfælde. Blandt A, øverst til venstre repræsenterer en primær cancer væv nederst til venstre repræsenterer de tilsvarende metastaser (omentum). Right, forstørrelse af væv i sort ramme. Den arragement over B ligner A. (C), (D) Kaplan-Meier-overlevelseskurver analyse viser individ med høj SOX2 ekspressionsniveau har større risiko for død. Kræft i æggestokkene væv med SOX2 udtryk (score≥3) blev klassificeret som SOX2 højt niveau. Blandt C, Patienter med SOX2 højt niveau (n = 43) havde signifikant dårligere overlevelse end dem med SOX2 lavt niveau (n = 21) i SOC primære væv (

s

= 0,0358, log-rank test). Blandt D, Patienter med SOX2 højt niveau (n = 49) havde signifikant dårligere overlevelse end dem med SOX2 lavt niveau (n = 15) i SOC metastatisk væv (

s

= 0,0029, log-rank test).

De korrelationer mellem SOX2 udtryk og klinisk patologiske faktorer i menneskets SOC blev yderligere undersøgt. Interessant, fandt vi, at SOX2 udtryk var signifikant associeret med histologisk klasse. Specifikt SOX2 ekspression var relativt høj i mindre differentierede tumorer (tabel 1). Den positive farvning af SOX2 steget gradvist fra G2 til G3 klasse, hvilket indikerer, at SOX2 protein blev forøget under udviklingen af ​​SOC. Ellers var der ingen signifikante associationer mellem SOX2 udtryk og alder eller serum CA125 niveauer.

Foreningen af ​​SOX2 udtryk med OS (samlet overlevelse) varighed og priser på forskellige måneder blev undersøgt. Patienter med højt niveau SOX2 ekspression havde kortere OS varigheder end dem med lavt niveau SOX2 ekspression i primære tumorvæv og metastatisk væv, henholdsvis (figur 1C og 1D). Sammen disse resultater foreslog, at ekspressionen af ​​SOX2 kunne forudsige dårlig prognose i human ovariecancer.

SOX2 øger vandrende og metastatiske potentialer og formindsker vedhæftning evne SOC celler

For at vælge egnede cellelinjer at studere den biologiske funktion af SOX2 analyserede vi først protein niveauer i SOX2 i seks ovarie tumorcellelinier. Vi fandt, at proteinet niveauer af SOX2 spænder blev varieret i forskellige æggestokkene cancercellelinier. Som vist i figur 2A og figur 2B blev ekspressionen af ​​SOX2 relativt forøget i SKOV3 og meget metastatisk cellelinie Ho8910-pm sammenlignet med dets forælder ovariecancer cellelinie Ho8910. Ekspressionen af ​​SOX2 var relativt lavt i godartet ovarie serøs cystadenoma eternalized cellelinie MCV152 og den udødelige humane ovarie epitelcellelinie Moody.

Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse af SOX2 i seks ovarie tumorcellelinier. (B) Western blot-analyse af SOX2 proteinekspression i tilsvarende cellelinier. GAPDH blev anvendt til normalisering. (C) Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse og Western blot-analyse af SOX2 i Ho8910-SOX2, Ho8910-pm-siSOX2, SKOV3-siSOX2 celler. GAPDH blev brugt til normalisering.

For yderligere at undersøge funktionen af ​​SOX2 i SOC celler blev SOX2 genet overudtrykt af lentiviral infektion i Ho8910, hvilket blev bekræftet af real-time PCR og Western blotting (figur 2C). Efterfølgende vi bestemt effekten af ​​SOX2 overekspression om spredning af de SOC celler. Resultaterne viste, at overekspression af SOX2 genet kunne fremme SOC celleproliferation (figur 3A og figur 3B). Endvidere undersøgte vi virkningen af ​​SOX2 overekspression på migrerende, invasive og klæbende evner SOC celler under anvendelse transwell assays og celle-ECM adhæsionsassays. Resultaterne viste, at overekspression af SOX2 protein i væsentlig grad kan fremme migration og invasion af SOC-celler (figur 4A), men med færre adhæsionen af ​​SOC celler til Matrigel, fibronectin, type I collagen og laminin (figur 5A).

Stabil transfektion af SOX2 plasmid fremme celledeling og klon dannelse (A) CCK8 analyser i HO8910. (B) Klon dannelse analyser i HO8910. Transient transfektion af SOX2 siRNA inhibere celleproliferation og klon formation (C) CCK8 assays i HO8910-pm. (D) Clone dannelse analyser i HO8910-pm. (E) CCK8 analyser i SKOV3. (F) Klon dannelse analyser i SKOV3.

(A) Stabil transfektion af SOX2 plasmid i HO8910. Top, Transwell migration analyser; Bund, Transwell invasion analyser. (B) Forbigående transfektion af SOX2 siRNA i HO8910-pm. Top, Transwell migration analyser; Bund, Transwell invasion analyser. (C) Forbigående transfektion af SOX2 siRNA i SKOV3. Top, Transwell migration analyser; Bund, Transwell invasion analyser.

(A) Fald vedhæftning efter stabil transfektion af SOX2 plasmid i HO8910. (B) Øg vedhæftning efter transient transfektion af SOX2 siRNA i HO8910-pm. (C) at øge adhæsion efter transient transfektion af SOX2 siRNA i SKOV3.

Next vi slået ned ekspressionen af ​​SOX2 genet ved anvendelse forbigående transfektion af siRNA’er i to cellelinjer med relativt høj ekspression af SOX2, Ho8910 -PM og SKOV3. Den interferens effektivitet blev bekræftet ved realtids-PCR og Western blotting (figur 2C). Efterfølgende virkningen af ​​knockdown af SOX2 på proliferationen af ​​disse celler blev bestemt ved anvendelse CCK-8 assays og klon dannelse assays. Resultaterne viste, at afbrydelse af SOX2 protein faldt proliferationen af ​​disse SOC celler (figur 3C-3F). Desuden fandt vi, at knockdown af SOX2 protein-ekspression hæmmede de vandrende og invasive evner SOC celler ved transwell assays (figur 4B og 4C), og samtidig fremme celleadhæsion til Matrigel, fibronektin, type I collagen og laminin (figur 5B og figur 5C). Samlet set viser disse resultater antydede, at SOX2 gen kan have en vigtig rolle i celleproliferation, migration, invasion og adhæsion af SOC-celler.

Overekspression af SOX2 fører til øget phosphorylering af multiple pro-matastatic proteiner

Vi udforskes yderligere de molekylære mekanismer bag SOX2-medieret celle migration og tumormetastaser. Vi fandt, at en stabil overekspression af SOX2 resulterede i øget phosphorylering af Src og FAK og deres downstream molekyler (p130-CAS) i Ho8910 celler (figur 6). Desuden målrettet knockdown af SOX2 genet førte til en reduceret phosphorylering af disse proteiner i Ho8910-pm og SKOV3-celler (figur 6).

(A) Venstre, Western blot-analyse proteiner ekspression efter stabil transfektion af SOX2 plasmid i ho8910. Mellemøsten, Western blot analyse proteiner udtryk efter transient transfektion af SOX2 siRNA i HO8910-pm. Højre, Western blot analyse proteiner ekspression efter transient transfektion af SOX2 siRNA i SKOV3. (B) Den arragement over B ligner A.

Knockdown af Src fremmer celleadhæsion og formindsker cellemigration og invasion

Ovenstående resultater antydede, at aktiveringen af ​​Src-kinase kan være ansvarlig for tyrosinphosphorylering af p130-cas i SOC celler. For at bestemme hvorvidt Src-kinaseaktivitet er påkrævet for SOX2-induceret phosphorylering af p130-cas, vi væltede Src-genet ved siRNA i Ho8910-vektor og Ho8910-Sox2 celler. Den interferens effektivitet blev bekræftet ved Western blotting (figur 7B). Vi fandt, at knockdown af Src protein-ekspression hæmmede de vandrende og invasive evner Ho8910-Sox2 celler i transwell assays (figur 7A), og samtidig fremme celleadhæsion til matrigel, fibronektin, type I kollagen, men ikke laminin (Figur 7C). Endvidere fandt vi, at phosphorylering af p130-cas kunne blive dæmpet i Ho8910-SOX2 celle ved knockdown af Src-genet (figur 7B). Tilsammen viste disse resultater, at Src-kinase aktivitet er essentiel for SOX2-medieret adhæsion og migrering af SOC-celler. Salg

(A) Transwell migration og invasion-assays. (B) Western blot analyse proteiner udtryk (C) Adhæsion assay.

Diskussion

SOX2 er en vigtig regulator for at opretholde pluripotens og selv-fornyelse af embryonale stamceller og bidrager til omprogrammering af differentierede somatiske celler tilbage til en pluripotente stamcelle tilstand. På det seneste er øget SOX2 ekspression blevet detekteret i flere maligne tumorer tyder på, at SOX2 også regulerer tumorigenese [3] – [10]. Talrige undersøgelser har vist, at høj ekspression af SOX2 er korreleret med lymfe og vaskulær invasion, dårlig differentiering og nedsat sygdomsfri overlevelse [3] – [8]

Selvom associering SOX2 ekspression med dårligt klinisk. resultatet af kræft i æggestokkene er blevet rapporteret [11], [12], de funktionelle roller og mekanismer i denne tumor blev mindre tidligere gennemført, især i tumormetastaser og vedhæftning. I vores undersøgelse, SOX2 overekspression fremmes celleproliferation og klon formation. Men resultatet er ikke i fuld overensstemmelse med tidligere rapporter [13], [14]. Dette kan skyldes de forskellige ovarian cancer anvendte cellelinier. For nylig er det blevet rapporteret, at Sox2 mål fibronectin at fremme cellemigration og invasion i ovariecancer [14]. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at Src-kinase kan være forbundet med Sox2-inducerede ændringer i ovariecancer. Øget invasion kan være relateret til den forøgede phosphorylering af multiple pro-metastatiske proteiner induceret af SOX2 overekspression.

Src-kinase er et ikke-receptor-tyrosinkinase og vides at spille vigtige roller i forskellige signalveje af proliferation, migration , vedhæftning, og angiogenese under tumor udvikling og progression [17], [18]. Src-kinase overudtrykkes eller aktiveret i flere faste tumorer, herunder brystcancer [19], prostatacancer [20], tyktarmskræft [21], gastrisk cancer [22] og pancreascancer [23]. Desuden har det vist sig, at Src var forbundet med SOX2 udtryk og selv-fornyelse af stamceller-lignende side-population celler i ikke-småcellet lungecancer [24]. Selvom metastase er en multifaktoriel proces, invasion er et kritisk link for tumorceller til at metastasere. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at en stabil overekspression af SOX2 medførte tydeligvis øget phosphorylering af Src og øget invasion evne, hvorimod knockdown af SOX2 genet førte til reduceret phosphorylering niveau af Src og invasion evne i SOC. Efterfølgende invasionen evne var også faldet efter knockdown af SOX2 eller Src.

p130cas kan phosphoryleres af Src eller FAK familien kinaser. Det fungerer som en stillads molekyle at regulere proteinkomplekser der styrer cellevandring og adhæsion, apoptose, cellecyklus, differentiering og endda progenitorcelle funktion [25], [26], [27]. I denne undersøgelse fandt vi også, at phosphorylering niveau af p130cas blev reguleret af Src-kinase i SOC linjer.

Styringen af ​​celle-matrix adhæsion spiller også en vigtig rolle i kontrollen af ​​kræft cellemigration under metastase [28]. I den tidlige fase af tumormetastase, reduceret adhæsion evne cancerceller vil forårsage kræft celle udgydelse og invasion til andre sites. I vores undersøgelse, kan reduktion vedhæftning også skyldes den øgede ekspression af matrixmetalloproteinaser (MMP2 og MMP9) efterfulgt af overekspression af SOX2. Fak fremmet dannelsen af ​​Src-p130cas-Crk-Dock180 signalering kompleks, hvilket fører til den selektive forøgelse af Ras GTPase og JNK, og resulterede i øget MMP2 og MMP9-ekspression [29]. Vi fandt, at knockdown af Src-genekspression kan reducere ekspressionen af ​​MMP2 og MMP9. MMP2 og MMP9 er de vigtige metalloproteinaser, som nedbryder ECM og reducere celleadhæsion evne. En anden årsag til reduktion adhæsion kan skyldes den øgede phosphorylering niveau af Src og Erk. En undersøgelse har vist, at Src overekspression kan inhibere proteinekspression niveau af integrin subunit af Erk i colon-tumorceller [30]. Så vi udledes, at Src overekspression kan ændre ekspressionen eller funktionen af ​​integrin-underenheden i ovariecancerceller. Dette forklarer også, hvorfor høj ekspression af FN induceret af SOX2 overekspression i ovariecancer [14], førte ikke til vedhæftning enhancement [31], men en lavere vedhæftning i vores undersøgelse. I vores undersøgelse SOX2 moduleret SOC vedhæftning til matrigel, fibronektin, type I kollagen, ikke herunder laminin. Specifikke mekanismer behøver blive yderligere undersøgt.

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at en af ​​de mekanismer, hvormed SOX2 fremmes SOC cellevandring og tumormetastase er gennem phosphorylering og aktivering af p130cas og høj ekspression af MMP2 og MMP9 . Det er blevet veldokumenteret, at Src-familiekinaser er de store kinaser, der fremmer tyrosinphosphorylering af p130cas og øge ekspression af MMP2 og MMP9 [26], [32], [33]. Sammen fandt vi, at SOX2-induceret phosphorylering og aktivering afhænger delvis aktiveringen af ​​Src-kinase.

Afslutningsvis vores resultater foreslog, at SOX2 spiller en central rolle i SOC cellevandring og tumormetastase, og src kinase signaleringskaskade kan være et centralt element i den SOX2 pro-metastatisk signalering netværk i SOC celler.

Tak

Vi er meget taknemmelige for professor Didier Trono (Ecole polytechnique fédérale de Lausanne, 1015 Lausanne, Schweiz) for at tilvejebringe de pWPXL, psPAX2 og pMD2.G plasmider. Vi takker også Doctor Deshui Jia (Shanghai Cancer Institute, Shanghai, Kina) for hans store hjælp i sprog redigering.