PLoS ONE: Ekspression af NES-hTERT i cancerceller Forsinkelser cellecyklusprogression og øger følsomheden til Genotoksisk Stress

Abstrakt

Telomerase er en omvendt transkriptase forbundet med cellulære udødelighed gennem telomer vedligeholdelse. Dette enzym aktiveres i 90% af humane cancere, og inhibitorer af telomerase er i øjeblikket i kliniske forsøg for at modvirke tumorvækst. Mange aspekter af telomerase biologi er blevet undersøgt til behandling, især inhibering af enzymet, men lidt blev gjort med hensyn til dens subcellulære shuttling. Vi har for nylig vist, at mutationer i den nukleare signal af hTERT, den katalytiske komponent i telomerase eksport, førte til en mutant (

NES-hTERT) at mislykkedes at udødeliggøre celler trods kernelokalisering og katalytisk aktivitet. Ekspression af

NES-hTERT i primære fibroblast resulterede i telomer-baserede tidlig ældning og mitokondriel dysfunktion. Her viser vi, at ekspression af

NES-hTERT i LNCaP, SQ20B og HeLa-celler hurtigt og signifikant nedsætter deres proliferationshastighed og evnen til at danne kolonier i blød agar mens ikke interferere med endogen telomeraseaktivitet. De kræftceller viste øget DNA-skader på telomert og ekstra-telomere steder, og blev følsomme over for ioniserende stråling og hydrogenperoxid engagementer. Vores data viser, at ekspressionen af ​​

NES-hTERT effektivt modvirker kræft cellevækst

in vitro

i mindst to forskellige måder, og foreslå manipulation med NES hTERT eller dets subcellulære shuttling som en ny strategi for kræft behandling

Henvisning:. Kovalenko OA, Kaplunov J, Herbig U, deToledo S, Azzam EI, Santos JH (2010) Angivelse af

NES-hTERT i cancerceller Forsinkelser cellecyklusprogression og øger følsomheden til Genotoksisk Stress. PLoS ONE 5 (5): e10812. doi: 10,1371 /journal.pone.0010812

Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 13. april, 2010; Accepteret: 3 maj 2010; Udgivet: 25. maj 2010

Copyright: © 2010 Kovalenko et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af New Jersey Kommissionen om Cancer Research (NJCCR), tilskud nummer 808.033 (JHS), 09-1124-CCR-EO (UH) og 10-2412-CCR-E0 (JF), Army Research Office, give nummer 56027LS (JHS), den Ellison Medical Foundation giver AG-NS-0387-07 (UH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En vigtig egenskab af maligne tumorer er deres evne til at proliferere i det uendelige. Dette medieres, i 90% af tilfældene, ved reaktivering af telomerase, en revers transkriptase ansvarlig for at vedligeholde telomerer [1], [2]. Telomerase er sammensat minimalt af to forskellige underenheder, en katalytisk kerne (hTERT) og en RNA komponent (hTR), som arbejder i fællesskab at genopfylde telomerer med hver celledeling. hTERT er for nylig blevet vist at erhverve egenskaber af en RNA-afhængig RNA-polymerase, når i et kompleks med RNA-komponenten af ​​det mitokondrielle endoribonuclease MRP [3]; sådan aktivitet er ikke involveret i vedligeholdelse af telomerer. Henviser hTR findes i begge somatiske celler og kimceller konstitutivt, er ekspression af hTERT stramt reguleret. Telomeraseaktivitet er høj under embryogenese og i langt de fleste tumorer, men er lav eller ikke-eksisterende i de fleste voksne somatiske celler [1]. Af denne grund, inhibering telomerase er blevet en lovende strategi til kræftbehandling.

Der er udviklet adskillige forskellige fremgangsmåder til at blokere aktiviteten af ​​telomerase holoenzymet, der spænder fra inhibitorer af hTERT til G-quadruplex stabiliseringsmidler til målrettet nedbrydning af den tilknyttede hTR [4] – [17]. I alle tilfælde, at de direkte eller indirekte telomerase inhibering resulterer i manglende evne af cellerne opretholde telomerer og ultimativt celler standse væksten eller dø. Et problem med disse tilgange er, at flere uger til måneder er nødvendige for effekterne, da de for det meste er afhængige af omfattende telomer afkortning [5]. Ikke desto mindre, telomerase-inhibitorer er i øjeblikket i kliniske forsøg [18].

Vi har for nylig vist, at en mutant hTERT defekt i dets nukleare eksport signal (

NES-hTERT) undlod at opretholde telomerer og “sund” mitochondrierne i både primære og SV40-transformerede humane fibroblaster [19]. Trods kernelokalisering og katalytisk aktivitet in vitro, mutantproteinet var biologisk inaktivt in vivo fører til for tidlig ældning med aktivering af den klassiske telomere-relaterede DNA-skade respons (DDR), når det udtrykkes i primære celler. Ekspression af mutant protein var også forbundet med mitokondriel dysfunktion og DNA skade på både telomerisk og ekstra-telomere sites [19]. I betragtning af de hurtige og dramatiske effekter observerede, vi hypotese, at ektopisk udtryk for

NES-hTERT kan også være et effektivt middel til at modvirke kræft cellevækst. I den foreliggende undersøgelse udtrykte vi

NES-hTERT i forskellige cancerceller linjer og udviser en hurtig og effektiv forsinkelse i cellecyklusprogression uden nogen påviselig ændring i niveauerne af endogen telomerase enzymatisk aktivitet. Ekspression af det muterede protein signifikant nedsætter evnen af ​​cellerne for forankringsuafhængig vækst in vitro. Vi fandt, at ektopisk ekspression af

NES-hTERT førte til nuklear telomert, ekstra-telomert og mitokondrie-DNA (mtDNA) skader i cancercellerne og sensibiliseret mindst én type af cancerceller til både oxidativ stress og γ-stråling. Tilsammen, foreslår vores resultater målrettet NES hTERT eller dets intracellulære bevægelse som en ny strategi til effektivt at modvirke tumorcellevækst.

Resultater

Overekspression af

NES-hTERT i hud og prostatacancercellelinjer hurtigt blokerer cellecyklusprogression

Vi har for nylig vist, at ektopisk ekspression af en mutant hTERT hvor NES er blevet ødelagt (

NES-hTERT) forårsager for tidlig ældning i telomerase-negative humane fibroblaster [19]. Primære celler, der udtrykker

NES-hTERT stoppet med at vokse inden for 5-20 populationsfordoblinger efter indførelse af mutant protein, der var forbundet med klassiske tegn på cellulær senescens såsom blokade i G1 til S overgang, opregulering af p21

WAF1 , p16 og positivitet for senescens-associerede β-galactosidase (β-gal) aktivitet [19]. På baggrund af disse effekter, vi spurgte, om udtryk for

NES-hTERT ville også påvirke cellecyklusprogression af telomerase-positive kræftceller. For at løse dette spørgsmål, vi stabilt udtrykt

NES-hTERT i SQ20B (pladecellekræft – hudkræft) og LNCaP (prostatakræft) celler og fulgte væksten i masse kulturer i flere uger; kontrolceller blev enten efterladt ikke-inficeret eller inficeret med tom vektor. blev ikke observeret nogen forskel mellem ikke-inficerede og tom-vektor transducerede celler (data ikke vist). Celler blev selekteret med antibiotika i 2 uger før initiering af forsøgene. Virale transduktioner blev gentaget mindst to uafhængige gange med hver cellelinje viser reproducerbare resultater. Alle eksperimenter præsenteret heri stole på data opnået med celler fra mindst to uafhængige virusinfektioner

Det fangede hurtigt vores opmærksomhed, at ved virale transduktion ændringer i fænotypen af ​​cellerne indtraf.; blev observeret sådanne ændringer, mens celler fortsat blev valgt. En fraktion (~30-50%) af SQ20B celler, der udtrykker

NES-hTERT havde fladet og forstørret morfologi med nogle af disse celler, der viser flere kerner (fig. 1A, øvre paneler), der minder om de observerede i de primære celler effekter [19]. I modsætning til i de primære fibroblaster, blev ingen positiv β-gal-farvning observeret i SQ20B-celler udtrykker

NES-hTERT (data ikke vist), hvilket antyder, at de forstørrede celler ikke var senescent. Disse celler var også ikke apoptotiske som de var hverken blebbing eller frigørelse fra skålene (data ikke vist). Forstørret morfologi blev ikke observeret i LNCaP-celler, der udtrykker mutant hTERT; Men mens disse celler tendens til at vokse i klynger /foci uanset deres sammenløb (se også ATCC), udtryk for

NES-hTERT undertrykte denne fænotype (Fig. 1A, midterste paneler).

(A ) SQ20B (øverste paneler) LNCaP (midterste paneler) og deres derivater stabilt udtrykke

NES-hTERT blev udsået på retter i lige mange og analyseret 72 timer senere. Fase kontrast billeder blev taget på et Olympus IX70 mikroskop. Bemærk forstørret morfologi SQ20B

NES-hTERT og celler, der huser flere kerner (pile). Clustering er observeret i LNCaP (se boks), men ikke set i LNCaP

NES-hTERT. Bundpaneler viser HeLa-celler, der blev transient transficeret med

NES-hTERT-mutant. Billeder blev taget 48 timer efter transfektionerne. Pile angiver udvidet og flerkernede celler (i midten) kun observeret ved transfektion med mutant hTERT. (B) SQ20B, LNCaP og deres

NES-hTERT derivater blev udpladet og fik lov til at vokse i op til 144 timer. På forskellige tidspunkter blev celler høstet og talt ved anvendelse af et hæmocytometer. I tilfælde af LNCaP blev celler genudpladet og talt igen 72 timer senere. Mean af tre analyser er vist, fejl søjler repræsenterer s.e.m. (* P ≤ 0,05) (C) Procentdel af celler i hver fase af cellecyklussen blev beregnet ved flowcytometri baseret på PI-farvning. (D) Celler blev serum sultet natten over, derpå frigives af serum tilsætning. Cellerne blev mærket med [

3H] thymidin og analyseret på planlagte tidsintervaller for thymidin. Mean af to uafhængige forsøg vises, fejl barer er standardafvigelse

Det er muligt, at disse morfologiske ændringer blot skyldes den ikke-specifikke integration af

NES-hTERT pBabe vektor. For at udelukke denne mulighed, vi forbigående transficeret mutant protein i HeLa-celler (adenocarcinom). HeLa-celler blev valgt på grund af den høje effektivitet af transiente transfektioner (-60%) sammenlignet med både SQ20B og LNCaP-celler (~10-20%; data ikke vist), og fordi de også udtrykke endogen telomerase. For at sikre, at de analyserede celler udtrykte mutant protein,

NES-hTERT blev subklonet ind i pCMV-vektor og enten transficeret alene eller cotransficeret med GFP; resultaterne var sammenlignelige med de to metoder. Celler transficeret med tom pCMV-vektor (+ eller – GFP) blev anvendt som negative kontroller. Som det kan ses i fig. 1A (højre nederste paneler), inden for 48 timer efter ekspression af den mutante protein, en fraktion af HeLa-celler viste også udvidet og udfladet morfologi, som ikke blev observeret i celler transficeret med vektoren kontrol (fig. 1A, nederst til venstre panel). Disse data antyder, at de morfologiske ændringer, der observeres var forbundet specifikt med ekspression af

NES-hTERT. Interessant nok blev påvist nogen ændring i celleantal for første 96 timer efter transfektioner med konstrukt af den mutante protein (data ikke vist), mens HeLa-celler transduceret med vektor kontrol blev fordobling 48 timer efter transfektion (fig. 1A, nederste venstre panel) .

Dernæst definerede vi, om

NES-hTERT ændret cellecyklus progression af SQ20B og LNCaP celler ved hjælp af tre forskellige tilgange. Først, vi podet tilsvarende antal celler stabilt udtrykker eller ikke mutantproteinet og fulgte deres vækst i en periode på 6 dage. På hvert tidspunkt (24, 72 og 144 timer) blev cellerne trypsinbehandlet og talt ved anvendelse af et hæmocytometer. Som vist i fig. 1B, ekspression af

NES-hTERT ændret proliferationshastighed af begge celletyper. Under disse betingelser, SQ20B celler undergik en befolkning fordobles hver 28. time, mens SQ20B udtrykker mutant hTERT fordoblet hver ~36 timer. Tider for fordobling i tilfældet med LNCaP-celler og dens

NES-hTERT-derivat blev anslået til 36 og 57 timer henholdsvis (34 timer er fordoblingstiden for LNCaP-celler i henhold til forhandlerens (ATCC)). Vi overvågede derefter cellecyklusprogression ved flowcytometri. Cellerne blev synkroniseret med serum tilbagetrækning i 16-18 timer. 8 timer efter serum Desuden blev celler opsamlet og inkuberet med RNase A og propidiumiodid (PI). Dataene i fig. 1C er repræsentative for fire uafhængige analyser; i begge cellelinier ekspression af

NES-hTERT steg procentdelen af ​​celler i G1 hvorimod den faldt den del af cellerne i S (fig. 1C). Disse data førte os specifikt at kvantificere den del af celler i S-fase på basis af tritieret thymidin-inkorporering. Sammenflydende cellepopulationer blev videredyrket til lavere densitet og blev inkuberet i nærvær af [

3H] -thymidin. Bevægelse ind S-fase blev overvåget ved autoradiografi ved forskellige tidspunkter op til 72 timer efter subkultur. Disse forsøg blev gentaget to uafhængige gange og viste tydeligt et signifikant fald i procentdelen af ​​celler i S-fase efter ekspression af den mutante protein (fig. 1D), i overensstemmelse med resultaterne opnået ved flowcytometri. I gennemsnit ved ~20-70 timer efter subkultur, SQ20B og LNCaP-celler, der udtrykker

NES-hTERT havde 40% og 60-80% færre celler i S-fase, når det blev sammenlignet med deres respektive kontroller.

Man kan argumentere for, at høje niveauer af hTERT kunne køre de cellecyklus-effekter, som tidligere argumenteret [20]. Men vi ikke favorisere denne hypotese som ektopisk udtryk for vildtype (WT) eller R3e /R6e hTERT, en mutant hTERT der ikke er i stand til at indtaste mitokondrier [21], ikke havde nogen effekt på celledelingen rate af cellerne (data ikke vist ). Andre grupper har også ektopisk udtrykt WT hTERT stabilt i forskellige typer af kræftceller og blev ikke rapporteret om fejl i cellecyklusprogression [22], [23]. Tilsammen dataene i fig. 1 viser, at ekspression af

NES-hTERT effektivt og hurtigt forsinker progression af SQ20B og LNCaP-celler gennem cellecyklussen.

Overekspression af

NES-hTERT i hud- og prostatacancerceller nedsætter kolonidannelse potentiale

in vitro

en række transformationer er nødvendige for celler til at blive tumorigen, herunder øget vækst og evne til at vokse til en ankerplads-uafhængig måde [22] – [24]. Evnen af ​​transformerede celler til at danne kolonier i blød agar er en nyttig in vitro til forudsigelse af tumordannelse in vivo [24]. Vi søgte at undersøge, om de observerede virkninger på proliferation sats efter indførelsen af ​​

NES-hTERT i hud og prostata kræftceller ville påvirke deres evne til at danne kolonier i blød agar. Til dette formål, vi belagte samme antal SQ20B, LNCaP og deres respektive

NES-hTERT derivater i tre eksemplarer i blød agar og tilladt dem at vokse i op til 3 uger; kolonier blev talt hver uge ved hjælp krystalvioletfarvning. I betragtning af den store mængde af kolonier dannet i uge 2 og 3, især i kontrollerne, scorede vi vækst efter 1 uges vækst, hvor de enkelte kolonier var stadig let at skelne. Resultaterne blev gengivet to uafhængige gange. Øvre paneler på fig. 2 viser antallet af dannede kolonier, lavere paneler viser repræsentative billeder af pladerne. I begge cancer celletyper, indførelse af

NES-hTERT faldt betydeligt antallet af dannede kolonier, hvilket tyder på nedsat tumorigent potentiale af disse celler i forhold til de respektive tom vektor-udtrykkende kontroller.

5 × 10

3 celler /brønd af SQ20B, LNCaP og deres

NES-hTERT derivater blev dyrket i blød agar i op til 3 uger. Kolonivækst blev evalueret hver uge og kolonier tælles baseret på krystalviolet farvning. Grafer viser resultater fra kolonier optalt på en uge, når de enkelte kolonier, især i kontrol celler, der stadig var let at skelne. Kolonier blev scoret af to uafhængige observatører. De viste data er gennemsnittet af to uafhængige forsøg gennemført in triplo. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD. Repræsentative billeder af pladerne er vist nedenfor hver graf.

Angivelse af

NES-hTERT ændrer ikke de endogene niveauer af telomerase enzymatisk aktivitet, men øger niveauerne af telomert og ekstra telomere DNA-skader

Ektopisk ekspression af et katalytisk inaktiv mutant hTERT der opførte sig som en dominant negativ blev vist at effektivt inhiberer telomerase enzymatisk aktivitet, hvilket fører til telomer erosion og nedsat proliferation af forskellige cancer celletyper. Øget spontan apoptose, nedsat kolonivækst i blød agar og reduceret tumordannelse i nøgne mus blev også observeret [9], [17]. Selvom

NES-hTERT er aktiv enzymatisk in vitro, ikke er i stand til at aflang telomerer in vivo [19]. Således er det muligt, i telomerase-positive SQ20B og LNCaP-celler,

NES-hTERT opfører sig på en dominant negativ måde, i sidste ende fører til nedsat proliferationshastighed nævnt ovenfor (fig. 1). For at teste denne mulighed, vi analyserede niveauer af hTERT mRNA og telomerase-aktivitet i hele cellulære ekstrakter af celler, der udtrykker eller ej

NES-hTERT hjælp henholdsvis RT-PCR og telomere repeat forstærkning protokol (TRAP). Som forventet blev RNA niveauer af hTERT steg i cellerne ektopisk udtrykker mutanten (fig. 3A). ingen ændringer i telomerase enzymatisk aktivitet, blev imidlertid observeret ved ekspression af mutant protein som bedømt af TRAP (fig. 3B), hvilket indikerer, at

NES-hTERT ikke udøver en dominerende negativ virkning på endogene protein i det mindste i form af enzymatisk aktivitet.

(A) Niveauer af hTERT-RNA blev målt ved hjælp af RT-PCR. GAPDH blev amplificeret og anvendt som indlæsning kontrol. (B) 100 ng af totale celleekstrakter blev anvendt til at udføre TRAP. Pil angiver intern kontrol af assayet. Positive og negative kontroller er ikke vist.

I telomerase negative fibroblaster, udtryk for

NES-hTERT fører til telomert og ekstra telomert DNA-skader [19]. Således anden mulig forklaring på faldet i spredning sats er, at

NES-hTERT inducerer DNA-skader i kræftceller, hvilket igen sinker deres evne til fremskridt gennem cellecyklus. Vi testede denne hypotese ved at vurdere tilstedeværelsen af ​​den phosphorylerede form af histon H2A variant γH2AX, og 53-bindende protein 1 (53BP1). Vi har også påvist DNA-skader direkte på telomerer ved immuno-fluorescens in situ hybridisering (immuno-FISH) i enkelte celler, blev mtDNA skader vurderet ved gen-specifik kvantitativ PCR (QPCR) [25] – [27].

En form for histon H2A fosforyleret ved serin 139 (S139 af γH2AX) er afgørende for en effektiv anerkendelse af DNA dobbelt streng pause (DSB) sites. Hundreder eller tusinder af γH2AX molekyler genererer nuklear foci, der kan findes på det sted, hver begyndende DSB ved immunofarvning med antistoffer til γH2AX [28] – [30]. 53BP1 aktiveres som en del af DNA-skade respons (DDR) og også danner foci [28], [29], [31]. Vi udførte enkelt celle analyse i SQ20B, LNCaP celler og deres respektive

NES-hTERT derivater som vi tidligere beskrevet [19], [29]. Cellerne blev scoret som havende DNA-skader, hvis de var positive for både γH2AX og 53BP1 brændpunkter. Antal og størrelse af foci påvist i hver enkelt celle blev kvantificeret og er repræsenteret i fig. 4A. I begge cellelinier mængden af ​​foci blev øget signifikant ved ekspression af

NES-hTERT (

s

= 0,006 for SQ20B og 0,034 for LNCaP celler). Det er bemærkelsesværdigt, at ekspression af den mutante protein førte til en betydelig stigning i celler der præsenterer større foci. For eksempel er antallet af SQ20B

NES-hTERT-celler viser 6 foci eller mere var 3 gange højere end i SQ20B kontrolceller (

s

= 0,004) (fig. 4A).

(A) Celler blev immunfarvet med antistoffer mod γH2AX og mod 53BP1. DNA blev modfarvet med DAPI. Grafen viser procentdelen af ​​celler positive for både γH2AX og 53BP1 foci og antallet og størrelsen af ​​foci per celle (ved de forskellige farver ifølge grafen mærkning). Søjler er gennemsnit ± s.d. (B) ImmunoFISH farvning at visualisere samtidigt DNA beskadigelse foci og telomerer. DAPI blev anvendt til kontrafarve DNA. Graf viser procentdel af DNA-skader foci lokaliseret på telomerer (TIF) pr enkelt celle. (C) mtDNA integritet blev analyseret ved QPCR i tre uafhængige forsøg. Graph show anslået læsion frekvens ± s.e.m.

Næste, vi evaluerede niveauer af telomer-induceret foci (TIF), der er blevet beskrevet som DNA-skader foci præsenteret på telomer sites. TIF kan opstå ved gradvis telomer erosion på grund af fortsat celleproliferation eller ved stokastisk telomert DNA-beskadigelse [31] – [34]. Vi har vedtaget en protokol, som vi tidligere beskrevet [29], og antallet af TIF-positive celler blev beregnet baseret på det totale antal analyserede celler. En celle blev betragtet TIF-positive, når 50% af største af DNA-skader co-lokaliseret med telomerer. Som vist i fig. 4B, niveauerne af TIF-positive celler blev forøget signifikant ved ekspression af den mutante hTERT. Faktisk TIF-positive celler steg ca. 2-fold i LNCaP baggrunden, mens i SQ20B denne forøgelse var mindre udtalt (fig. 4B). I SQ20B-celler, det basale niveau af TIF var høj: ca. 45% af cellerne var TIF-positive. Sådanne høje basale niveau af telomer skader var uventet, da disse celler udtrykker endogene telomerase, der formentlig bevarer deres telomerer. Men indførelsen af ​​

NES-hTERT førte til en yderligere stigning i TIF, der blev opdaget i omkring 70% af alle analyserede celler (fig. 4B, barer på venstre).

Endelig har vi analyseret mtDNA integritet ved QPCR, som vi tidligere har vist, at ekspressionen af ​​

NES-hTERT var forbundet med mitokondriel dysfunktion, herunder tab af mtDNA integritet i primære fibroblaster. Sådanne effekter blev tæt forbundet med det detekterede nuklear DNA-skader på telomert og ekstra-telomert steder [19].

Antages det, at skaden er tilfældigt fordelt, QPCR giver et samlet billede af integriteten af ​​genomet under undersøgelse [25 ] – [27]. Den assay måler integriteten af ​​DNA under anvendelse af lange PCR-mål, i dette tilfælde 8,9 kb i længden, hvilket er omkring 2/3 af hele mtDNA. Givne identiske betingelser, DNA fra kontrol og behandlede prøver Amplify forskelligt afhængigt af antallet af læsioner til stede på skabelonen ved tidspunktet for reaktionen. For eksempel, DNA fra celler udsat for UV forstærker mindre end DNA fra de respektive ikke-behandlet kontrol [35]. Mængden af ​​skader kan udtrykkes som antallet af læsioner pr 10 kb under forudsætning af en Poisson-fordeling af læsioner på skabelonen. Tilstedeværelse af læsioner afspejler, at prøven af ​​interesse forstærker mindre end dens kontrol, mens kan observeres negativt antallet af læsioner, når DNA’et fra en given prøve forstærker bedre end dens respektive kontrol. For at overvåge eventuelle ændringer i mtDNA kopi nummer, er en kort fragment af mitokondrie-genomet også forstærkes med henblik på at normalisere dataene. Følsomhed grænse for teknikken er en læsion /10

5 baser (for yderligere oplysninger om analysen, se referencer [25] -.. [27] og [35]

Dataene i fig 4C afspejle den gennemsnitlige ± SEM af 3 uafhængige analyser. Basale niveauer af læsioner i kontrollerne blev beregnet på baggrund af den gennemsnitlige forstærkning af kontrolprøver af hver cellelinje, som derefter blev anvendt som en reference til at sammenligne hver enkelt kontrol (for flere detaljer se fremgangsmåder afsnit). som forventet i både cellulær baggrunde ekspression af

NES-hTERT betydeligt basale niveauer af mtDNA beskadigelse (fig. 4C), hvilket antyder, at mitokondriel dysfunktion også forstærkes i cancercellerne ved ekspression af den mutante protein.

samlet set de fremlagte oplysninger i fig. 4 viser, at ekspressionen af ​​

NES-hTERT i telomerase-positive SQ20B og LNCaP celler fører til DNA-skader på telomere og ekstra-telomere steder, som ikke er forårsaget af et fald i niveauerne af aktivt enzym i kernen, men kan være forbundet med dysfunktionelle mitokondrier.

NES-hTERT øger følsomheden til genotoksisk stress i huden cancerceller

Ekspression af telomerase er blevet associeret med modulering af celledød induceret af genotoksiske midler. Sensibilisering, fremme og ingen virkninger på apoptose og /eller nekrose er blevet rapporteret, som synes at stole på den type celler, der undersøges, den genotoksisk stof, der anvendes, og, især, om længden af ​​telomerer [17], [36] – [45]. I betragtning af den betydelige stigning i basale niveauer af nukleare og mtDNA skader observeret ved ekspression af mutant hTERT, vi undersøgt, om cellerne ville blive yderligere overfølsomme over for genotoksisk stress. Til disse eksperimenter udvalgte vi SQ20B-celler, som vides at være meget radioresistente både med hensyn til DNA-skader og tab af proliferativ kapacitet [46], [47].

I et første sæt eksperimenter, vi udsat cellerne til

137Cs y-stråler. SQ20B-celler og dets

NES-hTERT-derivat blev udpladet ved tilsvarende antal blev beriget i G1 i 48 timer inden bestråling med vedligeholdelse i sammenflydende tilstand. Dette er vigtigt, fordi celler i forskellige faser af cellecyklussen forskellige i deres stråling følsomhed [48]. Celler blev udsat for 1 Gray (Gy) af γ- stråling (0,65 Gy /min), og vi analyseret nuklear DNA (nDNA) beskadigelse ved QPCR umiddelbart efter eksponeringen ved at overvåge integriteten af ​​en 13,5 kb fragment af β-globin genet [ ,,,0],25] – [27]. Resultaterne præsenteret i fig. 5A viser tydeligt en markant stigning i mængden af ​​γ-ray-induceret DNA-skader i SQ20B

NES-hTERT celler. Betragtninger i kontrol SQ20B celler, er en læsion observeret i hver 50 kb af genomet, omfanget af skader opdages i SQ20B

NES-hTERT celler er 5 gange højere, oversætte til en læsion hver 10 kb af dobbeltstrenget DNA ( fig. 5A).

(A) Nuclear DNA-skader blev anslået i SQ20B og dets

NES-hTERT-derivat umiddelbart efter udsættelse for 1 Gy gammastråling ved anvendelse QPCR. Resultaterne viser gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± s.e.m. (B) Celler blev behandlet med 200 pM af H

2O

2 i 60 minutter og fik lov at komme sig i 24 timer i konditioneret medium. På dette tidspunkt blev celler høstet, og antallet af apoptotiske, døde og levedygtige celler blev bedømt ved flowcytometri under anvendelse af PI og YOPRO-1. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) Den samme mængde af levedygtige celler (500.000) blev genudpladet efter H

2O

2 eksponeringer og deres vækstrate blev fulgt i 2 uger. Antallet af celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer efter 24 timer, og hver gang celler blev sammenflydende derefter. Da antallet af behandlede SQ20B

NES-hTERT ændrede sig ikke i de følgende 2 uger, er kun data i 24 timer efter behandling vist. Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± s.e.m. (* P ≤ 0,05).

Næste vi fastslået, om cellerne ville blive sensibiliseret til andre typer af belastninger. Til dette formål har vi udsat dem for hydrogenperoxid (H

2O

2) og analyseret celledød ved flowcytometri. Vi valgte H

2O

2 på grund af vores erfaring med denne oxidative stressor; blev udført eksperimenter som beskrevet af os tidligere [21], [49], [50]. Kort fortalt blev lige stort antal SQ20B-celler podet 16 timer før H

2O

2 engagementer. Cellerne blev behandlet med 200 uM H

2O

2 for 60 minutter i basalmedium i fravær af FBS og blev høstet enten umiddelbart efter udsættelse for H

2O

2 eller lov til at restituere i 24 timer i konditioneret vækstmedium. På begge punkter, blev mængden af ​​døde og apoptotiske celler scoret baseret på propidiumiodid optagelse (PI) og YOPRO-1 farvning. YOPRO-1 er et grønt-fluorescerende farvestof, der registrerer specifikt apoptotiske celler [51] – [55]. Celler blev analyseret ved flowcytometri at kvantificere med større tillid procentdelen af ​​levedygtige, døde og apoptotiske celler. Som blev der ikke observeret signifikante ændringer i disse parametre umiddelbart efter H

2O

2 behandling, de data, der præsenteres nedenfor vedrører 24 timers restitution punkt.

Figur 5B illustrerer eksperimenter, som er repræsentative for 3 uafhængige analyser. En stor stigning i mængden af ​​YOPRO-1 og PI-positive celler blev observeret i den behandlede SQ20B baggrund udtrykker mutanten hTERT (fig. 5B). Kvantificering af antallet af levedygtige, døde og apoptotiske celler afslørede, at mens en 2-fold stigning i antallet af døde celler (enten PI-positive kun eller PI og YOPRO positiv) blev observeret i SQ20B 24 timer efter behandlingerne, denne stigning var omkring 5 gange i SQ20B udtrykkende

NES-hTERT (fig. 5B). Nogen signifikante forskelle i den basale rate af døde /apoptotiske celler blev påvist ved sammenligning af ikke-behandlet SQ20B med mutant-udtrykkende derivat (fig. 5B, øvre paneler).

For at lede efter langsigtede virkninger af behandlinger, så fulgte vi de spredning satser kontrol og behandlede SQ20B og SQ20B

NES-hTERT i 2 uger efter, at H

2O

2 eksponering. Lige mange levedygtige kontrol og behandlede celler (0,5 x 10

6) blev udpladet og deres antal talt under anvendelse af et hæmocytometer i de første 24 timer, og hver gang cellerne nåede 100% konfluens derefter. Mens kontrol og behandlede SQ20B fordoblet i antal mindst én gang i de første 24 timer, blev der ikke observeret nogen ændring i celle nummer i behandlet SQ20B

NES-hTERT (fig. 5C). Bemærkelsesværdigt, disse celler forblev hvilende i yderligere 2 uger, når de endelig begyndte fordobling (data ikke vist). Disse resultater er særligt spændende i betragtning af at SQ20B huser en muteret p53, der er i stand til at inducere G1-S checkpoint ved DNA-beskadigelse [46], [47].

Taget sammen viste data i fig. 5 viser, at ekspressionen af ​​

NES-hTERT er i stand til at bevidstgøre SQ20B at y-stråling og at oxidativt stress forårsaget af H

2O

2.

Diskussion

I nærværende undersøgelse, vi viste, at indførelsen af ​​

NES-hTERT, en mutant, der er defekt i nuklear-cytoplasmatisk shuttling, i pladecarcinom (SQ20B) og prostatakræft (LNCaP) celler resulterer i betydelige forsinkelser i cellecyklusprogression, nedsat proliferation sats og forankringsuafhængig vækst (figur 1, 2). Disse virkninger blev ikke forbundet med nedsat endogen telomerase enzymatisk aktivitet, da ekspression af den mutante hTERT ændrede ikke TRAP-aktivitet (fig. 3). Vi observerede også øget DNA-skader i telomer og ekstra-telomere sites, og højere antal mtDNA læsioner under normale vilkår, udtryk for

NES-hTERT (fig. 4). Bemærkelsesværdigt, hTERT mutanten sensibiliserede SQ20B-celler, der ellers meget modstandsdygtige over for ioniserende stråling-induceret DNA-ødelæggelse og til celledød induceret af H

2O

2 (fig. 5). Tilsammen vores data tyder manipulere NES af hTERT eller telomerase s subcellulær shuttling som roman og effektivt middel til at modvirke tumorcellevækst.

NES-hTERT påvirker cellecyklus og tumorgenicitet af kræft celler

i