PLoS ONE: KML001 fremkalder apoptose og Autophagic celledød i Prostata Cancer Cells via oxidativ stress Pathway

Abstrakt

Vi undersøgte effekten af ​​KML001 (NaAsO

2, natrium metaarsenite, Kominox), et oralt biotilgængelige arsenforbindelse, på vækst og død af humane prostatacancerceller og dets virkningsmekanisme. Vækstinhibering blev vurderet ved cytotoksicitetsassays i nærvær eller fravær af inhibitor af apoptose, inhibitor af autofagi eller antioxidant

N

acetyl

L-cystein til at studere mekanisme for celledød induceret af KML001 i PC3, DU145 og LNCaP prostatakræft-cellelinier. Elektronmikroskopi, flowcytometri og Western blotting blev brugt til at studere apoptotiske og autophagic mekanismer. Den DU145 xenograft model blev anvendt til at fastlægge effekten af ​​KML001 in vivo. KML001 faldt levedygtigheden af ​​celler og øgede procentdelen af ​​annexin V-positive celler dosisafhængigt i prostatacancerceller, og LNCaP-celler var mere følsomme over for KML001 end PC3 eller DU145 celler. Elektronmikroskopi afslørede typiske apoptotiske tegn og autophagic vakuoler i celler behandlet med KML001. Udsættelse for KML001 i prostatacancerceller induceret apoptose og autofagi på en tids- og dosisafhængig måde. KML001 induceret dosisafhængig akkumulering af reaktive oxygenarter, og skylleluften de reaktive oxygenarter med

N

acetyl

L-cystein reducerede LC3 og spaltede poly (ADP-ribose) polymerase. KML001 inhiberede signifikant tumorvækst i DU145 xenograft model. Desuden blev der observeret signifikant fald i spredning og markante apoptose og autofagi i KML001-behandlede tumorer end i vehikelbehandlede tumorer. Eksponering af humane prostata kræftceller til KML001 inducerede både apoptose og autophagic celledød via oxidativ stress vej. Og KML001 havde en antiproliferativ virkning på DU145 celler i xenograft mus

Henvisning:. Du D, Kim Y, Jang MJ, Lee C, Jeong IG, Cho YM, et al. (2015) KML001 fremkalder apoptose og Autophagic celledød i Prostata Cancer Cells via oxidativ stress Pathway. PLoS ONE 10 (9): e0137589. doi: 10,1371 /journal.pone.0137589

Redaktør: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Canada

Modtaget: Marts 6, 2015; Accepteret: August 18, 2015; Udgivet: 9 September, 2015

Copyright: © 2015 Du et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Korea Health Technology R D Project og Sundhedsministeriet Velfærd (A062254 og A102059)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mens arsenforbindelser er almindeligt kendt som kræftfremkaldende, der inducerer kræft i mange humane væv, arsentrioxid (As

2O

3, ATO) er blevet påvist klinisk at være et effektivt terapeutisk middel til behandling af akut promyelocytisk leukæmi [1,2]. Selv om dens anticancer virkningsmekanismen ikke er godt forstået, er ATO vist sig at regulere forskellige biologiske funktioner, herunder celleproliferation, apoptose, differentiering og angiogenese i forskellige cellelinier [3]. Fordi ATO var en succes i behandling af akut promyelocytleukæmi [1,2,4], er arsenicals oplever en revival i moderne cancer medicin [5].

Arsen findes i tri- og penta-valente oxidationstrin som kemisk ustabile sulfid og oxid og som salte af natrium, kalium eller calcium. Trivalente arsenicals, herunder KML001 (NaAsO

2, natrium metaarsenite, Kominox) og ATO, hæmme mange enzymer ved at reagere med biologiske ligander, der har frie svovl grupper [3,6]. Tre større molekylære mekanismer for ATO-induceret apoptose er blevet evalueret, involverer mitogenaktiverede proteinkinaser, caspaser, og reaktive oxygenarter (ROS) [3]. Selv om virkningsmekanismen for ATO er velkendt [7-12], nemlig KML001 er stadig under efterforskning [13,14].

På grund af sin orale biotilgængelighed, vandopløselighed og lavere median lethal dose ( LD

50) i rotter, KML001 er mere egnet til kliniske anvendelser end ATO [13]. Vi har derfor undersøgt evnen hos KML001 at inhibere væksten og inducere celledød af human prostatacancer-cellelinier. Vi analyserede også, om autofagi er med apoptose involveret i KML001-induceret celledød i prostata cancer cellelinjer. Endelig har vi bestemt antitumorvirkningen af ​​KML001 i DU145 xenograft model.

Materialer og metoder

cellelinjer og reagenser

Den menneskelige prostata cancer cellelinjer, PC3, DU145, og LNCaP blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA, USA) og opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C. KML001 blev opnået fra Komipharm International (Gyeonggi-do, Korea). Z-VAD-FMK blev købt fra R Molecular Probes, Eugene, OR, USA) til den fluorescerende forbindelse 2′, 7′-dichlorfluorescein (DCF), og analyseret som beskrevet tidligere [16].

DU145 model

xenograft dyr

Alle aspekter af dyrs pleje og behandling blev udført i henhold til den ottende udgave af vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr udgivet i 2011. protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Asan Medical center, Seoul, Korea (2012-02-067). Fire uger gammel mand BALB /C nøgne mus (OrientBio, Seoul, Korea) blev subkutant podet med 5 x 10

6 DU145 celler. Når tumorerne nåede et gennemsnit volumen på ca. 100 mm

3 blev musene tilfældigt inddelt i kontrol- og behandlingsgrupper (6 dyr per gruppe). For DU145 bærende mus blev behandlingsgrupperne administreret KML001 (2,5 eller 10 mg /kg /d) og dagligt af orale gavages i 4 uger. Mus blev overvåget for toksicitet efter kropsvægt målinger, og tumorerne blev målt tre gange om ugen og volumen blev beregnet ved den modificerede ellipsoide formel: 0,52 x længde x (bredde)

2 [17]. Mus blev aflivet ved carbondioxid efter høst tumorer.

TUNEL-assay og Ki-67 immunhistokemisk farvning

Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) -medieret dUTP nick endemærkning (TUNEL) til påvisning af apoptotiske celler blev udført ved anvendelse af

in situ

påvisning celledød kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens protokoller. For billedanalyse blev tre tilfældigt udvalgte felter fra hver mus fotograferet ved 200 × forstørrelse med anvendelse af fluorescens mikroskopi (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).

For Ki-67 immunfarvning hjælp proliferationsmarkører, væv paraffinindlejrede sektioner var afparaffineres hjælp xylener og gradueret ethanol efterfulgt af antigen hentning hjælp IHC-Tek epitopgenfinding damper sæt (IHC verden, LLC. Woodstock, MD, USA). Slides-farvning blev udført som tidligere [18] beskrevne. For billeder og intensitet scoring blev tre tilfældigt udvalgte felter fra hver mus fotograferet ved 200 × forstørrelse med anvendelse et Olympus U-LH100L-3 kamera og Olympus Ix 71 software.

Statistisk analyse

Alle data blev vist som middelværdier ± standardafvigelser (SD). Statistisk signifikans blev behandlet på

s

0,05 og bestemmes af envejs variansanalyse (ANOVA).

Resultater

Effekt af KML001 om spredning af prostatacancerceller

Inkubation af androgen-uafhængige PC3 og DU145 og androgenafhængige LNCaP-prostatacancerceller med 0.0001-200 pM KML001 i 72 timer reducerede cellelevedygtighed på en dosis-afhængig måde. LNCaP-celler var mere følsomme end PC3 eller DU145 celler (Fig 1; tabel 1)

Celler behandlet med forskellige koncentrationer af KML001 blev inkuberet i 72 timer.. Alamar blue assay blev udført tre gange. Middelværdier er givet, at værdien af ​​kontrollen er 100%. PC3 (●,

tyk solid linje

), DU145 (▲,

tynd fast linie

), og LNCaP (▼,

tynd fast linie

).

Induktion af apoptotisk celledød

for at bestemme om behandling med KML001 (10 uM) inducerer apoptose blev ultrastruktur KML001-behandlede PC3 celler analyseret ved elektronmikroskopi. PC3 celler behandlet med KML001 viste typiske apoptotiske tegn, inklusive en mindre kerne, mere koncentreret cytoplasma, krøllet kernemembranen, og kromosomer kondenseret i en halvmåneklappen form med vedhæftede filer til de nukleare og cellemembranerne. Desuden blev observeret apoptotiske legemer når chromatin kondenseres og bristede til den nukleare margen. Lignende resultater blev observeret i DU145 og LNCaP celler behandlet med IC

50 koncentrationer af KML001 (5 uM og 1 pM, henholdsvis) (Fig 2).

For at undersøge mekanismen for KML001-induceret celledød, udførte vi annexin V flowcytometri assays. Behandling af disse celler med KML001 gav celler positive for kun og celler positive for annexin V og PI-farvning annexin V farvning. Disse resultater indikerer, at KML001 induceret celledød via både apoptose og nekrose (figur 3A).

(A) FACS-analyse af annexin V /PI-farvning. Resultater viser tidlig apoptose, defineret som annexin V-positive og PI-negative celler, og sen apoptose, defineret som annexin V-positive og PI-positive celler. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. (B) Western blot-analyse af tids- og dosisafhængig spaltning af PARP og aktivering af procaspase-3.

Vi fandt også, at eksponering af prostatacancerceller til KML001 resulterede i en tids- og dosisafhængig stigning i spaltningen af ​​PARP, samt aktiveringen af ​​procaspases-3, som medierer iboende apoptose (fig 3B). For at bekræfte rolle apoptose i KML001-induceret død prostatacancerceller, behandlede vi cellerne med caspaseinhibitoren Z-VAD-FMK. Vi fandt, at tilsætning af 20 uM Z-VAD-FMK faldt aktiveringen af ​​procaspases-3 i alle prostatakræft-cellelinier (data ikke vist), understøtter den hypotese, at KML001 induceret apoptose i prostatacancerceller.

Induktion af autophagic celledød

for at bestemme om behandling med KML001 (10 uM) inducerer autophagy blev ultrastruktur af PC3 behandlede celler undersøgt ved elektronmikroskopi. Vi observerede autophagic vakuoler, herunder autophagosomes eller autolysosomes, i KML001-behandlede PC3-celler, såvel som i DU145 og LNCaP-celler behandlet med deres respektive IC

50 koncentrationer af KML001 (Fig 2).

Prostatacancer celler udsat for KML001 blev undersøgt ved Western blotting, ved hjælp af en anti-LC3 antistof, der genkender begge former for LC3. Vi fandt, at ekspression af LC3 og /eller konvertering til LC3-II steg på en tids- og dosisafhængig måde, i forhold til ubehandlede celler (Fig 4A). For at bekræfte rolle autophagy i KML001-induceret død prostatacancerceller, behandlede vi cellerne med autofagi inhibitoren 3-MA. Vi fandt, at tilsætning af 2 mM 3-MA faldt ekspressionen af ​​LC3-II i alle prostatakræft-cellelinier (fig 4B). Desuden tilsætning af 1 mM 3-MA svækkede også KML-induceret celledød i alle prostatakræft-cellelinier (fig 4C). Tilsammen disse resultater understøtter hypotesen om, at KML001 induceret autofagi-medieret celledød i prostatacancerceller.

(A) Western blot-analyse af tids- og dosisafhængig omdannelse af LC3-I til-II. (B) Hæmning af 3-MA af KML001-induceret konvertering af LC3 i prostata kræftceller. (C) Celler blev eksponeret for 10 uM (PC3), 5 pM (DU145) eller 2 uM (LNCaP) KML001 i nærvær eller fravær af 1 mM 3-MA i 72 timer. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. *

s

0,05 ved envejs ANOVA.

Antioxidanten NAC beskytter celler fra KML001-induceret celledød

KML001 induceret dosisafhængig ROS-akkumulering i alle 3 prostata cancercellelinier (Fig 5A ). Vi undersøgte også effekten af ​​antioxidanten NAC på KML001-induceret apoptose og autofagi. Vi fandt, at behandling af alle 3 prostata cancer cellelinjer med 1 mM NAC faldt ekspressionen af ​​LC3-II og proteolysen af ​​PARP (Fig 5B). Desuden tilsætning af 1 mM NAC svækkede også KML-induceret celledød i alle prostatakræft-cellelinier (fig 5C). Disse resultater giver yderligere beviser for, at eksponering af prostata cancer celler til KML001 aktiveret både apoptose og autophagy via oxidativ stress.

Alle 3 prostatacancerceller blev behandlet med den angivne koncentration af KML001 i fraværet eller tilstedeværelsen af ​​5 mM NAC i 24 timer. (A) KML001 inducerer dosisafhængig ROS (blå) akkumulering. Celler blev farvet med DCFH-DA og vasket med PBS. Mere end tre felter i hver celle blev observeret ved fluorescens mikroskop (200 x), og repræsentative billeder vises. (B) NAC inhibering af KML001-induceret omdannelse af LC og caspaseaktivering i prostatacancerceller. (C) Celler blev eksponeret for 10 uM (PC3), 5 pM (DU145) eller 2 uM (LNCaP) KML001 i nærvær eller fravær af 1 mM NAC i 72 timer. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. *

s

0,05 ved envejs ANOVA.

Effekt på DU145 implanteret

Vi subkutant injiceret nøgne mus med 5 × 10

6 DU145 celler til at teste virkningen af ​​KML001 på androgen- uafhængige prostatacancerceller in vivo. Efter tumorstørrelsen nåede 100 mm

3, vi administreret KML001 (2,5 eller 10 mg /kg /d) til dem i 4 uger. I DU145 xenograft model, blev tumorvækst inhiberet med KML001 sammenlignet med vehikel (Fig 6A). Men KML001 behandling havde ingen virkning på kropsvægten af ​​mus (Fig 6B)

Vehicle og KML001 gruppe mus oralt modtaget saltvand og KML001 (2,5 eller 10 mg /kg /d) i 4 uger, hhv. *

s

0,05 vs. køretøj.

I det næste eksperiment, vi bestemt effekten af ​​KML001 på proliferation, apoptose, og autophagy i tumorvæv høstet fra dyr af forskellige behandlingsgrupper. I immunhistokemisk farvning af spredning markør Ki-67, blev der signifikante fald i Ki-67 immunfarvning observeret i KML001-behandlede tumorer end i vehikelbehandlede tumorer (Fig 7A). I TUNEL-assayet blev observeret signifikant større apoptotiske celler i KML001-behandlede tumorer end i vehikelbehandlede tumorer (Fig 7b). I Western blot analyse, fandt vi, at ekspressionen af ​​LC3 og /eller konvertering til LC3-II steg i en dosisafhængig måde, i forhold til bærerbehandlede tumorer (Fig 7C).

Tre felter i hver mus observeret ved fluorescens (200 ×) og lyse felt mikroskoper (200 ×), hhv. Repræsentative billeder af hver behandlingsgruppe blev vist. Køretøjer og KML001 gruppe mus oralt fik saltvand og KML001 (2,5 eller 10 mg /kg /d) i 4 uger, hhv. *

s

0,05 vs. køretøj.

Diskussion

Prostatakræft er en af ​​de førende dødsårsager blandt mænd i USA [19]. Selvom aggressiv indsats mod tidlig påvisning og behandling faldet dødeligheden for prostatakræft, prostatakræft er den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald blandt mænd endnu. Selvom tidlige fase prostatacancer kræver androgen for vækst og dermed reagerer på androgen afsavn terapi, kan sygdommen udvikle sig til androgen-uafhængighed og responderer muligvis ikke på androgen ablation [20]. Docetaxel-baserede kemoterapier har vist lindrende og overlevelse fordele for patienter med kastrationsresistent prostatacancer, men behandlingsresultaterne er generelt utilfredsstillende med en median overlevelsestid på kun 16 til 18 måneder [21,22]. Så er det ikke kun vigtigt at udvikle effektive måder at forebygge eller bremse dannelsen af ​​kastrationsresistent prostatacancer, men også at udvikle nye kemoterapeutiske stoffer til behandling af kastrationsresistent prostatacancer.

Siden ATO blev vist at have dramatiske virkninger i patienter med akut promyelocytisk leukæmi [1,2], har dette middel også blevet testet hos patienter med solide tumorer, herunder prostatacancer [23]. Både ATO og KML001 er trivalente arsenicals og identiske stoffer i opløsning, med tilsvarende cytotoksicitet over androgen-uafhængige prostatacancerceller [13]. Men den orale biotilgængelighed og vandopløseligheden af ​​KML001 antyder dets kliniske anvendelighed i forhold til ATO. Desuden KML001 viste sig at have højere LD

50 (41,6 mg /kg) i rotter sammenlignet med ATO (14,6 mg /kg) [13]. Så vi testede evnen hos KML001 at inhibere væksten og inducere celledød af human prostatacancer celle. Vi fandt, at KML001 behandling reducerede proliferation af alle 3 prostata cancercellelinier, er mere toksisk for androgenafhængige LNCaP-celler end til androgen-uafhængige celler. Vigtigere, KML001 havde en antiproliferativ virkning på androgen-uafhængige DU145 celler in vitro og in vivo.

ATO virker på maligne celler gennem en række mekanismer, der målrettes mod flere signaltransduktionsveje og resulterer i induktion af apoptose, antiproliferative aktivitet, og angiogenese [3]. Adskillige nyere undersøgelser har rapporteret, at ATO og KML001 kan målrette en telomer /telomerase kompleks [8-10,13]. KML001 binder til telomere sekvenser og udhuler telomer, hvilket resulterer i telomer-associeret DNA-skader induktion og telomer nedslidning. Desuden blev ATO sig at inducere type II programmeret celledød, autofagi, i malignt gliom-celler [11,24]. Vi har her vist, at KML001 behandling resulterede i dannelsen af ​​autophagic vakuoler, som dokumenteret ved elektronisk mikroskopi. Desuden KML001 inducerede en tids- og dosisafhængig stigning i LC3-II. Brug af autophagy inhibitoren 3-MA, vi bekræftet, at mekanismen for KML001-induceret celledød involverer autofagi. Autophagy er ikke kun ansvarlige for celledrab af sig selv, men deltager også i en dødelig signaleringsbegivenhed inducere apoptose eller nekrose [25,26].

Derudover fandt vi, at aktiveringen af ​​autofagi og apoptose ved KML001 var medieret ved oxidativ stress. ROS spiller en afgørende rolle i formidlingen af ​​cytotoksicitet induceret af KML001. Adskillige undersøgelser har fundet, at ROS spiller vigtige roller i reguleringen både normale cellulære processer og sygdomsprogression [27-29]. Derudover har akkumuleret ROS været kendt som nøglemellemproduktet for cytotoksiciteten induceret af kemoterapeutiske midler, herunder ATO [3].

En bekymring vedrørende anvendelsen af ​​arsen til kliniske anvendelser er dens toksicitet i mennesker. Kliniske undersøgelser har vist, at ATO ved koncentrationer under 2 uM inducerer ikke alvorlige bivirkninger [30,31]. Som nævnt ovenfor KML001 var mindre toksisk for rotter ved den samme koncentration af ATO [13]. I vores undersøgelse, KML001 havde nogen negativ virkning på kropsvægten af ​​DU145 xenograft mus. Vore resultater antyder derfor, at KML001 kan være klinisk anvendelige til patienter med kastrationsresistent prostatacancer.

de fleste kemoterapeutiske midler er rettet mod inhibering af væksten af ​​kastrationsresistent prostatacancer, androgen-afhængige og uafhængige prostatacancer celler er blevet rapporteret at være lige modtagelige for ATO-induceret apoptose [23]. Endvidere inhibering af ATO var mere udtalt i prostatacancerceller udtrykker androgenreceptoren end i prostatacancerceller depleteret for androgen receptor og inhibering af androgenreceptor aktivitet af ATO og af androgenreceptorantagonist, bicalutamid, blev additiv [24]. Disse resultater kan berettige den fremtidige vurdering af virkningerne af KML001, alene eller i kombination med androgen deprivation terapi, på progression af androgen-afhængige LNCaP til androgen uafhængighed i en nøgen mus xenograft model.

Konklusioner

Vi har vist her, at eksponering af androgen-afhængige og-uafhængig prostata kræftceller til KML001 aktiveret både apoptose og autophagic celledød via oxidativ stress. Desuden KML001 havde en antiproliferativ virkning på androgen-uafhængige DU145 celler in vivo.

Tak

KML001 blev tilvejebragt fra Komipharm International Co., Ltd., Gyeonggi-do, Sydkorea.

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Korea Health Technology R D Project og Sundhedsministeriet Velfærd (A062254 og A102059).