PLoS ONE: Computational Analyse af mRNA Expression Profiler Identificerer MicroRNA-29a /c som Predictor af kolorektal cancer Tidlig Recurrence

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende ondartede kræftformer med en hurtig stigning i forekomsten og dødelighed. De gentagelser af CRC efter helbredende resektion sommetider uundgåelige og ofte finde sted inden for det første år efter operationen. MikroRNA’er kan tjene som biomarkører at forudsige tidligt gentagelse af CRC, men at identificere dem fra over 1.400 kendte menneskelige microRNA’er er udfordrende og dyrt. En alternativ fremgangsmåde er at analysere eksisterende udtryk data af messenger RNA’er (mRNA’er), fordi generelt ekspressionsniveauerne af microRNA og deres mål mRNA’er er omvendt korreleret. I denne undersøgelse ekstraheret vi seks-mRNA-ekspression data for CRC i fire undersøgelser (GSE12032, GSE17538, GSE4526 og GSE17181) fra genekspression omnibus (GEO). Vi udledte microRNA udtryk profiler og udført beregningsmæssige analyse for at identificere microRNA forbundet med CRC gentagelse ved brug af IMRE metode baseret på mikrokosmos database, der indeholder 568,071 microRNA målgruppen forbindelser mellem 711 microRNA og 20,884 gen mål. To microRNA’er, miR-29a og miR-29c, blev offentliggjort og videre meta-analyse af de seks mRNA udtryk datasæt viste, at disse to microRNA var stærkt signifikante baseret på p-værdi kombination Fisher (p = 9,14 × 10

– 9 for miR-29a og p = 1,14 × 10

-6 for miR-29c). Desuden blev disse to microRNA’er eksperimentelt afprøvet i 78 humane CRC prøver at validere deres effekt på tidlig recidiv. Vores empiriske resultater viste, at de to microRNA var betydeligt nedreguleret (p = 0,007 for miR-29a og p = 0,007 for miR-29c) i de tidlige tilbagefald patienter. Denne undersøgelse viser muligheden for at benytte mRNA profiler til at angive microRNA. Vi viser også miR-29a /c kunne være potentielle biomarkører for CRC tidlig recidiv

Henvisning:. Kuo TY, Hsi E, Yang IP, Tsai PC, Wang JY, Juo S-HH (2012) Computational Analyse af mRNA Expression Profiler Identificerer MicroRNA-29a /c som Predictor af kolorektal cancer Tidlig Gentagelse. PLoS ONE 7 (2): e31587. doi: 10,1371 /journal.pone.0031587

Redaktør: Steve Horvath, University of California, Los Angeles, USA

Modtaget: 16. juli 2011; Accepteret: 9. januar 2012; Publiceret: 13. februar 2012 |

Copyright: © 2012 Kuo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Kaohsiung Medical University Hospital (KMUH98-8I04) (https://www.kmuh.org.tw/), Excellence for Cancer Research center Grant gennem finansiering af Department of Health, Executive Yuan, Taiwan, Republikken Kina (DOH100-TD-C-111-002) (https://science.doh.gov.tw/), og National Science Rådet for Republikken Kina (NSC 99-2320-B-037-014- MY3 og NSC 94-2314B037-104) (https://www.nsc.gov.tw/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende maligne cancere med mere end 500.000 dødsfald på verdensplan hvert år [1], [2]. Forekomsten og dødeligheden af ​​CRC i kinesisk er hastigt stigende i de sidste årtier [3]. For øjeblikket er den effektive behandling af CRC er kurativ resektion af tumoren med kemoterapi, men gentagelser er undertiden uundgåelige [4]. Blandt patienter med tilbagefald, 40% -50% af dem finder sted i det første år efter initial kirurgisk resektion, og mere end 90% ske inden fire år [5]. Tumoren fase og patologiske egenskaber er almindeligt anvendt til at forudsige prognosen og lette behandling af CRC patienter i praksis. Indtil videre er der ingen tilgængelige biomarkører til at forudsige en gentagelse af CRC.

For nylig har microRNA vist sig at være vigtige faktorer for at regulere mange gen funktioner i humane kræftformer [6], og microRNA’er er blevet foreslået som roman biomarkører for cancere [7]. Tidligere undersøgelser har vist, at microRNA ekspression er ændret i forskellige typer af cancer, herunder CRC [8], [9]. MikroRNA’er er endogene korte ikke-kodende RNA’er der kan binde til den 3 ‘utranslaterede regioner (UTR’er) af deres target messenger RNA’er (mRNA’er),. De fungerer som post-transkriptionelle regulatorer af genekspression [10] gennem translationel undertrykkelse og /eller mRNA nedbrydning i mange biologiske processer, herunder udvikling, celledifferentiering, celleproliferation, apoptose og metabolisme [11], [12]. Disse processer er normalt involveret i tumorigenese [13]. Selv om flere undersøgelser har rapporteret en sammenhæng mellem microRNA og CRC udvikling [14], [15], [16], [17], den rolle, microRNA forudsige CRC gentagelse er næppe undersøgt.

Op til oktober 2011, er blevet rapporteret mere end 1.400 menneskelige microRNA’er [18], [19]. Det er udfordrende, tidskrævende og dyrt at evaluere den funktionelle konsekvens af hver microRNA i forhold til CRC gentagelse. Der er udviklet Computational tilgange for at få mere information fra mRNA udtryk data [20], [21], [22], [23]. Det menes generelt, at ekspressionsniveauerne af de fleste microRNA og direkte mRNA-mål er omvendt korreleret fordi microRNA udøve translatorisk undertrykkelse eller nedbrydning mekanisme [21], [24]. Derfor microRNA udtryk profiler kan udledes mRNA udtryk data ved bioinformatiske metoder. For nylig er der blevet foreslået den IMRE metoden [22] til at forudsige microRNA ekspression ved anvendelse af mRNA datasæt og microRNA target databaser. I denne undersøgelse har vi opnået seks mRNA-ekspression datasæt af CRC patienter fra genekspression omnibus (GEO). Vi brugte beregningsmæssige analyse og meta-analyse til at forudsige microRNA relateret til CRC tilbagefald, især tidligt recidiv. Derudover brugte vi vores menneskelige CRC prøver at validere disse kandidat microRNA.

Materialer og metoder

Søg strategi for mRNA datasæt fra GEO

I oktober 2010 søgte vi GEO ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) til undersøgelser, leveres mRNA-ekspression data fra CRC patienter. De søgetermer var “kolorektal cancer” eller “CRC” i kombination med “human [organisme]”. I alt blev 110 studier oprindeligt identificeret. Vi begrænsede derefter antallet af undersøgelser af nøgleordene for “tilbagefald” og “tilbagefald” i deres abstracts, hvoraf fire studier (GSE12032, GSE17538, GSE4526 og GSE17181) blev udtrukket. Vi brugte den oprindeligt definerede tilbagefald i disse fire studier. Den tilbagefald var almindeligt defineret som en lokal recidiv eller fjernmetastaser af CRC inden for follow-up periode, og de opfølgende længder af disse undersøgelser varierede mellem 45,9 og 68,6 måneder. De GSE17181 og GSE4526 data kun rapporteret fjernmetastaser men de to andre datasæt angav ikke, hvilken type af tilbagefald i deres data. Vi hentede deres normaliseret mRNA udtryk data og prøve information fra GEO. De GSE17538 og GSE4526 studier brugt den samme genekspression platform (HG-U133Plus 2.0), mens de to andre undersøgelser anvendt to forskellige dem (AceGene Menneskelig Oligo Chip 30 K og Agilent-014.950 CGH Microarray). Detaljerede oplysninger om disse downloadede datasæt er sammenfattet i tabel 1.

Filtrering ud forsøgspersoner og sonder i datasæt

De downloadede datasæt inkluderet CRC patienter med forskellige tumor faser: fase II i GSE17181 , fase III i GSE4526, og stadier i-IV i GSE12032 og GSE17538. Vi valgte kun patienter med tumor stadie II og fase III, fordi de tilsammen et flertal af CRC patienter (-70%) [25], og dem med trin I og IV forudsat lidt information. Derfor blev skabt i alt seks trins-specifikke datasæt (tre fase II og tre trin III datasæt) til yderligere analyse. Da disse datasæt anvendte platforme med forskellige prober til påvisning mRNA-ekspression, udførte vi kvalitetskontrollen for disse datasæt ved hjælp af nedenstående to kriterier. Først, vi kasseret proberne med den inter kvartil interval (IQR) lavere end medianen af ​​den samlede probe-sæt s IQR for at fjerne de mindre differentielt udtrykte prober. Det andet, hvis et gen blev forhørt af multiple prober, den ene med den højeste IQR værdi blev bevaret, og resten blev fjernet. Efter filtrering procedure, blev mere end halvdelen af ​​generne filtreret i hver af disse datasæt (tabel 1)

Computational analyse af Imre at udlede formodede microRNA

IMRE metoden (http:. //www.lussierlab.org/IMRE) er udviklet til at tilregne microRNA ekspressionsniveauerne fra mRNA udtryk data baseret på vægtet og klassificeret ekspressionsniveauerne og formodede microRNA mål [22]. Denne metode forudsætter en omvendt korrelation mellem ekspressionen af ​​microRNA og deres direkte mRNA-mål [26], [27]. Mens anvende IMRE metode til hver data, vi identificeret et sæt enten opreguleret eller nedreguleret microRNA. Ved hjælp af denne metode blev en score, der repræsenterer microRNA udtryk niveau beregnet på baggrund af seks downloadede mRNA udtryk datasæt og mikrokosmos Mål, der er en microRNA måldatabase (se nedenstående afsnit af “Target forudsigelse database” for detaljer). De detaljerede procedurer var som følger: (1) mRNA i hver undersøgelse emne blev sorteret efter sit udtryk niveau, og derefter scoret i henhold til dens rang ved hjælp af orderedlist metoden [28] af BioConductor [29], og (2) udtrykket score på hver microRNA i hvert emne blev imputeret ved at beregne forskellen mellem middelværdien af ​​vægtede rang snesevis af sit mål gener og uden for målgruppen gener.

Target forudsigelse database

for at forudsige gen mål for en given microRNA, vi hentede den nyeste target forudsigelse database fra mikrokosmos mål, tidligere kaldet miRBase mål [30], [31] (mikrokosmos mål udgave 5, https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/) og hentet 568.071 forudsagt microRNA målgruppen forbindelser mellem 711 menneskelige microRNA og 20,884 gen mål. Microcosm Mål bruger Miranda algoritme, der er en af ​​de første miRNA target prædiktionsalgoritmen og en af ​​de mest anvendte algoritmer. Algoritmen er baseret på en dynamisk program for at søge efter maksimale lokale komplementaritet justeringer. For at validere mikrokosmos database, vi sammenlignede resultaterne mellem mikrokosmos Mål og miRNome, der blev anvendt i undersøgelsen GSE6631 [22]. Derudover har vi også bruge Miranda [32] og Targetscan [33] for at validere kandidatlandene microRNA’er foreslået af mikrokosmos database. Mikrokosmos databasen gav størstedelen af ​​microRNA (herunder den kausale en), der blev fundet ved den oprindelige undersøgelse [22] (tabel S1). En anden fordel at bruge mikrokosmos Mål var at den nyeste version (mål version v5) indeholder flere microRNA end miRNome (genereret i 2007). Derfor brugte vi databasen mikrokosmos for de efterfølgende undersøgelser.

Statistik analyse

Efter pointberegning, der repræsenterer ekspressionsniveauerne af hver microRNA for hver undersøgelse emne, vi listet potentielle microRNA at kunne tydelig en gentagelse fra ikke-gentagelse af de CRC patienterne. For hver microRNA, blev en empirisk p-værdi opnået ved anvendelse af 1000 permutationer. Den cutoff p vælges en værdi potentielle microRNA blev sat til at være lig med eller mindre end 0,1. Vi brugte denne liberale værdi for at reducere en type II fejl i den indledende analyse. Analysen blev udført ved hjælp af R statistisk pakke med BioConductor pakke tusmørke [34], [35].

For at reducere en type I fejl, vi yderligere kombineres resultaterne af de seks datasæt ved hjælp af meta-analyse for den oprindeligt udvalgte microRNA. Cochran Q statistik blev anvendt til at teste for heterogenitet blandt disse datasæt. Den meta-analyse blev udført på grundlag af effekten størrelse (forskellen i forudsagte score mellem tilbagevendende og ikke-tilbagevendende CRC patienter) og standardafvigelse. En samlet effekt størrelse og 95% konfidensinterval (95% CIS) blev rapporteret. For at identificere den mest betydningsfulde microRNA med den mindste globale p-værdi og for yderligere at øge styrken, vi foretaget en fælles analyse ved at kombinere rå p-værdier baseret på Fishers kombinationen af ​​p-værdier [36] med cutoff p-værdi på 5 × 10

-5 (~0.05 /711, 711 microRNA).

Bench eksperimenter for at bekræfte resultaterne

for at verificere kandidatlandene microRNA’er angivet ved ovennævnte beregningsmetode og meta-analyse, vi yderligere indsamlet 78 CRC tumorvæv på Kaohsiung Medical University Hospital. De clinicopathologic kendetegn ved disse 78 patienter er vist i tabel S2. Disse prøver blev opnået kirurgisk fra CRC patienter med UICC stadium I-III og lynfrosset i flydende nitrogen ved -80 ° C. For at undgå den potentielle indflydelse af neoadjuverende behandling på microRNA udtryk, gjorde alle de patienter, der ikke undergår neoadjuverende behandling, kemoterapi eller strålebehandling før operationen. Et skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient og forsøgsprotokollen blev godkendt af Institutional Review Board i Kaohsiung Medical University Hospital. Disse 78 patienter blev samlet i tidlig recidiv (43 tilfælde) og ikke-tidlige tilbagefald grupper (35 kontroller). Der er ingen signifikant forskel i alder og køn mellem de to grupper. Tidlig tilbagefald blev defineret som lokalt recidiv (tumorvækst begrænset til anastomosen eller regionen af ​​den primære drift) eller fjernmetastaser (fjernmetastaser eller diffus peritoneal såning) inden for 1 år efter radikal resektion [5], [24], [37] . Ikke-tidligt tilbagefald blev defineret som ingen gentagelse inden for 1 år. Især kan nogle af ikke-tidlige tilbagevendende patienter har tilbagefald som opfølgning fortsætter.

Ca. 100 mg væv blev homogeniseret ved hjælp af en bench-top homogenisator (Polytron PT1600E, Kinematica AG, Lucerne, Schweiz) i 1 ml af TRIzol-reagens (Invitrogen) og oprenset med Qiagen RNAeasy Columns (Qiagen). Vi ekstraheret og oprensede totale RNA’er fra hver tumor væv, og TaqMan microRNA RT-qPCR (Applied Biosystems) assays blev anvendt til at kvantificere microRNA ekspressionsniveau. Real-time PCR blev udført under anvendelse af Applied Biosystems 7500 Sequence Detector System. Alle real-time PCR reaktioner blev kørt tredobbelt. U6b blev anvendt som den interne kontrol, fordi det er en almindeligt anvendt intern kontrol for microRNA ekspression normalisering og også fordi U6b har vist relativt stabilt baseret på vores interne data. Den relative udtryk niveau af en microRNA blev beregnet ved hjælp af ligningen, log

10 (2

-ΔCt), hvor ACt = (CT

miR-CT

U6b). Gennemsnittet af log

10 (2

-ΔCt) og dens standardafvigelse (SD) blev også beregnet. Vi sammenlignede forskellen i microRNA ekspressionsniveauer mellem de tidlige og ikke-tidlige tilbagevendende grupper af uafhængige t-test og multipel ANCOVA-analyse med justering for alder, køn og stadium af tumoren. Vores eksperimentelle data blev inddelt i to grupper efter medianen af ​​hver miR-29a og miR-29c data. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at påvise sammenhængen mellem tilbagefald tid efter kirurgi og dikotomiseret miRNA ekspression. Signifikansniveauet blev sat til 0,05. De statistiske analyser blev udført ved hjælp SAS9.1.

Resultater

Identifikation af miR-29a og miR-29c som kandidat microRNA for CRC tilbagefald

Ved at anvende IMRE metode til de seks uafhængige CRC mRNA microarray datasæt, vi identificeret fire mikroRNA (miR-29a, miR-29c, miR-100 og miR-627) i fase II-datasæt og tre mikroRNA (miR-29a, miR-29c og miR-363) i fase III datasæt med ap værdi ≦ 0,1 (tabel 2). Blandt dem, blev MIR-29a og MIR-29c er angivet i både trin II og III datasæt. Figur 1 viser, at miR-29a havde en højere score i de tilbagevendende patienter (angivet som en) end de ikke-tilbagevendende patienter (angivet som 0) i alle seks datasæt. Fordi scoren blev beregnet ud fra et sæt af miR-29a target gener ‘udtryk værdier, en højere score betyder, at disse målgener blev opreguleret i gentagelse gruppen. Med andre ord, den inverse korrelation mellem en microRNA og dens målgen indikerede, at MIR-29a blev nedreguleret i gentagelse gruppe, og det kan således spille en rolle som en tumorsuppressor af CRC. Den lignende mønster blev også observeret for MIR-29c (data ikke vist). I denne undersøgelse har vi ikke identificere nogen opreguleret microRNA nå vores definerede cutoff punkt (P ≦ 0,1) mellem de tilbagevendende og ikke-tilbagevendende patienter i alle seks datasæt.

y-aksen er en score, der repræsenterer ekspressionsniveauer af mIR-29a og x-aksen er grupperne med og uden fornyet CRC. Gruppen “1” henviser til gentagelse gruppen og “0” henviser til den ikke-tilbagevendende gruppe. Scoren blev beregnet ud fra et sæt af miR-29a målrettede gener ‘udtryk værdier, en højere score betyder, at disse målrettede gener var opreguleret i gentagelse gruppen “1” .Den lignende mønster blev fundet for miR-29c.

meta-analyse for miR-29a og miR-29c

Vi udførte meta-analyse for at vurdere intensiteten af ​​sammenhængen mellem de to microRNA og gentagelse af CRC (figur 2) . Brug meta-analyse, forventede vi at opnå de overordnede og mere pålidelige resultater. Den tilfældige effekt model viste en effekt størrelse på 213,36 (95% CI: 147,38 til 279,34) for miR-29a og en effekt størrelse på 176,91 (95% CI: 111,63 til 242,18) for miR-29c. Faktisk fixed effect-modellen gav også identiske resultater. Fishers kombination af p-værdier viste p = 9,14 × 10

-9 for miR-29a og p = 1,14 × 10

-6 for miR-29c. Der var ikke signifikant mellem-datasæt heterogenitet for de to mikroRNA (p = 0,59 for miR-29a og p = 0,69 for miR-29c).

I metaanalysen, effekt størrelse (forskellen i forudsagte score mellem tilbagevendende og ikke-tilbagevendende CRC patienter) og standardfejl blev beregnet for hver undersøgelse. En samlet effekt størrelse og 95% konfidensintervaller (95% CIS) blev rapporteret med p-værdier estimerede baseret på Fishers kombinationen af ​​p-værdier [36].

Vi derefter yderligere analyseret mRNA’erne og deres veje i relation til CRC gentagelse at få mere indsigt i sygdommen patogenese. Først, vi opført top 10 veje beriget med miR-29a /29c målgener (Tabel S3). Så vi listet de øverste målgener, der er mest markant i forbindelse med CRC tilbagefald i GEO datasæt (tabel S4). Cdc42, som er involveret i 3 store veje (se tabel S3), var signifikant forskellig mellem tilbagevendende og ikke-tilbagevendende patienter (kombineret p = 0,00053).

miR-29a og miR-29c ekspressionsniveauet i CRC prøver

Vi yderligere indsamlet 43 CRC patienter af tidlig recidiv og 35 patienter af ikke-tidlig recidiv at validere miR-29a og miR-29c med hensyn til forudsigelse af CRC tidlig recidiv. Vi fandt, at både MIR-29a og MIR-29c havde betydeligt lavere ekspressionsniveauer i de tidlige gentagelse gruppen end ikke-tidlig recidiv gruppe (begge p-værdier var 0,007 korrigeret for køn, alder og kræft stadium). Begge microRNA fortsat betydelig, selv efter at udelukke de 10 forsøgspersoner (8 ikke-tidlige fag og 2 tidlige emner) af kræft fase I (tabel 3). Vores empiriske resultater er aftalt med resultaterne fra den beregningsmæssige analyse baseret på mRNA microarray datasæt, hvilket indikerer, at de to microRNA spiller en vigtig rolle i den tidlige gentagelse af CRC. I Kaplan-Meier-analyse, viste vi, at enten et højt niveau af MIR-29a eller MIR-29c havde en bedre overlevelse ved 12

th måned, men kun MIR-29a i væsentlig grad kan forudsige tidlige gentagelse (fig S1). Den manglende forudsigelse af miR-29c i Kaplan-Meier analyse kan skyldes en kort opfølgning eller et upassende cutoff på grund af en lille stikprøve.

Diskussion

studiet af microRNA har indledt en ny æra for en bedre forståelse af sygdomsmekanismer. Men er stadig ikke klart, hvilken rolle microRNA i gentagelse af CRC. I denne undersøgelse identificerede vi miR-29a og miR-29c som vigtige kandidater ved at ansætte en genial metode, prioriteret kandidat microRNA fra offentligt tilgængelige genom-dækkende genekspression datasæt. Brug meta-analyse på offentligt tilgængelige datasæt og eksperimentel bekræftelse, vi direkte målt og valideret miR-29a og miR29c som prædiktorer for CRC tidlig recidiv. Så vidt vi ved, ikke er blevet indberettet disse to microRNA at være relateret til tidlig gentagelse af CRC.

For at udlede microRNA udtryk, vi anvendt IMRE metode kombination af microRNA mål forudsigelse og mRNA udtryk data. Den største fordel ved denne metode er at få adgang offentlige mRNA-ekspression datasæt til identificering af formodede microRNA’er relateret til de sygdomme af interesse. Men en robust estimering for microRNA ekspression afhænger også af en pålidelig mål forudsigelse database. Her brugte vi mikrokosmos Mål til forudsigelse af microRNA målgener. Vi brugte ikke foreningen af ​​at kombinere forskellige forudsigelse algoritmer, såsom miRNome, fordi det er sandsynligt at reducere kraften på grund af mange fejlagtigt forudsagte mål. Udover mikrokosmos Mål, vi også brugt yderligere to forudsigelse databaser, Miranda [32] (August 2010 Meddelelse med god mirSVR score, bevaret microRNA) og Targetscan [33]. miR-29a og miR-29c blev også indikeret af disse to microRNA prædiktiv software for at være involveret i CRC tilbagefald, hvilket indikerede robusthed IMRE metoden. , Signifikansniveauet var dog lavere ved hjælp af Miranda (p = 0,0173 for miR-29a og p = 0,00197 for miR-29c i p-værdi kombination) end mikrokosmos Mål (p = 9,14 × 10

-9 for miR-29a og p = 1,14 × 10

-6 for mIR-29c). Årsagen kan skyldes flere forudsagte mål af miranda end mikrokosmos Mål.

Der er gjort en stor fremskridt at identificere sammenhænge mellem microRNA og flere almindelige sygdomme, men det er stadig dyrt at gennemføre en genom-dækkende udtryk array til at udlevere sygdomsrelaterede microRNA’er. Selvom brug af bioinformatiske værktøjer som IMRE metode kan reducere antallet af kandidater og prioritere disse kandidater, et stort antal falske positiver er uundgåelige. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at nogle meget vigtige microRNA forudsagt via denne beregningsanalyse i ét datasæt ikke kunne gentages i andre datasæt. Stedet for at bruge den konservative Bonferroni-metode, analyserede vi flere datasæt til at identificere de konsekvente microRNA at reducere type I fejlen. Forsøget i humane prøver yderligere bekræftet i silico konstatering.

Vores resultater viser, at nedregulering af MIR-29a og MIR-29c er forbundet med den tidlige fornyet CRC. Nedreguleringen af ​​MIR-29 familien er blevet rapporteret i forskellige humane cancere, herunder lungecancer [38], prostatacancer [39] og invasiv brystcancer [40]. En nylig undersøgelse har vist, at MIR-29 er involveret i p53 pathway, en vigtig tumor suppressor regulator [41]. MIR-29 aktiverer p53 og inducerer apoptose via suppression af Cdc42 og p85α [41]. Vores analyse for miR-29 mål foreslog, at cdc42 (kombineret p-værdi = 0,00053 i tabel S4) og andre mRNA vil sandsynligvis blive involveret i den potentielle vej af CRC udvikling. Desuden blev den mutante form af p53 observeret hos 51-74% af alle CRC og andre humane tumorer [42]. De ovenstående undersøgelser tilbyder en biologisk plausibilitet at støtte den rolle, miR-29 familie i undertrykke CRC tilbagefald.

Ud over microRNA, en gentagelse af CRC kan også påvirket af tumor etaper og den periode af føl- op. I beregningen analyse, vi kun fokuseret på CRC patienter med tumor trin II og trin III, fordi de udgjorde størstedelen af ​​CRC patienter. Kun få patienter på trin udviklede jeg tilbagefald, og de fleste af patienterne på stadie IV udviklede recidiv efter operation fører til mindre nyttige oplysninger til vores undersøgelse. Selvom vores empiriske undersøgelse anvendes tidligt recidiv (dvs. gentagelse finder sted inden for 1 år efter operationen) som fænotypen af ​​interesse, nylige rapporter viste, at 40-50% af gentagelser viser sig inden for det første år efter initial resektion, og tiden fra det indledende behandling til recidiv er stærkt relateret til overlevelse [43] vores eksperimentelle resultater fra de menneskelige prøver af tidlig recidiv aftalt med konstateringen fra den beregningsmæssige analyse, der var baseret på patienter til en opfølgning af 3-6 år, hvilket indikerer, at vores eksperimentelle konstatering er mindre tilbøjelige til at blive påvirket af opfølgningen længde.

Vi valideret miR-29a og miR-29c som biomarkører for CRC tidlig recidiv. De andre tre mikroRNA (MIR-100, miR-627 og MIR-363) blev også identificeret ved den beregningsmæssige analyse, men de var kun signifikant i patienter af begge stadie II eller stadie III. Derfor blev de ikke yderligere undersøgt i den foreliggende undersøgelse på grund af en lavere prioritet end MIR-29. Vores begrænsede antal eksperimentelle prøver også kan ikke give en tilstrækkelig strøm til at analysere disse to microRNA, der kun signifikant i en cancer fase. I betragtning af, at vores vigtigste formål med denne undersøgelse er at vise muligheden af ​​denne beregningsmæssige tilgang til at identificere nyttige microRNA, uden at analysere disse tre potentielle microRNA ville ikke reducere videnskabelige bidrag fra vores undersøgelse.

Som konklusion, denne undersøgelse viste en effektiv strategi ved at kombinere den i silico analyse og den empiriske eksperiment for at foreslå microRNA-29a og microRNA-29c som potentielle biomarkører til at forudsige tidligt gentagelse af CRC. Ved hjælp af disse biomarkører kan give sundhedsmæssige og patienter til at tage en mere effektiv måde at forhindre CRC gentagelse. Derudover vores undersøgelse giver også en retning til yderligere undersøgelse af mekanismen af ​​recidiverende CRC.

Støtte Information

Figur S1. Salg Forsøgspersonerne blev dikotomiseret at have høje eller lave microRNA niveauer ifølge medianen af ​​1,39 for miR-29a og 0,58 for miR-29c. Den fuldt optrukne linie angiver gruppen på højt niveau, og streg linje betyder gruppe lavt niveau

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031587.s001

(DOC)

tabel S1.

Væsentlige microRNA med p-værdier og falsk opdagelse sats (FDR) [1], [2] af miRNome og mikrokosmos Mål i GSE6631. De fleste af betydelige microRNA’er (herunder den kausale én, miR-204, er angivet med understregning linje) blev vist ved begge de to mål forudsigelse database, miRNome og mikrokosmos Mål, i GSE6631

doi:. 10,1371 /journal.pone. 0031587.s002

(DOC)

tabel S2.

Clinicopathologic karakteristika for de 78 patienter med tarmkræft.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031587.s003

(DOC)

tabel S3.

Top 10 beriget veje med miR29a eller miR29c målgener analyseret af MetaCore vej analysesystem.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031587.s004

(DOC)

Tabel S4.

Betydelig sammenslutning af mir-29a /29c målgener med gentagelse af CRC i datasæt.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031587.s005

(DOC)