PLoS ONE: TASK-1 Regulerer Apoptose og spredning i en delmængde af ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald verdensplan; overlevelsestider er fattige trods terapi. Den rolle af de to-pore domænet K

+ (K2P) kanal TASK-1 (KCNK3) i lungekræft i øjeblikket ukendt. Vi fandt, at TASK-1 udtrykkes i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinjer på forskelligt niveau. I en stærkt TASK-1 udtrykker NSCLC cellelinje, A549, en karakteristisk pH- og hypoxi-følsomme ikke-inaktivering K

+ strøm blev målt, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​funktionelle OPGAVE-1 kanaler. Hæmning af TASK-1 førte til betydelig depolarisering i disse celler. Knockdown af TASK-1 ved siRNA væsentligt forbedret apoptose og nedsat proliferation i A549 celler, men ikke i svagt TASK-1 udtrykker NCI-H358 celler. Na

+ – koblede transport af næringsstoffer over cellemembranen er funktionelt koblet til udstrømning af K

+ via K

+ kanaler, således TASK-1 kan potentielt påvirke Na

+ – koblede transport af næringsstoffer. I modsætning til TASK-1, som ikke var udtrykkes forskelligt i lungekræft vs normal lungevæv, vi fandt Na

+ – koblede transportører næringsstoffer,

SLC5A3

,

SLC5A6

, og

SLC38A1

, transportører til myo-inositol, biotin og glutamin, henholdsvis at blive væsentligt overudtrykt i lunge adenokarcinomer. Sammenfattende viser vi for første gang, at opgaven-1 kanal regulerer apoptose og spredning i en delmængde af NSCLC

Henvisning:. Leithner K, Hirschmugl B, Li Y, Tang B, Papp R, Nagaraj C et al. (2016) OPGAVE-1 Regulerer Apoptose og spredning i en delmængde af ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 11 (6): e0157453. doi: 10,1371 /journal.pone.0157453

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, UNITED STATES

Modtaget: December 14, 2015; Accepteret: 31. maj 2016 Udgivet: 13 juni 2016

Copyright: © 2016 Leithner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. For i silico analyser genekspression datasæt i lungeadenokarcinom prøver og normale lunger (GDS3257) offentliggjort på Gene Expression Ominbus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) blev anvendt.

Finansiering : undersøgelsen blev støttet af midler i den østrigske nationalbank (Anniversary Fund, projekt nummer 12713 til HO). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Vores arbejde blev finansieret af Oesterreichische Nationalbank (Anniversary Fund, projekt nummer 12713). Oesterreichische Nationalbank har ingen kommercielle interesser forbundet med de finansierede projekter, herunder vores projekt. Oesterreichische Nationalbank er ejet af den føderale regering i Østrig, og årsdagen Fonden understøtter kun uafhængig forskning fra meget forskellige forskningsområder. Projekterne gennemgås af uafhængige, internationale forskere (peer review), og de opnåede resultater er ikke i nogen form udnyttet af Oesterreichische Nationalbank, heller ikke Oesterreichische Nationalbank har nogen indflydelse på formålet med projekterne. Dette ændrer ikke vores tilslutning til PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Lunge cancer udgør det største antal kræftdødsfald i verden [1]. Ca. 85% af lungekræft er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og 15% er små-celle lungekræft. Lungekræft er ofte fremføres på diagnosetidspunktet [1] og overlevelse er dårlig trods terapi [2].

K

har vist + kanaler at være involveret i stort set alle kendetegnende for kræft, såsom vedvarende spredning , unddragelse af apoptose, og invasion (for gennemgang se [3,4]). I alt 77 gener koder kaliumkanaler. Fire vigtigste klasser af K

+ kanaler findes: spænding-gated K

+ kanaler, calcium-aktiverede K

+ kanaler, aktiv ensretter K

+ kanaler, og to-pore domænet K

+ -kanaler (K2P kanaler) [3]. Mens mange K

+ kanaler åbne på en specifik trigger, f.eks ændringer i membranpotentialet, K2P kanaler er konstitutivt aktiv. En funktionel K2P kanal er en dimer af to kanalunderenheder [5,6]. K2P kanaler er grupperet i seks underfamilier baseret på deres strukturelle og funktionelle egenskaber. En af grupperne, den TASK (Twik-relateret, syre-sensitive) K

+ kanal familie, omfatter syre-og iltfølsomme K2P kanaler, TASK-1 (kodet af

KCNK3

gen ), TASK-3 (

KNCK9

), og TASK-5 (

KCNK15

) [5,6]. OPGAVE-5 er strukturelt relateret til TASK-1 og TASK-3, men er elektrisk tavs. TASK-1 er unik blandt ionkanaler i at generere en åben-ensretter “lækage” K

+ strøm, er reguleret af både, en stigning eller et fald i den ekstracellulære pH i fysiologiske område [5,7]. Egenskaberne for TASK-3 ligner TASK-1, men pK for TASK-3 strømme er flyttet til et mere surt niveau (pH 6,7) [5,7]. Udover forskellige funktioner i neuroner, har TASK-1 vist sig at være funktionelt udtrykt i hjertet, og for at sætte den hvilende membranpotentiale og regulere tonen i glatte muskelceller i pulmonale arterier, tarm, og blære [5,7]. Desuden har TASK-1 vist sig at være en markør for brunt fedtvæv [8,9].

K2P kanaler, ligesom TASK-1 kanal, normalt give udstrømningen af ​​K

+ fra celler langs deres elektrokemiske gradient. Sammen med virkningen af ​​Na

+ /K

+ – ATPase, K

+ udstrømning bestemmer hvilende membranpotentiale [5,7]. Da kontrollen af ​​membranpotentialet er også vigtig i ikke-exciterbare celler, fx til styring af spændingsafhængige calcium indrejse, men også for Na

+ – drevet stoftransport, vi vurderet, om TASK-1 er funktionelt udtrykkes i lungekræft celler og humane lungekræft

Materialer og metoder.

cellelinjer

Den menneskelige NSCLC cellelinjer A549 (. kat nr 300.114), A427, og SK-MES-1 (SK-MES (kat nr 300.111.); Cat. No. 300.339) blev købt direkte fra cellelinier service (Eppelheim, Tyskland). A549 og A427-celler blev dyrket i DMEM /F-12-medium (Gibco, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, Biowest, Ringmer, UK) og antibiotika (penicillin og streptomycin). SK-MES-1-celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FCS og antibiotika. De humane NSCLC cellelinjer NCI-H23 (herefter benævnt H23, ATCC CRL-5800), NCI-H358 (herefter benævnt H358, ATCC CRL-5807), og NCI-H441 (yderligere benævnt H441, ATCC nr HTB-174) blev erhvervet direkte fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). MOR celler og NCI-H460-celler (yderligere benævnt H460) var en gave fra Martin P. Barr, Institut for Molekylær Medicin, St. James Hospital og Trinity College Dublin, Dublin, Irland. H23, H358, H441, H460, og MOR-celler blev dyrket i RPMI (Gibco), suppleret med 10% FCS (Biowest) og antibiotika. Tests for at udelukke forurening med mycoplasma blev udført regelmæssigt.

NSCLC og lungevæv

NSCLC vævsprøver og tilsvarende vævsprøver normal lunge blev indhentet fra tolv patienter, der blev henvist til kirurgisk resektion til afdelingen af thorax og Hyperbar Kirurgi, Medical University of Graz. Før operation underskrevet skriftligt informeret samtykke til denne særlige undersøgelse blev opnået fra alle patienter. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité i det medicinske universitet i Graz (Graz, Østrig) og gennemføres i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki.

Hypoksisk behandling

NSCLC celler blev udsået i kultur fade og fik lov til at fæstne i 24 timer. Derefter celler blev dyrket i 72 timer ved 37 ° C i omgivelserne (21%) oxygen eller 1% oxygen i automatiserede Xvivo System G300CL (BioSpherix, Lacona, NY) før RNA-ekstraktion, protein prøvetagning, eller patch clamp optagelser. Eksponering for oxygen blev reguleret gennem eksperimenterne i den hypoxiske arbejdsstation. PH af dyrkningsmediet blev målt ved afslutningen af ​​forsøget under anvendelse af WTW 3110 pH-meter (WTW, Weilheim, Tyskland) umiddelbart efter udtrækning fra inkubatoren.

Elektrofysiologi

engros- celle patch-clamp-teknikken blev anvendt som beskrevet tidligere til at måle den hvilende membranpotentiale under strømtang og K

+ strømme under spænding clamp [10]. Alle reagenser blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kort beskrevet blev celler overhældt ved stuetemperatur med bad-opløsning (i mM): NaCl 140,5, KCI 5,5, CaCI

2 1,5, MgC

2 1, Glucose 10, Na

2HPO

4 0,5, KH

2PO

4 0,5, HEPES 10; pH justeret til 7,3 med NaOH. For TASK-1 optagelse, blev pipetter fyldt med følgende løsninger (i mM): KCI 20, kalium methansulfonat (at undertrykke Cl

– strømninger) 135, MgCl

2 1, CaCl

2 0,1, Na

2ATP 2, ethylenglycol-bis (ß-aminoethylether) -N, N, N ‘, N’-tetraeddikesyre (EGTA) 3, HEPES 20; pH justeret til 7,2 med KOH. Den ikke-inaktivere TASK-1 K

+ strøm (I

KN) blev opnået fra bedriften potentiale 0 mV, ved at træde spændingen til 60 mV og derefter ramping til -100 mV over en periode på 1,6 sekunder . For at isolere den ikke-inaktivere TASK-1 K

+ strøm (I

KN) fra spændingsafhængige K

+ strømme blev cellerne fastspændt ved 0 mV i mindst 5 min. Data blev analyseret med pCLAMP 9.0 software (Axon Instruments, Foster City, CA).

Gene silencing med siRNA

siRNA målrettet TASK-1 og ikke-silencing siRNA blev opnået fra Ambion (Waltham , MA). Ikke-silencing siRNA (Negativ kontrol # 1 siRNA, Ambion) viser ingen sekvenshomologi med humane gensekvenser. Transfektion blev udført ved en slutkoncentration på 40 nM siRNA hjælp Effectene (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Effekten blev vurderet 48, 72 og 96 timer efter transfektion ved qPCR og Western blot.

RNA-ekstraktion og cDNA-syntese

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen) kombineret med DNase-fordøjelse (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA (1 ug) blev revers transkriberet under anvendelse af RevertAid H Minus First Strand cDNA-syntese kit (Fermentas, Burlington, Canada).

Kvantitativ real-time PCR (qPCR)

qPCR reaktioner var udføres i 7900 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved hjælp af TaqMan

® Gene Expression Analyser (Applied Biosystems)

KCNK3

(TASK-1), Hs00605529_m1;

KCNK9

(TASK-3), Hs00363153_m1;

SLC2A1

(GLUT1), Hs00892681_m1;

HK2

, Hs00606086_m1;

ACTB Hotel (ß-actin), Hs99999903_m1 (henvisning gen). PCR blev udført i 10 pi reaktioner indeholdende cDNA (svarende til 25 ng total RNA), 1x TaqMan

® Gene Expression Mastermix (Applied Biosystems) og 1x TaqMan

® Gene Expression Assay (Applied Biosystems). Mean tærskelcyklus (Ct) antal af tredobbelte kørsler blev anvendt til dataanalyse. Den relative ekspression af genet af interesse i behandlede versus kontrolceller blev beregnet som 2

ΔΔCt. ACt blev beregnet ved at trække Ct antal genet af interesse fra referenceproteinets genet. Ved beregning af ΔΔCt blev ACt-værdier af kontrol gruppen trækkes fra ACt-værdier af den behandlede gruppe. Salg

Western blot

Celler blev lyseret på is i RIPA-buffer (Sigma-Aldrich ) indeholdende proteaseinhibitorer. 50 ug protein blev sat på en 10% acrylamidgel, adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese under anvendelse af Mini-PROTEAN

® elektroforeseenhed (BioRad, Hercules, CA) og overført til en PVDF-membran (BioRad). Immundetektion blev udført med kanin polyklonale anti TASK-1 antistof (Alomone Labs, Jerusalem, Israel, APC-024) fortyndet 1: 500, eller et monoklonalt muse-TASK-3-antistof (Abcam, Cambridge, MA; ab50042) fortyndet 1: 1000. Peroxidase aktivitet blev påvist under anvendelse af kemiluminescens-detektion (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Scientific, Waltham, MA). Som lastning kontrol, blev membranerne farvet med et polyklonalt antistof til p-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Apoptose analyser

TASK-1 siRNA eller kontrollere siRNA transficerede celler blev genudpladet på 2×10

4 celler /cm

2. Efter 24 timer apoptotiske stimuli blev tilsat: enten cisplatin, eller DMEM medium uden glucose (Gibco). Efter yderligere 72 timer flydende celler og bundne celler blev høstet, og suspensionen blev centrifugeret ved 400 g i 5 min. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt med Caspase-3 intracellulære aktivitet Assay Kit I (PhiPhiLux

® G1D2, Merck, Darmstadt, Tyskland) eller, efter afbrydelse af kittet af fabrikanten, som CellEvent Caspase-3/7 Green flowcytometri Assay Kit (Molecular Probes, Waltham, MA). peptidkoncentration DEVD blev sat til 4 pM. Prøverne blev analyseret ved flowcytometri (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, USA). Som en anden fremgangsmåde celler blev høstet, centrifugeret, farvet med Hoechst-farvestof (Invitrogen, Waltham, MA), og nuklear fragmentering blev vurderet. Observatøren (KL) blev blindet for behandlingen, mindst 500 celler pr prøve blev evalueret. Salg

Proliferationsassay Salg

Transficerede celler blev genudpladet i 6-brønds plader med 1×10

5-celler /brønd i dyrkningsmedier indeholdende 1% FCS. Efter angivne tidspunkter blev celler trypsiniseret og totale celleantal blev målt med CASY

® celletæller (Schärfe System, Reutlingen, Tyskland) i dubletter. Til vurdering af mitose blev celler inkuberet i dyrkningsmedium indeholdende 1% FCS. Efter 48 timer edu (5-ethynyl-2′-deoxyuridin, et nukleosid analog af thymidin) blev sat til mediet i yderligere 1,5 timer. Efter høst blev cellerne analyseret med ClickIT edu (Invitrogen) ved anvendelse af flowcytometri (FACS Calibur, BD Biosciences).

I silico

ekspressionsanalyse

mRNA overflod af medlemmer af

SLC5

familie af transportører og

SLC38A1

SLC38A2

blev vurderet i en offentligt tilgængelig genekspression datasæt i lungeadenokarcinom prøver og normale lunger (GDS3257) [ ,,,0],11], offentliggjort på Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Nærmere oplysninger om microarray behandling og patientkarakteristika rapporteres på GEO og i [11].

Statistisk analyse

Data blev indsamlet og analyseret med SPSS softwarepakken, udgave 21.0 (Chicago, IL) eller med GraphPad Prism, version, 5,03 (La Jolla, CA). Gruppe forskelle blev beregnet med uparret eller parrede Students

t

-test, en-prøve Students

t

-test, eller Tovejs ANOVA med Bonferroni post-hoc analyse er relevant.

P

. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

TASK-1 udtrykkes i en delmængde af NSCLC cellelinjer og NSCLC væv

Først undersøgte vi TASK-1 og TASK-3 protein og mRNA i otte humane NSCLC cellelinjer. TASK-1-proteinet var konsekvent påvises ved immunoblotting i fire af de otte cellelinier (A549, H358, H460, og MOR), idet det stærkeste udtryk findes i A549, H460, og MOR-celler (Fig 1A). Endvidere blev svag TASK-1-protein-ekspression fundet i A427, H441 og SK-MES-celler, medens ekspression i H23-celler var ubetydelig. I A549 celler blev også TASK-1 mRNA-niveauer forhøjede mens i alle andre cellelinjer ingen klar sammenhæng mellem TASK-1 protein og mRNA-niveauer blev observeret (Fig 1A). Men TASK-1 protein niveauer er ikke kun reguleret af genekspression, men vigtigere er også ved endocytose og nedbrydning [12,13]. Dette kunne forklare forskellene mellem TASK-1 protein og mRNA-niveauer. Interessant, med de kommercielt tilgængelige TASK-1 primere Ingen opgave-1 mRNA udskrift blev fundet i H441 celler. TASK-3, som er blevet beskrevet til at blive amplificeret i lunge- og brystcancer [14], blev udtrykt i alle otte NSCLC cellelinjer med den laveste ekspression blev fundet i A549-celler (fig 1B). OPGAVE-1, et glycosyleret protein [15], viste sig ved en molekylvægt på 52 kDa på immunoblot (figur 1C). En svag ekstra bånd på 46 kDa kunne repræsentere uglycosylerede TASK-1 formular (Fig 1C). Signalet blev ophævet ved anvendelsen af ​​en specifik blokerende peptid til antistoffet og blev reduceret efter transfektion med kommercielt tilgængelig siRNA målrettet TASK-1 (fig 1C-1E), hvilket bekræfter dens specificitet.

(A) OPGAVE -1 ekspression i otte forskellige NSCLC cellelinier. Et repræsentativt immunoblot og middelværdier densitometridata værdier er vist. A549 celler, der er til stede på alle immunoblots, tjente som reference for normalisering. Bottom: TASK-1 mRNA-niveauer blev vurderet ved kvantitativ RT-PCR. Beta-actin (ACTB) blev anvendt som en reference-gen. (B) TASK-3 protein og mRNA-niveauer i otte forskellige NSCLC cellelinjer. (A, B) Resultater er middelværdi +/- SEM fra tre til fire uafhængige prøver. Gruppesammenligninger blev beregnet med én-gruppe t-test. (C, D) A549 celler blev transficeret med ikke-silencing siRNA (c), TASK-1 siRNA (T) eller venstre ubehandlet (u). (C) Repræsentant immunoblot ved hjælp af en TASK-1 antistof i nærvær eller fravær af en specifik blokerende peptid vises. TASK-1 vises en molekylvægt på 52 kDa, kan den ekstra svagt bånd på 46 kDa repræsenterer unglycolsylated formular. (D) OPGAVE-1 mRNA-niveauer 48 timer efter transfektion med TASK-1 siRNA vurderet ved kvantitativ RT-PCR. (E) Repræsentative immunblots af TASK-1 i A549 celler og H358 celler ved forskellige tidsintervaller efter transfektion. Data er vist som middelværdi +/- SEM fra n = 3 uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001

opgave- 1 er funktionel og bidrager til at sætte membranpotentialet i A549 celler

for at bevise denne opgave-1 danner funktionelle kanaler i lungekræft celler, blev K

+ strømme analyseret i A549 celler. Efter anvendelse af et holdepotentiale på 0 mV, som inaktiverer spændingsstyrede K

+ kanaler, en “ikke-inaktiverende” K

+ strøm (I

KN) blev påvist i A549-celler (figur 2). Strømmen blev moduleret af afvigelser i pH, viser et signifikant fald ved lavt pH og en signifikant stigning ved høj pH (Fig 2A). Den selektive TASK-1 hæmmer anandamid [16] (10 uM) reducerede signifikant den ikke-inaktivere K

+ strøm i A549 celler (Fig 2B). Derfor hæmning af TASK-1 strøm ved anandamid (10 uM) førte til betydelig depolarisering af cellemembranen mod mindre negative værdier (figur 2B). Når den ikke-inaktivere K

+ strøm blev analyseret i A549-celler transficeret med TASK-1 siRNA eller kontrol siRNA, celler transficeret med TASK-1 siRNA udstillet en væsentligt reduceret ikke-inaktivering K

+ strøm (fig 2C) . Disse data viser klart, at funktionelle TASK-1 kanaler er til stede i A549 celler, og at en betydelig del af den ikke-inaktivere K

+ strøm bæres af TASK-1 kanaler. Den ikke-inaktivering strøm blev også reduceret af TASK-3-inhibitor ruthenium rød [17] (Fig 2D). Virkningerne af anandamid og ruthenium rød var additive (Fig 2D).

(A) Repræsentative optagelser af en ikke-inaktiverende K

+ strøm (I

KN) i A549-celler ved hjælp af hele celler patch clamp-teknikken under sure og basiske betingelser, og grafer sammenfatter middelværdien strøm ved 0 mV. I /I

0 er strømmen i nærvær af lav (6,3) eller høj (8,3) pH udtrykt som en brøkdel af den aktuelle før behandling. Den ikke-inaktiverende strøm reduceres under sure og øget under basiske betingelser. (B) Repræsentative optagelser og en graf opsummerer den ikke-inaktiverende K

+ strøm (I

KN) og den hvilende membranpotentiale (

E

m) i nærvær og fravær af den TASK-1 hæmmer anandamid (Ana, 10 uM) ved pH 7,3 i A549 celler. I /I

0 er strømmen i nærvær af anandamid udtrykt som en brøkdel af den aktuelle før anandamid behandling. Anandamid reducerede den ikke-inaktiverende K

+ strøm og førte til depolarisering af cellemembranen mod mere positive værdier. (C) Repræsentative optagelser af den ikke-inaktiverende K

+ strøm (I

KN) og søjlediagram opsummerer den gennemsnitlige strøm ved 0 mV i A549-celler transficeret med TASK-1 siRNA eller kontrol siRNA ved pH 7,3. (D) Repræsentative optagelser af den ikke-inaktiverende K

+ strøm (I

KN) og den normaliserede gennemsnitlige strøm ved 0 mV i A549-celler under behandling med TASK-3 blokker ruthenium-rød (RR, 10 uM) eller ruthenium rød sammen med anandamid (10 uM) ved pH 7,3. Data er middelværdier +/- SEM. **

P

0,01, ***

P

0,001 sammenlignet med kontrol. Ana, anandamid; RR, ruthenium rød.

TASK-1 medierede K

+ strøm hæmmes af hypoxi

TASK-1 er kendt for at være hæmmet under akut hypoxi med post-translationelle mekanismer [10]. Vi dyrkede A549 celler under hypoxi for at vurdere, om opgaven-1 medierede K

+ strøm er følsom over for iltsvind i lungekræft celler. I hypoxiske celler, en ikke-inaktivering K

+ strøm kunne påvises (fig 3A), men den nuværende var lavere end under normoxi og manglede følsomhed over for TASK-1 hæmmer anandamid (Fig 3A). Den ikke-inaktiverende K

+ strømtæthed i celler dyrket under hypoksi var signifikant lavere end i celler dyrket under normoxi (Fig 3B). Tilsvarende potentialet hvilende membran (

E

m) var signifikant mere positivt (depolariseret) i hypoxiske celler end i normoksiske celler (Fig 3B). PH af dyrkningsmediet fra celler dyrket under forskellige oxygenkoncentrationer på densitet anvendt til patch-clamp-forsøg blev målt for at afklare, om en forskel i pH kan forklare den observerede nedsættelse af den ikke-inaktiverende K

+ strøm under hypoxi. Den gennemsnitlige pH i celledyrkningsmediet var 7,57 (+/- 0,11) under normoxi og 7,85 (+/- 0,05) under hypoxi (

P

= 0,02). Den lidt højere pH under hypoxi, muligvis på grund af den reducerede vækst i A549 celler under hypoxi [18], vil hellere styrke end reducere TASK-1 K

+ strøm, og dermed en forskel i pH var ikke ansvarlig for hypoxia- induceret hæmning af strømmen.

(A) Venstre, repræsentative optagelser af den ikke-inaktiverende K

+ strøm (i

KN) i A549-celler dyrket under hypoxi (1% oxygen) i tre dage. Den påviselige strøm mangler følsomhed til opgaven-1 hæmmer anandamid (Ana, 10 uM). Right, graf opsummerer den gennemsnitlige strøm ved 0 mV. (B) Ikke-inaktivering K

+ strømtæthed (I

KN Density, venstre) og den hvilende membranpotentiale (

E

m, højre) i A549 celler dyrket under hypoxi eller normoksi. (C) i forhold overflod af TASK-1 mRNA i A549 celler dyrket under hypoxi (1% ilt) for forskellige tidsintervaller målt ved kvantitativ PCR. GLUT-1 og hexokinase 2 (HK2) blev vurderet som hypoxi markører. (D) Immunoblot og relativ overflod af TASK-1 protein i A549 celler dyrket under hypoxi (1% oxygen) målt for forskellige tidsintervaller. Data er middelværdier +/- SEM. *

P

0,05, ***

P

0,001, N.S., ikke signifikant. Ana, anandamid; HK2, hexokinase 2; GLUT1, solut luftfartsselskab familie 2 (lettet glukose transporter), medlem 1.

Reduktionen i anadamid-sensitive K

+ strøm under hypoxi ikke kan henføres til et fald i TASK-1-ekspression, idet mRNA-niveauer ikke var lavere, men endda lidt højere i hypoxi, selvom forskellen ikke var signifikant (fig 3C). Interessant, TASK-1 mRNA-niveauer øges gradvist over tid i A549 celler udpladet i dyrkningsplader og indsamles hver 24 timer, begge i hypoxi og normoxi (fig 3C). Det vides ikke, om en stigning i celledensitet, en eventuel lille forskydning i pH, eller en udtynding af næringsstoffer er den underliggende årsag. Ekspression af GLUT-1 (

SLC2A1

, solut luftfartsselskab familie 2 (lettet glukose transporter), medlem 1) og hexokinase 2 (

HK2

), kendte hypoxi-induceret gener, blev ophøjet under hypoxiske behandling (fig 3C). Ligeledes blev OPGAVE-1 protein niveauer i A549 celler påvirkes ikke af hypoxi (Fig 3D).

TASK-1 knockdown øger apoptose i A549 celler

Vi tavshed TASK-1 i A549 og i H358 celler under anvendelse af siRNA. Når det cytotoksiske lægemiddel cisplatin, som vides at inducere apoptose i lungecancerceller, blev administreret til A549-celler, blev en betydelig stigning i cisplatin-induceret apoptose fundet i TASK-1 siRNA transficerede celler i sammenligning med kontrol siRNA transficerede celler (fig 4A og 4C, S1 fig). Denne effekt blev ikke observeret i H358 celler (Fig 4B, S2 Fig). Ligeledes når apoptose blev fremkaldt af glukose afsavn, TASK-1 dæmpning ført til en betydelig stigning i apoptose i A549 celler, men ikke i H358-celler (Fig 4A og 4B, S1 og S2 Fig). Celler blev genudpladet efter transfektion for at undgå høje celledensiteter, især i ubehandlede celler, under forløbet af eksperimentet. Men hvis re-plating blev udeladt, blev observeret i A549-celler (Fig 4D), den samme apoptose-fremmende effekt af TASK-1 siRNA. Effekten af ​​TASK-1 knockdown af siRNA var lavere i H358 celler end i A549 celler efter 48 timer, men nåede samme niveau efter 72 timer (figur 1E). Således kan forskellene i følsomhed til TASK-1 siRNA ikke forklares ved forskellige niveauer af knockdown.

(A, B) Celler blev transficeret med TASK-1 siRNA eller ikke-silencing siRNA (kontrol siRNA). 48 timer efter transfektion blev cellerne genudpladet, efter yderligere 24 timer blev cellerne behandlet med forskellige stimuli i 72 timer og apoptose blev vurderet ved at detektere celler med caspase 3-aktivitet ved FACS-analyse. For apoptose induktion blev cellerne behandlet med cisplatin ved forskellige koncentrationer eller med DMEM medium indeholdende dialyseret serum og 10 mM eller 0 mM D-glucose (afbalanceret med metabolisk inaktive L-glucose). (C) A549-celler blev transficeret og behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin på samme måde som i panel A. Apoptose blev vurderet ved farvning flydende og adhærente celler med Hoechst farvestof. Satser for nuklear fragmentering blev bestemt i et blindet måde. (D) A549-celler blev transficeret på samme måde som i panel A og behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin uden forudgående udpladning. (A, B, D) Apoptose blev vurderet ved at detektere celler med caspase 3-aktivitet ved FACS-analyse. Resultater er middeltal +/- SEM fra n = 3 uafhængige eksperimenter. Gruppe sammenligninger blev udført med Tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc analyse. *

P

0,05, **

P

0,01; ***

P

0,001. ns, ikke signifikant.

TASK-1 knockdown reducerer proliferation i A549 celler

Når vi vurderede rolle TASK-1 i lungekræft celledeling under serum-reduceret forhold, vi fandt, at knockdown af TASK-1 siRNA væsentligt reduceret celle nummer stigning i A549 celler, men ikke i H358-celler (fig 5A). Den mitose sats, målt ved Edu inkorporering, blev også signifikant reduceret i A549 celler behandlet med TASK-1 siRNA i forhold til at styre siRNA (Fig 5B).

(A) Celler blev transficeret med TASK-1 siRNA eller ikke -silencing siRNA (kontrol siRNA). 48 timer efter transfektion blev celler genudpladet i medium med reduceret serum indhold (1%), for at undgå overstimulering af celler. Totale celletal blev talt hver dag i træk i dubletter med elektronisk puls område analyse (CASY

®). Resultater er middeltal +/- SEM fra n = 3 uafhængige eksperimenter. Gruppe sammenligninger blev udført med Tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc analyse. (B) Celler blev transficeret som beskrevet og dyrket i serum-reducerede medium (1%) i 48 timer. Mitosis blev vurderet ved anvendelse af et edu uptake assay. Resultater er middeltal +/- SEM fra n = 4 uafhængige forsøg. **

P

0,01, ***

P

0,001, ns, ikke signifikant

Expression opgave-1 og formodede nedstrømseffektorer. af TASK-1, Na

+ – koblede transportører, i humant NSCLC og normale lunger

Når vi analyserede TASK-1-ekspression på proteinniveauet i humane NSCLC prøver og tilsvarende normale lungevæv fra tolv patienter, vi fundet variable niveauer af ekspression, både, i lunger og tumorer (fig 6A). Samlet ekspressionsniveauerne blev ikke ændret i NSCLC forhold til normal lunge (figur 6A). Na

+ – koblede næringsstoffer transportvirksomheder er formodede nedstrømseffektorer af TASK-1, da deres indsats afhænger af Na

+ gradienter, som kun kan etableres, hvis K

+ import af Na

+ /K

+ – ATPase er afbalanceret K

+ – eksport via K

+ kanaler. Vi vurderede udtryk for Na

+ – opløst stof co-transportører, medlemmer af

SLC5

familien og Na

+ – drevne glutamin transportører

SLC38A

1 og

SLC38A2

, i humane NSCLC (adenocarcinom) prøver sammenlignet med normalt lungevæv ved hjælp af en stor, offentlig datasæt offentliggjort på GEO (GDS3257) [11]. Vi fandt Na

+ – glucose symporters

SLC5A1

(SGLT1) og

SLC5A2

(SGLT2), der skal udtrykkes i NSCLC på samme niveau som i den normale lunge, hvor SGLT- medieret transport af glucose over alveolære epitel lag spiller en vigtig rolle i glucose re-uptake [19]. Men vi fandt signifikant forøget ekspression af Na

+ /myo-inositol co-transporter

SLC5A3

, Na

+ – afhængig multivitamin transporter

SLC5A6

, og glutamin transporter

SLC38A1

i tumorer versus normal lunge (fig 6B og 6C).

SLC38A

2 blev ikke differentielt udtrykt (data ikke vist).

(A) OPGAVE-1 protein blev vurderet i NSCLC væv og tilsvarende ikke-involveret lunge fra tolv patienter ved hjælp af Western blot. Højre: densitometri værdier for TASK-1 i NSCLC og lunger blev normaliseret til p-actin. (B, C) mRNA-niveauer af medlemmer af

SLC5

familie af Na

+ – koblede transportvirksomheder og af Na

+ – drevet glutamin transporter

SLC38A1

blev vurderet i en offentligt tilgængelig GEO datasæt (GDS3257) [11] offentliggjort på Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) i lunge adenocarcinom prøver (n = 58) og normale lunger (n = 49). RMA (Robust Multichip Gennemsnit) udtryk foranstaltning for mRNA overflod er i log skala. ***

P

0,001, *

P

. 0,05

Diskussion

Betydningen af ​​K

+ kanaler under mitose er blevet foreslået så tidligt som i 1960’erne, men kun ganske nylig K

+ kanaler er blevet undersøgt i kræft [3]. I vores undersøgelse viser vi, at TASK-1 udtrykkes i en delmængde af NSCLC, og at TASK-1 er funktionel, fremmer proliferation og hæmmer apoptose i en yderst TASK-1 udtrykker lungekræft cellelinje.

afvigende ekspression af K

+ kanaler er ofte observeret i kræft, men forståelsen af ​​deres regulering og funktion under kræft progression og vækst er ufuldstændig. [14].