PLoS ONE: hSulf-1-genet Udstillinger Anticancer Effekt gennem Negativt Regulering VEGFR-2 signalering i Human Kræft

Abstrakt

Baggrund

Menneskelig sulfatase 1 (hSulf-1) er en heparin-nedbrydende endosulfatase der desulfates celleoverfladen heparansulfatproteoglycaner (HSPGs) i ekstracellulær matrix og negativt modulerer heparin-bindende vækstfaktor og cytokin signalering i celleproliferation. Men hSulf-1 funktion er mere kompliceret, og dens molekylære mekanisme er ikke kendt.

vigtigste resultater

For yderligere at undersøge funktioner hSulf-1-genet i reguleringen af ​​vaskulær endotel vækstfaktor receptor (VEGFR) signalering, en serie af vektorer, der udtrykker hSulf-1, hSulf-1 lille hårnåle-RNA (shRNA) og VEGFR-2 shRNA blev dannet. hSulf-1 re-udtryk kunne downregualte den VEGFR-2 phosphorylering og hæmme kræft celledeling både i æggestokkene og hepatocellulære cancer cellelinjer. Knockdown af hSulf-1-ekspression ved hSulf-1 shRNA forbedret inddrivelse af høje niveauer af phosphoryleret VEGFR-2, og knockdown af VEGFR-2-ekspression af VEGFR-2 shRNA hæmmede udbredelsen aktivitet kræft celler

in vitro

til en vis grad. I humane cancer xenografter i nøgne mus, blev tumorvækst hæmmet markant efter injektioner af adenovirus udtrykker hSulf-1, med tumor hæmning satser på 46,19% og 49,56% i æggestokkene og hepatocellulære tumormodeller hhv. hSulf-1-ekspression betydeligt reduceret tumor mikrokardensitet tæthed.

Konklusioner

Resultaterne viste, at hSulf-1 re-udtryk både i æggestokkene og hepatocellulære kræftceller fremkalder antitumor effekt ved at dæmpe phosphorylering af VEGFR- 2 og undertrykke angiogenese. Derfor hSulf-1-medieret antiproliferative og angiogenese kunne være en fornuftig tilgang til kræftbehandling

Henvisning:. Ji W, Yang J, Wang D, Cao L, Tan W, Qian H, et al. (2011) hSulf-1-genet Udstillinger Anticancer Effekt gennem Negativt Regulering VEGFR-2 signalering i Human kræftformer. PLoS ONE 6 (8): e23274. doi: 10,1371 /journal.pone.0023274

Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: 13. april, 2011; Accepteret: 11. juli, 2011; Udgivet: 10 August, 2011

Copyright: © 2011 Ji et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Natural Scientific Foundation of China (81071866, 30.872.998). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion Salg

heparansulfatproteoglycaner (HSPGs) i ekstracellulær matrix er vigtige bestanddele til regulering af heparinbindende vækstfaktor signalering, såsom fibroblastvækstfaktor (FGF), epidermal vækstfaktor (EGF) og hepatocytvækstfaktor (HGF) [1], [2]. Den sulfatering af

N

-acetylglucosamine rester af HSPGs er afgørende for samspillet mellem disse faktor ligander og deres receptortyrosinkinaser på celleoverfladen [3]. Human sulfatase 1 (hSulf-1) blev karakteriseret som en heparin-nedbrydende endosulfatase der tjener til at desulfate celleoverflade HSPGs og negativt modulerer vækstfaktor og cytokin signalering [4]. hSulf-1-protein udtrykkes bredt i normalt væv, men inaktiveret i flertallet af forskellige humane cancere, fx ovarie-, bryst-, pancreas-, nyre-, lever-, hoved og hals pladecellecarcinomer [5] – [7]. Tabet af heterozygositet, methylering af DNA CpG øer og histon modifikationer muligvis er de vigtigste årsager til hSulf-1 inaktivering i humane kræftformer [8], [9]. Varianten hepatisk nuklear faktor 1 (vHNF1), kodet af transskription faktor 2-genet (TCF2, HNF1beta), blev også rapporteret at en negativ regulering hSulf-1-ekspression i ovariecancer [10]. Re-ekspressionen af ​​hSulf-1 i cancerceller effektivt resulterer i et fald på celledeling samt en stigning i følsomhed over for kemoterapi-induceret apoptose [11]. Derfor er de indberettede data antydede, at hSulf-1 normalt fungerer som en negativ regulator i celleproliferation, det kan spille en vigtig rolle i behandlingen af ​​kræft.

For at undersøge de lovgivningsmæssige rolle hSulf-1 i heparin-bindende vækst faktor signalering i humane cancere, de tidligere studier identificeret at hSulf-1-ekspression kan mindske kaskaden phosphorylering af en række kinaser, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK), mitogenaktiveret proteinkinase kinase ( MEK), serin /threonin-kinase (AKT) efter behandling med eksogent tilsat vækstfaktorer, efterfulgt af inaktivering af downstream signalveje [6], [11], [12]. hSulf-1 er også involveret i inhibering af autokrin-medieret phosphorylering af EGFR-ERK i brystcancerceller induceret af serum sult, og inhiberingen af ​​autokrin EGFR-ERK signalering ved hSulf-1 resulterer i en reduceret ekspression af cyclin D1, en faldt S fraktion fase og en forøget G2-M fraktion, og endelig fører til inhibition af celleoverlevelse i brystcancerceller [7]. Derfor er tab af hSulf-1 i cancere og cancercellelinjer associeret med opregulering af vækstfaktor signalering ved forøget kinase-phosphorylering, og phosphorylering og aktivering af receptortyrosinkinaser har været impliceret i at fremme carcinogenese og udvikling af cancere.

Desuden vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og VEGF-receptor (VEGFR) er involveret i hSulf-1-medieret suppression af cancerceller [6]. Vi formoder derfor, at hSulf-1 kan udgøre anticancer virkningsstyrke ved inhibering af angiogenese i de fleste humane cancere. VEGFR familien indeholder tre medlemmer, VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR /FLK-1) og VEGFR-3 (flt-4), som er transmembrane tyrosinkinasereceptorer, der regulerer dannelsen af ​​blod og lymfe fartøjer. Blandt disse tre receptorer, er VEGFR-2 generelt anerkendt at have en hovedrolle i at mediere VEGF-induceret respons, der direkte regulerer tumorangiogenese [13]. I denne undersøgelse, ved at konstruere forskellige vektorer, der bærer det hSulf-1-genet, hSulf-1 lille hårnål RNA (shRNA) eller VEGFR-2 shRNA, vi fremlagde beviser for at vise, at hSulf-1 re-udtryk udviste en negativ effekt på cellevækst ved at nedregulere VEGFR-2 signalering både i kræft i æggestokkene og hepatocellulære carcinoma cellelinier. Den antitumor effekt af hSulf-1 blev også valideret i æggestokkene og hepatiske kræft implanteret i nøgne mus.

Resultater

Inaktivering af hSulf-1 er en almindelig molekylær begivenhed i størstedelen af ​​humane kræftformer og involverer i VEGFR-2 signalering

hSulf-1-proteinet er almindeligt udtrykkes i normale væv og funktioner til en negativ modulere vækstfaktor signalering. For at demonstrere sin inaktivering i flertallet af forskellige menneskelige kræftformer, vi undersøgte hSulf-1-ekspression i mange typer af humane cancer prøver ved immunhistokemi. I epitelceller normale væv, hSulf-1 var positiv med en positiv sats på 100,0%. Men i deres tilsvarende cancere, blev hSulf-1expression undertrykt naturligvis. De positive satser hSulf-1 var 23,1% (6/26), 16,7% (2/12), 31,8% (7/22), 11,1% (1/9), 44,4% (8/18) i hepatocellulær, bryst, mave, nyre- og tyktarmskræft, henholdsvis (fig. 1A).

(A) De prøver, herunder forskellige kræftformer og deres tilstødende normale væv blev fikseret i 10% neutral formaldehyd i 6 timer, paraffin- indlejret, og skåret i 5 um-tykke snit for hSulf-1 immunhistokemi. De hepatocellulært carcinom (HCC) celler var negative for hSulf-1-ekspression, som var omgivet af hSulf-1-positive leverceller. Den brystkræft, mavekræft og renale klare celle carcinom celler var alle negative, og tyktarmskræft celler var positive for hSulf-1-ekspression; oprindelig forstørrelse x 200 (øvre panel). De hSulf-1-positive celle procenter i alle prøver blev talt inden for 5 high-power felter (original forstørrelse × 400) under mikroskop, og viste i histogrammer (nederste panel); * P 0,05; ** P 0,01. (B) Ekspression af VEGFR-2, herunder t-VEGFR2 og p-VEGFR2, i 26 tilfælde af HCC blev påvist ved immunhistokemi; oprindelige forstørrelse × 400 (venstre panel). De positive celle procenter i 6 hSulf-1-positive og 20 hSulf-1-negative HCC blev talt inden for 5 high-power felter (original forstørrelse × 400) under mikroskop, og viste i histogrammer (højre panel); * P. 0,05

indlysende virkning af hSulf-1 er at mindske kaskade phosphorylering af en række receptortyrosinkinaser, som blev påvist i VEGF og VEGFR signalering [6]. Vi undersøgte derfor ekspressionen af ​​samlede VEGFR-2 (t-VEGFR2) og phosphoryleret VEGFR-2 på Tyr1175 (p-VEGFR2

Tyr1175) i tumorprøver (fig. 1B). Blandt 26 tilfælde af hepatocellulært carcinom, der er en indlysende fald i p-VEGFR2

Tyr1175 niveau i hSulf-1-positive hepatocellulært carcinom end i hSulf-1-negativ hepatocellulært carcinom (P 0,05), men ingen forskel af t-VEGFR2 udtryk mellem dem (P 0,05).

Adenovirus-medieret hSulf-1 re-udtryk nedregulerer phosphorylering af VEGFR-2 i cancerceller

for at teste infektion effektivitet adenovirus, BEL-7404 cancerceller blev inficeret med kontrol-adenovirus Ad5-EGFP bærer et reportergen for forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) og observeret otteogfyrre timer efter infektion under et fluorescensmikroskop. Procentdelene af EGFP-positive celler var 42,67 ± 12,25% og 86,33 ± 26,48% ved infektionsmultipliciteter (MOI) på 5 og 10 pfu /celle, (fig. 2A).

(A) Bel- 7404 celler blev inficeret med kontrol adenovirus Ad5-EGFP ved MOI på 5 og 10 pfu /celle, og de procentdele af EGFP-positive celler blev observeret under et fluorescerende mikroskop, original forstørrelse × 400. (B) RT-PCR blev anvendt til at identificere hSulf-1-ekspression medieres af adenovirus Ad5-hSulf1. 1, Celler inficeret med Ad5-hSulf1 ved en MOI på 10 pfu /celle; 2, celler inficeret med Ad5-hSulf1 ved en MOI på 10 pfu /celle og derefter transficeret med hSulf-1 shRNA vektoren i en koncentration på 20 ug /10

5 celler; 3, Forældrekontrol celler. (C) Ekspression af hSulf-1, t-VEGFR2 og p-VEGFR2

Tyr1175 blev identificeret ved western blotting. Glyceraldehyd phosphat dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en loading kontrol. Densitometrisk analyse blev udført for at vise ekspressionsniveauerne af p-VEGFR2

Tyr1175 i cancerceller, normaliserede med GAPDH tæthed. Kolonner er middelværdien af ​​tre separate analyser; barer = SD; ** P. 0,01

De forældre cancer cellelinjer, SKOV3 og BEL-7404, var negative for hSulf-1-ekspression. Efter 48 timer post-infektion af Ad5-hSulf1 ved en MOI på 10 pfu /celle, cancerceller var positive for hSulf-1, og hSulf-1 shRNA kunne nedregulere hSulf-1 ekspressionsniveau (fig. 2B). Da hSulf-1-genet kan mindske phosphoryleringen af ​​kinaser er involveret i mange vækstfaktor signalveje, undersøgte vi ekspressionsniveauerne af t-VEGFR2 og p-VEGFR2

Tyr1175. Sammenlignet med de parentale cancerceller, omfanget af t-VEGFR2 forblev ingen ændring i Ad5-hSulf1 inficerede celler. Men niveauet p-VEGFR2

Tyr1175 havde en oplagt fald efter infektion af Ad5-hSulf1. Når hSulf-1 shRNA blev transficeret i Ad5-hSulf1 inficerede cancerceller, hSulf-1-ekspression blev igen inhiberet, og indholdet af p-VEGFR2

Tyr1175 genvundet næsten til de normale niveauer (fig. 2C).

adenovirus-medieret hSulf-1 reaktivering inhiberer cancercelleproliferation

Da tabet af hSulf-1 er en fælles molekylær begivenhed i størstedelen af ​​humane cancere, vi reaktiveres hSulf-1 ekspression ved infektion af adenovirus bærer hSulf-1-genet i forskellige cancercellelinier og undersøgt celleproliferation. Sammenlignet med kontrolgruppen adenovirus Ad5-EGFP, Ad5-hSulf1 udøvede en indlysende inhibering virkning på cancercelleproliferation med MOI-afhængig måde. Da MOI var mere end 20 pfu /celle blev cellelevedygtighed reduceret til mindre end 50% i Ad5-hSulf1 inficerede kræftceller, mens cellen levedygtighed var mere end 80% i Ad5-EGFP inficerede cancerceller (fig. 3A).

(A) SKOV3 og BEL-7404 cancerceller blev inficeret med Ad5-hSulf1 på forskellige MOI’er. Ad5-EGFP blev anvendt som en kontrol-adenovirus. (B) SKOV3 og BEL-7404 cancerceller blev transficeret med VEGFR-2 shRNA vektoren ved koncentration på 20 ug /brønd. Otteogfyrre timer efter transfektion blev VEGFR-2-ekspression detekteres ved western blotting og cellelevedygtigheden blev detekteret ved MTT-assayet. Den negative kontrol shRNA (Ctrl-shRNA) blev anvendt som en negativ kontrol; * P 0,05; ** P 0,01. (C) BEL-7404 cancerceller blev inficeret med Ad5-hSulf1 ved MOI på 10 pfu /ml og derefter transficeret med VEGFR-2 shRNA vektoren ved koncentration på 20 pg /10

5-celler, derefter VEGFR-2 ekspression og celle levedygtighed blev påvist. BEL-7404 parentale celler blev anvendt til at repræsentere den maksimale mængde af cellevækst at producere procent levedygtighed * P 0,05; ** P. 0,01

Cancer celler dyrket i plader med 96 brønde blev transficeret med vektorerne indeholdende VEGFR-2 shRNA og negativ kontrol shRNA ved en koncentration på 20 ug /brønd. Ekspressionen af ​​VEGFR-2 blev undersøgt ved Western blotting, og cellelevedygtighed blev målt ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Sammenlignet med den negative kontrol shRNA, VEGFR-2 shRNA inhiberede VEGFR-2-ekspression og reduceret cellelevedygtighed i nogen grad (fig. 3B). For at demonstrere, om VEGFR-2 knockdown under betingelser med hSulf-1 overekspression har samme virkning på cellelevedygtighed, BEL-7404 cancerceller, som blev inficeret med Ad5-hSulf1 ved en MOI på 10 pfu /celle, blev transfekteret med VEGFR-2 shRNA vektoren i en koncentration på 20 ug /10

5 celler til knockdown ekspressionen af ​​VEGFR-2 (fig. S1), viste resultaterne, at BEL-7404 cellelevedygtighed efter transfektion af VEGFR-2 shRNA blev yderligere reduceret i sammenhæng med hSulf-1 effekt (fig. 3C).

Adenovirus-medieret hSulf-1-genterapi udviser en potent antitumor effekt ved angiogenese i humane cancer-xenotransplantater i nøgne mus

reaktivering af hSulf- 1 funktion i cancerceller kan inaktivere den nedstrøms vækstfaktor signalveje derfor hSulf-1 er en hidtil ukendt mål for cancer genterapi. Herved konstruerede vi en adenovirusvektor der udtrykker vildtype hSulf-1-genet, Ad5-hSulf1. Dens antitumorvirkning blev valideret både i æggestokkene og hepatocellulære kræft implanteret i nøgne mus (fig. 4A). Efter intratumorale injektioner af virus til en samlet dosis på 10

9 pfu pr mus, suppression af tumorvækst i Ad5-hSulf1 behandlede gruppe var mere effektivt, med tumorinhibering satser på 46,19% og 49,56% i SKOV3 og Bel- 7404 modeller, sammenlignet med den tomme kontrolgruppe (P 0,01). Der var ingen forskel mellem den negative virus kontrolgruppen og den tomme kontrolgruppe (P 0,05).

(A) SKOV3 og BEL-7404 modeller, 5 mus pr gruppe, undertrykkelse effekt af Ad5-hSulf1 på tumor væksten blev analyseret, sammenlignet med kontrolgruppen eller det negative adenovirus Ad5-EGFP gruppe; Sorte pletter på X-aksen præsenterede tidspunkter af adenovirus injektioner; ** P 0,01. (B) Patologisk undersøgelse af SKOV3 xenotransplantattumorer. Sammenligning af tumor vægt i SKOV3 modeller (venstre panel); Bar = 1 cm; ** P 0,01 versus kontrol eller Ad5-EGFP grupper. Ved hæmatoxylin og eosin farvning (HE) og immunhistokemiske undersøgelser, de positive celle procentsatser for hSulf-1, den mikrokar densitet (MVD) tæller mærket med CD31 antistof, blev kvantificeret inden for 5 high-power felter (original forstørrelse × 400) under mikroskop. Efter injektioner af Ad5-hSulf1, tumorceller var positive for hSulf-1-ekspression i cytoplasmaet. Derfor blev optællingen af ​​MVD faldet markant sammenlignet med den for i kontrolgruppen. (C, D) Det samlede VEGFR-2 og phosphoryleret VEGFR-2 (C), og total AKT og phosphoryleret AKT (D), blev identificeret ved western blotting (venstre felt) og immunhistokemi (højre panel) i Ad5-hSulf1 behandlede SKOV3 xenograft tumorer, sammenlignet med kontrollen og Ad5-EGFP grupper.

Ved slutningen af ​​observationsperioden, mus med SKOV3 xenotransplantater blev aflivet, og tumorerne blev fjernet og vejet. De tumorvægte af Ad5-hSulf1 gruppe var lavere end for de to andre grupper (fig. 4B, venstre panel). De paraffinindstøbte tumor sektioner blev undersøgt immunhistokemisk. I den tomme kontrolgruppen, kræftceller var negative for hSulf-1-ekspression. Men i Ad5-hSulf1 gruppe, kræftceller re-udtrykte hSulf-1 protein. En kvantitativ analyse af mikrokardannelse densitet (MVD) udførtes ved CD31 immunhistokemi. De MVDS i tumorvæv var 24,67 ± 6,51 og 52,33 ± 12,34 i Ad5-hSulf1 og kontrolgrupper, henholdsvis (fig. 4B, højre panel). Der var en signifikant forskel mellem dem (P 0,05).

Som hSulf-1-genet udøver en bred rolle i reguleringen af ​​flere veje ved at inhibere phosphoryleringen af ​​intracellulære tyrosinkinaser, som kan være kritisk i tumorcelleproliferation og tumorangiogenese, vi derfor undersøgt ekspressionen af ​​nedstrøms proteiner, herunder VEGFR-2 og serin /threonin-kinase (AKT) i xenotransplantattumorer. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​p-VEGFR2

Tyr1175 og phosphoryleret AKT på Thr308 (p-AKT

Thr308) blev nedreguleret i Ad5-hSulf1 gruppe undersøgt ved Western blotting og immunhistokemi (fig. 4C, D).

diskussion

sulfatering af celleoverflade HSPGs menes at spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​heparin-bindende vækstfaktor signalering i ekstracellulære matrix [14], [15]. Den hSulf-1 protein er et arylsulphatase aktivitet enzym, der kan have en negativ regulere sulfateringen tilstand HSPGs [16]. Stærke beviser vist, at hSulf-1 normalt funktioner til at desulfate celleoverflade HSPGs og nedregulere receptortyrosinkinase-signalering til effektivt abrogere cellevækst og overlevelse [4], [17]. Denne proces spiller en væsentlig rolle i inhibering af malign transformation og kræft cellevækst [18], [19]. Derfor er hSulf-1 betragtes som et tumorsuppressorgen. Tidligere undersøgelser har vist, at hSulf-1 inaktiveres i størstedelen af ​​humane cancere gennem enten genetiske mekanismer, såsom deletion og mutation eller gennem epigenetiske mekanismer, såsom DNA-methylering og histondeacetylering [12], [20], [21]. Vi viste også immunohistokemisk at hSulf-1-ekspression blev nedreguleret i 87 tilfælde af kliniske prøver, herunder hepatocellulær, bryst, mave, nyre- og tyktarmskræft sammenlignet med deres tilstødende normale væv. På grund af de årsager, som hSulf-1 har komplicerede funktioner, og dens molekylære mekanisme er ikke blevet kendte endnu, i disse undersøgelser, vi testede, hvis hSulf-1-medieret hæmning af VEGFR signalering er forbundet med antiproliferative og angiogenese i kræft.

Både primære læsioner og metastatiske tumorer skal udvikle en ny vaskulær forsyning for at støtte kræftcellen ekspansion og formidling. Fleste cancerceller kan udtrykke både VEGF-liganden og VEGFR der fungerer på en autokrin sløjfe til direkte stimulere tumorangiogenese [22]. Angiogenese er et hastighedsbegrænsende trin i cancervækst, progression og metastase. VEGF er en kritisk mediator af angiogenese, der er godt balancedly udtrykt i de fleste væv og celletyper, men stærkt opreguleret i tumorer [23]. Binding af VEGF til dens receptor resulterer i receptor autophosphorylering og efterfølgende aktivering af en række tyrosinkinaser, aktiverer derefter multiple downstream proteiner, der spiller funktionelle roller i celleoverlevelse, celleproliferation, vaskulær permeabilitet og stabilisering af nye blodkar [24] – [ ,,,0],26]. Derfor phosphoryleringen-medieret aktivering af VEGFR er en vigtig fremgangsmåde til regulering af væksten af ​​kræft. Fordi hSulf-1 katalyserer desulfatering af HSPGs, derfor det påvirker bindingsevne heparinbindende faktorer til deres receptorer i EGFR, ERK1 /2, MEK, PI3K /AKT signalveje, og nedtrykker phosphorylering og aktivering af receptortyrosinkinaser . Disse signalveje var alle involveret i angiogene proces [27] – [29]. Stærkt sulfaterede HSPGs forstærke interaktionen mellem VEGF og VEGFR-2, derefter phosphorylere og aktivere VEGFR-2. I denne proces kan ekspressionen af ​​VEGF og VEGFR-2 ikke blive påvirket af sulfatering eller desulfatering af HSPGs [30]. Det konstateredes, at forøgelsen af ​​VEGFR-2-phosphorylering på Tyr1175 var kendt for at være essentiel for VEGF-afhængig aktivering af MAPK signalering og angiogenese [31]. For at verificere den negative effekt af hSulf-1 på kræft angiogenese, genereret vi adenovirus udtrykker hSulf-1. Adenovirus-medieret hSulf-1-ekspression ikke kun downregualted niveauerne af phosphoryleret VEGFR-2, men inhiberede også proliferation af cancerceller både ovarie- og hepatocellulære cancercellelinier. Knockdown af hSulf-1-ekspression ved hSulf-1 shRNA vektor forbedret inddrivelse af høje niveauer af phosphoryleret VEGFR-2, hvilket indikerer, at hSulf-1 regulerer phosphorylering og aktivering af VEGFR-2. hæmning af kræft celledeling

in vitro

af hSulf-1 re-udtryk kan dog være hovedsagelig på grund af desulfatering af HSPGs og inactivition af mange vækstfaktor signalveje. Men når vi brugte VEGFR-2 shRNA at lukke munden ekspression af VEGFR-2 i æggestokkene og hepatocellulære kræftceller blev cellelevedygtighed faldet til en vis grad, viser, at VEGFR-2 signalering deltager i reguleringen af ​​kræft celledeling, og antiproliferative effekt af hSulf-1 på cancerceller skyldes delvis inhibering af VEGFR-2 signalering. Når BEL-7404 cancerceller blev inficeret med Ad5-hSulf1 at re-udtrykke hSulf-1 og derefter transficeret med VEGFR-2 shRNA at lukke munden VEGFR-2-ekspression blev cellelevedygtighed faldt yderligere, netop viser, at der er en anden mekanisme, der er involveret i VEGFR-2 aktivering og cancercelleproliferation i forbindelse med hSulf-1 effekt.

for at vurdere virkningen af ​​hSulf-1 på tumorvækst behandlede vi human cancer-xenotransplantater i nøgne mus med adenovirus, der udtrykker hSulf-1. Resultaterne fandt, at tumorvæksten blev inhiberet efter behandling. De tumor hæmning satser var 46,19% og 49,56% i æggestokkene og hepatocellulære tumormodeller hhv. Re-ekspression af hSulf-1 resulterede i nedregulering af phosphoryleret VEGFR-2 og phosphoryleret AKT, derefter signifikant reduceret tumor mikrokardensitet tæthed, hvilket indikerer, at hSulf-1-ekspression blev associeret med angiogenese.

Sammenfattende hSulf-1 er en sulfatase der tjener til at desulfate celleoverflade HSPGs. Det kan inhibere den nedstrøms kinase-phosphorylering med et bredt spektrum og negativt regulerer receptortyrosinkinase-signalering. Denne undersøgelse gav en overbevisende dokumentation for, at hSulf-1 re-udtryk både i æggestokkene og hepatocellulære kræftceller dæmper phosphorylering af VEGFR-2, så undertrykker kræft celledeling og angiogenese endelig inducerer antitumor effekt. Derfor foreslog vores data, at hSulf-1-medieret antiproliferative og angiogenese kunne være en fornuftig tilgang til kræftbehandling.

Materialer og Metoder

Undersøgelser af hSulf-1 og VEGFR-2-ekspression i klinisk cancer prøver

Ekspression af hSulf-1 blev påvist ved immunhistokemi i 87 tilfælde af kliniske cancer prøver, herunder 26 hepatocellulære carcinomer, 12 brystcancere, 22 gastriske cancere, 9 renale cancere, 18 coloncancer, og deres tilstødende normale væv. VEGFR-2, herunder t-VEGFR2 og p-VEGFR2

Tyr1175, blev også påvist i 26 hepatocellulære karcinomer ved immunhistokemi. Prøverne blev fikseret i 10% neutral formaldehyd i 6 timer, paraffin-embedded, og skåret i 5 um-tykke sektioner til immunohistokemi med et kanin-anti-hSulf-1-antistof (Abcam inc., Cambridge, MA), en kanin-anti- VEGFR-2-antistof og en kanin anti-Phospho-VEGFR2

Tyr1175 antistof (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). Godkendelse til anvendelse af kliniske prøver blev givet af Research etiske komité, The Second Military Medical University, og vi har fået den skriftligt informeret samtykke fra alle deltagere, der er involveret i undersøgelsen.

Udarbejdelse af vektorer og adenovirus

plasmidet pcDNA3.1-hSulf1 indeholder hele længde hSulf-1 cDNA og vektoren pSUPER.retro.puro der indeholder hSulf-1 shRNA (19 oligonukleotidpar målrettet hSulf-1 cDNA positioner 294-312: GTATGTGCACAATCACAAT) blev venligt begavede fra Viji Shridhar (Institut for Eksperimentel Patologi, Mayo Clinic Cancer center, Rochester, MN). Vektoren pGenesil-1.1, der indeholder VEGFR-2 shRNA (19 oligonukleotidpar målrettet VEGFR-2 cDNA positioner 525-543: CAGAATTTCCTGGGACAGC) eller den negative kontrol shRNA (19 oligonukleotidpar: gacttcataaggcgcatgc) blev købt fra Wuhan Genesil Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, Kina).

for at rekombinere adenovirusvektor blev pcDNA3.1-hSulf1 bruges til at forstærke hSulf-1-cDNA med primere P1 (5′-cgggatccaccatgaagtattcttgc-3 ‘) og P2 (5’ gcgtcgacttaaccttcccatccatcccataac-3 ‘). PCR-produktet blev fordøjet med BamHI og Sall, og derefter indsat i adenovirus plasmid pDC315 (Microbix Biosystems, Ontario, Canada) for at generere pDC315-hSulf1. Plasmiderne pDC315-hSulf1 og pDC315-EGFP blev transficeret henholdsvis i HEK293-celler (Microbix Biosystems, Ontario, Canada) ved hjælp af PolyFect transfektionsreagens (QIAGEN Inc., Valencia, CA) sammen med adenovirus pakkende plasmid pBHGloxdelE13cre (Microbix Biosystems, Ontario, Canada). Efter en homolog rekombination i HEK293-celler, vi opnåede adenovira navngivne Ad5-hSulf1 og Ad5-EGFP. Ad5-EGFP blev anvendt som viruskontrollen. Alle adenovira blev amplificeret i HEK293-celler og oprenset ved ultra-centrifugering på cæsiumchlorid (CsCl) gradienter. De virale titre blev opdaget med Tissue Culture infektiøs dosis 50 (TCID50) metode [32] er oprettet ved Qbigene Inc. (IIIkich, Frankrig), og viste som pest-dannende enheder per milliliter (pfu /ml).

Cell kultur og transfektanter

ovariecancer cellelinje SKOV3 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), den hepatocellulært carcinom cellelinje BEL-7404 (Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina ) blev dyrket i medier efter udbydernes anbefalinger. Når cellerne var i logaritmisk fase, blev de inficeret med adenovirus (Ad5-hSulf1 eller Ad5-EGFP) ved MOI på 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 pfu /celle, og høstet 48 timer efter infektion. De virus-inficerede celler og deres forældre celler blev transficeret med hSulf-1 shRNA og VEGFR-2 shRNA vektorer ved hjælp af PolyFect transfektionsreagens (QIAGEN Inc., Valencia, CA) i henhold til udbyderens protokol. Fireogtyve timer senere, puromycin (3 pg /ml) eller G418 (400 ug /ml) blev tilsat for at vælge hSulf-1 shRNA transfektanter eller VEGFR-2 shRNA transfektanter hhv. Efter kontinuerligt dyrket i 24 timer, celler blev høstet og stilheden af ​​målet genekspression blev testet.

In vitro

undersøgelse af korrelationsmaalinger faktor udtryk

Kræftceller, herunder forældrenes, virusinficerede og shRNA transficerede celler, blev høstet 48 timer efter infektion eller transfektion. Totalt RNA blev ekstraheret fra 10

5 celler med TriZol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og anvendt til at amplificere hSulf-1-ekspression ved revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR), med primerne P3 (5’ccaccttcatcaatgcctt -3) og P4 (5’ccttgaccagtccaaactgc-3 ‘). De amplificerede fragmenter blev 762 bp. Glyceraldehyd phosphat dehydrogenase (GAPDH) blev amplificeret med primerne P5 (5’-accacagtccatgccatcac-3 ‘) og P6 (5′-tccaccaccctgttgcttgta-3’) som en indre kontrol. Totalt protein blev ekstraheret fra 10

5 celler ved M-PER pattedyrprotein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL) og undersøgt ved western blotting som tidligere beskrevet [33], med de angivne primære antistoffer, herunder kanin-anti-VEGFR -2 og kanin anti-Phospho-VEGFR-2

Tyr1175 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA).

Cell levedygtighed ved MTT assay

forældrenes, virus- inficerede og shRNA transficerede celler blev fortyndet i en koncentration på 10

5 celler /ml, og udpladet ved densitet på 100 ul /brønd i 96-brønds plader. Cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assay ved anvendelse af celleproliferation Kit I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) som beskrevet ovenfor [34]. Gennemsnitlig absorbans for hver prøve blev undersøgt med en mikropladelæser (model 550, BIO-RAD Laboratories, Tokyo, Japan) ved en bølgelængde på 570 nm med en reference bølgelængde på 655 nm.

dyremodeller og

in vivo

eksperimenter

SKOV3 og BEL-7404 celler blev subkutant injiceret i de rigtige flanker på BALB /c (nu /nu) mus (Shanghai Experimental Animal center, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) , 10

7 celler pr mus, til at etablere xenografter. Tre uger senere blev musene adskilt tilfældigt i 3 grupper: Ad5-hSulf1, Ad5-EGFP og kontrolgrupper, 5 mus pr gruppe. Mus i Ad5-hSulf1 og Ad5-EGFP grupper blev givet 5 intratumorale injektioner, én injektion hver anden dag, med en total dosis på 10

9 pfu virus per mus. Mus i kontrolgruppen fik det samme volumen af ​​viral konservering opløsning (10 mmol /L Tris-HCl pH 8,0, 2 mmol /l MgCl

2, 4% saccharose). Tumor størrelse blev målt regelmæssigt, og tumor volumen blev estimeret med formlen “

en

×

b

2 × 0.5″, hvor

en

b

repræsentere den maksimale og minimale diametre. Mus blev aflivet ved slutningen af ​​observationsperioden, og tumorerne blev fjernet, vejet og fikseret i 10% neutral formaldehyd i 6 timer. De paraffinindlejrede hinanden følgende sektioner blev skåret for behandlingen af ​​ekspressionen af ​​hSulf-1, t-VEGFR2 p-VEGFR2

Tyr1175 og t-AKT, p-AKT

Thr308 ved immunhistokemi og western blotting. Kanin-anti-Phospho-AKT

Thr308 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). MVD værdi i tumorvæv blev udført ved CD31 immunhistokemi under anvendelse af et rotte-anti-muse CD31 monoklonalt antistof (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). De positive celle procentsatser og MVD værdien i tumorer blev talt inden for 5 tilfældige høj effekt felter (oprindelig forstørrelse x 400) under mikroskop, og vist som middelværdi ± standardafvigelse (SD) [35].