PLoS ONE: antitumorvirkningen af ​​α-Solanin mod kræft i bugspytkirtlen In vitro og in vivo

abstrakt

α-solanin, et steroidt glycoalkaloid i kartoffel, viste sig at have proliferation-inhiberende og apoptose-fremmende virkning på flere cancerceller, såsom klon, lever, melanom cancerceller. Men antitumor effekt af α-solanin på bugspytkirtelkræft er ikke blevet fuldt evalueret. I denne undersøgelse, vi spurgte ind i den anti-kræftfremkaldende effekt af α-solanin mod humane bugspytkirtelkræftceller. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi kræfthæmmende virkning af α-solanin mod humane pankreatiske cancerceller. In vitro, α-solanin inhiberede proliferation af PANC-1, sw1990, MIA PaCa-2-celler i en dosis-afhængig måde, samt cellemigration og invasion med atoksiske doser. Ekspressionen af ​​MMP-2/9 blev ekstracellulær inducer af matrixmetalloproteinase (EMMPRIN), CD44, eNOS og E-cadherin undertrykt af α-solanin i PANC-1-celler. Desuden faldt betydeligt vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) ekspression og rør-dannelse af endotelceller blev skelnes følgende α-solanin behandling. Undertrykt phosphorylering af Akt, mTOR, og Stat3, og styrke phosphorylering af β-catenin blev fundet sammen med markant nedsat tran-nuklear af NF-KB, β-catenin og TCF-1. Efter administration af α-solanin (6 ug /g i 2 uger) i xenograft model blev tumor volumen og vægt faldt med 61% og 43% (p 0,05) henholdsvis som viste reduceret MMP-2/9, PCNA og VEGF udtryk. Som konklusion viste α-solanin gavnlige virkninger på pancreas cancer in vitro og in vivo, som kan via undertrykke pathway proliferation, angiogenese og metastase

Henvisning:. Lv C, Kong H, Dong G, Liu L, Tong K, Sun H, et al. (2014) antitumorvirkningen af ​​α-Solanin mod kræft i bugspytkirtlen In vitro og in vivo. PLoS ONE 9 (2): e87868. doi: 10,1371 /journal.pone.0087868

Redaktør: Yu-Jia Chang, Taipei Medicin University, Taiwan

Modtaget 2 oktober, 2013; Accepteret: December 26, 2013; Publiceret: 5 feb 2014

Copyright: © 2014 Lv et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev sponsoreret fra Kina National Natural Science Foundation (nr 81.070.372, No. 81.370.563), Zhejiang Provincial Program til dyrkning af højt niveau Innovative Health talenter og en Provincial Administration af traditionel kinesisk medicin i Zhejiang-provinsen, Kina (NO. WKJ2012-2 -033, No. 2011ZA072), en District forskning og udvikling Program for Longwan District of Wenzhou, Zhejiang, Kina (nr 2010YS5). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pankreatisk karcinom er en af ​​de mest aggressive og dødelige cancer på grund af manglen på en tidlig diagnose, lægemiddel-resistens og dårlig prognose, og som sådan er den fjerde største årsag til dødelighed kræft verdensplan [1], [ ,,,0],2]. I øjeblikket er den standard behandling af pancreas carcinoma er afhængig af kirurgi, stråling og narkotika. Men kun omkring 25% af bugspytkirtlen kræftpatienter diagnosticeret med resektabel formular tillægge invasionen af ​​sygdommen [3]. Gemcitabin, en standard first-line behandling af metastatisk kræft i bugspytkirtlen ved præsident, er meget udbredt, men viser dårlig terapeutisk virkning for at erhverve kemoresistens og en række af bivirkninger [4]. Således søger nye effektive lægemidler contraposing at forbedre den antiangiogene kapacitet og begrænse metastaser er desperat brug for kræft i bugspytkirtlen, målrette sine mest vaskulariserede og invasive tumorer.

Ud over induktion af kræft celle apoptose og nekrose inhibering af celleproliferation, infiltration og metastase er af afgørende betydning. Tumormetastaser er meget koordineret proces, som fremmes af forskellige proteolytiske enzymer som nedbryder den ekstracellulære matrix (ECM) og basalmembranen (BM). Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) menes at dominere deltage i tumorcellemigration, vævsinvasion og metastase [5]. MMP-2 og MMP-9 spiller nøgleroller i processen med metastase blandt de MMP’er. Celleadhæsionsmolekyle E-cadherin, regulering cellepolaritet, differentiering, proliferation og migration gennem sin intime associering med actin cytoskeletal netværk [6], viser en lavere ekspression i pancreas cancer end i normalt pancreasvæv [7]. Desuden har Wnt /β-catenin signaleringskaskade været relevant for cancer og vaskulær proliferation, skæbne specifikation og celle metastase. Wnt ligand binder til sin Frizzled receptor at inaktivere β-catenin ødelæggelse kompleks, hvilket fører til ikke-phosphoryleret β-catenin akkumulering i både cytoplasmaet og kernen. I kernen, β-catenin danner et heterodimert kompleks med TCF /LEF-familien af ​​DNA-bindende proteiner og derved aktiverer transskription af Wnt målgener, kompromittere c-Myc, survivin, cyclinD1, og MMP’er [8]. Nylige undersøgelser har vist, at phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) -Akt /pattedyr mål for rapamycin (mTOR) vej er også involveret i bugspytkirtlen endokrine tumorer (PETs) tumorigenese og progression [9], [10], celle overlevelse, celleadhæsion og metastase [11], [12]. Gennem krydstale med Wnt, NF-KB og MAPK pathways, Akt /mTOR aktivitet fremmer cancercelleproliferation, hæmning af apoptose og metastase [13], [14]. Desuden er konstitutivt aktiverede Stat proteiner fundet i flere tumorer [15], [16], [17], [18]. Desuden Wnt /β-catenin og Akt /mTOR veje regulere ekspressionen af ​​MMP’er ved transskriptionelle faktorer såsom NF-KB [19], [20]. Beviser er stigende, at NF-KB spiller en central rolle i udbredelsen, apoptose hæmning og angiogenese af kræft i bugspytkirtlen [21]. Således blokerer Wnt /β-catenin og Akt /mTOR veje samt stat og NF-KB give potentielle mål for kræft terapeutiske strategier.

α-Solanin, en bioaktiv komponent af de vigtigste steroide glykoalkaloider i kartofler er godt undersøgt for dens indvirkning på antitumoregenskaber. Adskillige rapporter har vist, at a-Solanin udviser vækstinhibering og apoptose induktion i flere cancerceller [22], [23]. Der er også tegn α-solanin have anti-inflammatoriske virkninger in vitro ved at reducere interleukin-2 og interleukin-8 produktioner [24]. Effekten og de tilknyttede molekylære mekanismer som følge af a-solanin mod kræft i bugspytkirtlen er endnu ikke blevet evalueret. Derfor vi vurderede effekten af ​​α-solanin udnytte bugspytkirtelkræft både in vitro og in vivo i nærværende undersøgelse.

Materialer og metoder

Etik Statement

I denne undersøgelse , pasning af dyr og forsøg blev udført i overensstemmelse med en godkendt protokol fra Animal Eksperimentel Etisk Inspektion af Laboratory Animal Centre, Wenzhou Medical College (Permit Nummer: wydw2013-0001). Alle operation blev udført under anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

1. Cellelinie og reagenser

α-solanin, blev dimethylsulfoxid (DMSO) købt fra Sigma-Aldrich (St.. Louis, MO, USA). Proteinassaykit blev opnået fra Bio-Rad Labs (Hercules, CA, USA). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og blev indkøbt fra Gibco /BRL (Gaithersburg, MD, USA). Matrigel var fra BD Biosciences (Bedford, MA, USA). Total RNA-ekstraktion kit og polymerasekædereaktion (PCR) kittet var fra Viogene (Sunnyvale, CA, USA). Antistoffer mod MMP-2, MMP-9, E-cadherin, TCF-1, STAT3 og phosphoryleret STAT3 blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Antistoffer mod β-actin, VEGF, PCNA, β-catenin, Akt, mTOR, blev phosphorylerede proteiner købt hos Abcam (Cambridge, MA, USA). PANC-1, sw1990 blev MIA PaCa-2 og human navlevene endotelcelle (HUVEC) opnået fra ATCC (Manassas, VA, USA). Pancreas cancer cellelinier opretholdt i DMEM med 10% FBS og inkuberet i en CO 5%

2 befugtet inkubator ved 37 ° C, HUVEC’er blev dyrket i M199-medium med 10% FBS. a-Solanin blev smeltet i DMSO og fortyndet med dyrkningsmedium (slutkoncentrationen af ​​DMSO var mindre end 0,1%).

2. Cellelevedygtighed Assay og koloniassay

Seeding 20.000 celler af hver cancercellelinie i hver brønd af 96-brønds plade og udskiftning af dyrkningsmedium indeholdende forskellige koncentrationer af α-solanin (3,6,9,12 ug /pi) efter 24 timer. Fortsat udvikling i 24 og 48 timer, hvorefter mediet blev erstattet med det friske medium optagelse af 10% CCK8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). Efter 1-4 timer blev supernatanterne målt spektrofotometrisk ved 450 nm.

forankringsuafhængig cellevækst evalueres ved at udføre koloniassay (GENMED SCIENTIFECS INC, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt 1,5 ml Base Agar matrixlag dispenseret i hver brønd i en plade med 12 brønde (prøver blev analyseret tredobbelt). Plade blev afkølet ved stuetemperatur, indtil fast stof. Derefter 1,5 ml vækst agar lag bestående af 2500 celler blev tilsat til hver brønd. Plade blev afkølet ved stuetemperatur, igen indtil vækstlag congealed. En yderligere 500 pi dyrkningsmedier indeholdende forskellige koncentrationer af α-solanin blev tilsat på toppen af ​​vækstlag. Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO

2 i 2 uger og totale kolonier blev talt.

3. Cell Migration og Invasion Analyser

Cell migration blev undersøgt ved at udføre sårhelende analyser. 10.000 celler af hver bugspytkirtelkræft cellelinje blev udpladet i høje 35 mm u–retter med kultur skær (Ibidi, Martinsried, Tyskland). Når celler voksede til konfluens, blev skær derefter fjernet med en steril tang for at skabe et sår på ca. 500 um. Efter fjernelse af cellulære rester med PBS blev cellerne udsat for forskellige koncentrationer af α-solanin i 24 timer. Cellemigration blev opfattet af omvendt mikroskop og fotograferet (100 ganges forstørrelse). Sårområdet blev skaleret med Image Pro Plus. Sårlukningen procent blev beregnet ved hjælp af ligningen: Sårlukning% = [1- (sårområde efter 24 h /sårområde efter 0 timer) × 100%

celleinvasion assays blev gennemført under anvendelse af 6,5 mm transwell kamre. udstyret med 8,0 um porestørrelse polycarbonatmembraner. I disse assays blev de øvre champers først coatet med 50 pi Matrigel ved en 1:05 fortynding, og inkuberet ved 37 ° C i 2 timer. Efter behandlet med α-solanin i 24 timer, serumfrie celler (10.000 celler /brønd) suspensionsmedium af hver pankreatisk cancercellelinie blev påsat toppen kammer i Transwell. De nedre kamre blev fyldt med 500 pi DMEM suppleret med 10% FBS. Efter inkubation ved 37 ° C i 6 timer blev ikke-invasive celler fysisk skrabet fra membranen med vatpinde. De invasive celler blev farvet med DAPI i 5 minutter og observeret med et fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Fluorescerende celler blev talt under anvendelse af Image Pro Plus.

4. In vitro

Angiogenese Assay

Analyse af kapillær-dannelse blev udført under anvendelse rørdannelse assays (Ibidi, Martinsried, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev en 15-brønd μ-Objektglas overtrukket med 10 pi Matrigel der fik lov at størkne ved 37 ° C. At evaluere virkningen af ​​α-solanin blev PANC-1-celler behandlet med forskellige koncentrationer af α-solanin i 24 timer, derefter det konditionerede medium blev opsamlet. HUVEC blev bragt i μ-Slide brønd og inkuberet med konditioneret medium af PANC-1 celler i 6 timer. Frembringelsen af ​​mobilnet blev fotograferet og kvantitativt evalueret af Image Pro Plus.

5. Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion

Totalt RNA blev ekstraheret fra PANC-1 med TRIzol Reagent (Ambion, Carlsbad, Californien, USA) ifølge producentens anvisninger. Totalt RNA (1 ug) af hver prøve blev underkastet oligo-dT-primet RT med ReverTra Ace qPCR RT kit (Toyobo, Osaka, Japan). Realtime polymerasekædereaktion (PCR) blev udført i en kvantitativ analyse af MMP-2, MMP-9, VEGF, EMMPRIN, E-cadherin og CD44-mRNA-ekspression under anvendelse af SYBR Green real-time PCR Master Mix (Toyobo) på en 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-betingelser var som følger: 95 ° C i 1 min, 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s. Primersekvenserne for GAPDH, MMP-2, MMP-9, VEGF, ENOS, EMMPRIN, E-cadherin og CD44 blev syntetiseret fra Invitrogen og anført i tabel 1. Analyse af kvantitative realtime PCR data blev udført på ACt-værdier.

6. Protein Ekstraktion og Western blot-analyse

Panc-1 celler blev lyseret i radioimmunaktivitet nedbør assay (RIPA) buffer indeholdende protease og phosphatase inhibitor (Roche, Basel, Schweiz). Nukleare og cytoplasmatiske proteiner blev ekstraheret med Nuclear og Cytoplasmiske Ekstraktion Reagenser (Beyotime, Jiangsu, Kina) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Proteiner blev fraktioneret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid geler elektroforese og overført til PVDF-membran (Solarbio). Membraner blokeret med 5% fedtfri tørmælk blev inkuberet med relevante antistoffer natten over ved 4 ° C. Derefter blev membranerne vasket tre gange med TBST og inkuberet med sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask tre gange med TBST, blev påvist target bands anvendelse af ECL (Advansta, Menlo Park, Californien, USA) og eksponeret på en film. Tætheden af ​​protein bands blev målt ved Mængde One.

7. Analyse af MMP-2 og MMP-9 Aktiviteter af gelatinezymografi

Aktiviteterne af MMP-2 og MMP-9 blev analyseret ved gelatinezymografi. PANC-1-celler blev inkuberet med serum-frit medium med forskellige koncentrationer af α-solanin i 24 timer. Det konditionerede medium blev derefter opsamlet og koncentreret. Hver prøve (20 ug) blev blandet med påsætningsbuffer og underkastet i 10% SDS-polyacrylamid-gel indeholdende 0,1% gelatine. Elektroforese blev udført ved 100 V i 1,5 timer ved 4. Geler blev derefter vasket med vaskebuffer (2,5% Triton X-100, 50 mmol /L Tris-HCI, 5 mmol /l CaCI

2, pH 7. 6), efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i reaktionspuffer (50 mmol /L Tris – HCl, 5 mmol /CaCI2, 0. 02% Brij-35, pH 7,6). Efter 42 timer blev gelerne farvet med Comassie blå (0,05% Comassie blå, 30% methanol, 10% eddikesyre) i 3 timer og affarvet med Affarvningsopløsningen (20% methanol, 10% eddikesyre, 70% ddH2O), indtil klare bånd blev synliggjort.

8. Dyr og tumorer

athymiske (nu /nu) mandlige nøgne mus blev opnået fra Shanghai Lab. Animal Research Center (Shanghai, Kina) og opstaldet under standard laboratorieforhold (pathogenfree betingelser med en 12 timers lys /12 timer mørke tidsplan). At producere tumor dyr, 5 × 10

6 PANC-1-celler blev subkutant injiceret i flankerne af fire uger gamle athymiske nu /nu hanmus. Når tumorerne kunne måles, blev musene inddelt i to grupper (6 /gruppe) tilfældigt. Animal pleje og forsøg blev udført i overensstemmelse med en godkendt protokol af Animal Eksperimentel Etisk Inspektion af Laboratory Animal Centre, Wenzhou Medical College.

9. Behandlingsmetoden og tumorxenoplantater Study

Kontrolgruppen, hvori 1 pl /g (vægt af mus) DMSO blev injiceret i bughulen på hver mus; den solanin gruppe, hvor 1 pl /g (vægt af mus) solanin blev injiceret på samme måde. Koncentrationen af ​​solanin er 5 pg /pl. Solanin havde en bemærkelsesværdig sikkerhed i en dosis på 5 ug /g (vægt af mus), og der var ingen kliniske og histologiske forskelle mellem behandlingsgrupperne og kontrolgruppen [25]. Hver gruppe blev behandlet med lægemiddel 1 gang om dagen i to uger. Legemsvægten af ​​mus og deres tumorstørrelser blev målt hver dag. Mus blev aflivet 2 uger efter lægemiddelindgivelse og tumorerne blev omhyggeligt adskilt og vejet. Tumorvolumenet blev beregnet ved formlen: 0,5236 L1 (L2)

2, hvor L1 er lang diameter, og L2 er kort diameter. En del af tumoren blev anvendt til Western blot og opbevaret i 4% paraformaldehyd i immunohistokemi, og resten blev frosset i flydende nitrogen.

10. Western Blot for MMP-2 og MMP-9 og immunhistokemisk farvning for PCNA og VEGF

xenograft protein ekstraktionsprocedure Tumoren og behandler processer er så samme som nævnt ovenfor. Sammenhængende 4-um snit blev skåret fra paraffinindlejrede tumor- væv til immunohistokemi. Snit blev blokeret med gedeserum og immunfarvet efter afparaffinering og rehydrering. Snit blev derefter inkuberet med en 1/200 fortynding af primært antistof mod PCNA eller VEGF til natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med sekundære antistoffer i 60 minutter ved stuetemperatur. Objektglassene blev fremkaldt med diaminobenzidin og modfarvet med hæmatoxylin. Proliferationsindekset (per 400 × mikroskopisk felt) blev bestemt som antallet af PCNA-positive celler /totale antal celler × 100. Den integrerede optiske densitet (IOD) blev analyseret for VEGF kvantificering. 6 felter blev udvalgt tilfældigt fra hver sektion. De gennemsnitlige IOD niveauer mellem to grupper blev derefter sammenlignet. Image-Pro Plus 6.0 software blev anvendt til analyse.

11. Statistisk analyse

Alle analyser blev udført af SPSS17.0 software. De viste data er repræsentative billeder eller udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af hver gruppe. Forskellen blandt grupper af celler blev analyseret ved anvendelse af ANOVA og uafhængige Sample t-test blev anvendt til analyse mellem grupper in vivo. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

1.. α-solanin Affect Cell Levedygtighed og hæmmer Colony Formation

Vi fandt, at behandlingen af ​​α-solanin (3,6,9 pg /pl) i 24 timer eller 48 timer ikke ændrede levedygtighed PANC-1 , sw1990 og MIA PaCa-2-celler signifikant (fig. 1A). Cellernes levedygtighed blev faldet betydeligt efter behandling af α-solanin på 12 pg /pl. Resultaterne viste, at cytotoksiciteten af ​​celler af hver cellelinje ikke var forårsaget af α-solanin ved 3, 6, 9 pg /pl i 24 timer og 48 timer. Vi anvendte ikke-toksiske doser af α-solanin til eksperimenter in vitro. Salg

(A) Celler af hver cancercellelinie blev behandlet med forskellige koncentrationer af α-solanin i 24 timer og 48 timer. (B) Billeder af forankringsuafhængig cellevækst af PANC-1 (100 × forstørrelse). (C) Kolonien nummer blev kvantificeret og data blev beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Hver søjle repræsenterer middel ± S.E.M. (N = 3). ** P. 0,01, sammenlignet med kontrolgruppen

For at belyse funktioner α-solanin i forankringsuafhængig vækst bugspytkirtelkræftceller, vi udnyttet en blød agar assay. Celler uden α-solanin behandlet dannet flere og større kolonier end a-solanin behandlede celler (fig. 1B, C), hvilket indikerer, at forankringsuafhængig vækst af pankreatiske cancerceller blev inhiberet af α-solanin på en dosis-afhængig måde.

2. α-Solanin inhiberer Cell Migration og Invasion

Sårheling assay og transwell invasion assay blev udført for at observere effekten af ​​α-solanin på celle maigratoin og invasion. Resultaterne viste, at α-solanin undertrykt migration og invasion af pankreatiske cancerceller i en dosisafhængig måde (fig. 2).

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af α-solanin i 24 timer. (A) Celler blev fotograferet (100 × forstørrelse). (B) Såret område blev kvantificeret i fire felter i hver behandling, og data blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg. (C) Celler blev fotograferet (100 × maginfication). (D) De invaderede celler blev kvantificeret ved at tælle fo DAPI-farvede celler. Hver søjle repræsenterer middel ± S.E.M. (N = 3) * p. 0,05, ** p 0,01, sammenlignet med kontrolgruppen

3.. α-Solanin Hæmmet Tube Dannelse af PANC-1-induceret EC’er og ekspression af VEGF

Vi fandt, at konditionerede medier af PANC-1-celler induceret rør dannelsen af ​​HUVEC, mens konditionerede medier fra PANC-1 behandles med α-Solanin undertrykt rør dannelsen af ​​HUVEC på en dosis-afhængig måde (fig. 3A, 3B). VEGF, som en angiogen faktor, fremmer angiogenese. Vores resultater viste også, at α-Solanin (3, 6 og 9 pg /pl) faldt markant mRNA og protein ekspression af VEGF i PANC-1-celler på en dosis-afhængig måde (fig. 3C, 3D og 3E). Data viste, at α-Solanin inhiberer angiogenese i ved at begrænse VEGF-ekspression.

(A) Repræsentative mikrografer (100 ×) af røret efter behandling af konditioneret medium i 6 timer. HUVECS blev udpladet på Matrigel -precoated brønde og dyrket i konditioneret medium fra Panc-1-celler behandlet med i 24 timer. (B) De rør længder blev målt af Image-ProPlus 6.0. (C) mRNA ekspression af VEGF blev præsenteret som middelværdi ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg. (D) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​VEGF. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (E) Kvantificering af western blot resultat blev udført ved at beregne forholdet mellem værdien til kontrolgruppen. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontrolgruppen

4. α-Solanin Udøver Ekspression af Metastase Associated Molecule

Ekspression af gener associeret med cancer progression og metastase blev udført ved kvantitativ realtids-PCR (fig. 4A). Aktiveringen af ​​MMP er et afgørende skridt for ECM nedbrydning, der inducerer celle invasion. Resultaterne viste, at α-Solanin undertrykt mRNA ekspression af MMP-2, MMP-9, ENOS, EMMPRIN og CD44 på en dosisafhængig måde. Protein ekspression af MMP-2 og MMP-9 blev også undertrykt på en dosisafhængig måde (fig. 4B, 4D). Gelatinezymografi assay viste også, at MMP-9 og MMP-2-aktiviteterne markant reduceret med 6 og 9 pg /pl α-Solanin (fig. 4E, 4F). Endvidere α-Solanin ureguleret ekspressionen af ​​E-cadherin (fig. 4C, 4D), som kan øge adhæsion mellem cellerne. Således kunne α-Solanin inhibere metastase ved at påvirke den proteolytiske aktivering og klæbende kapacitet.

(A) mRNA-ekspression af MMP-2/9, blev EMMPRIN, CD44, ENOS og Ecadherin præsenteret som middelværdi ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg. (B) Udtrykkene af MMP-2 og MMP-9-protein blev analyseret ved Western blot. (C) udtrykkene for Ecadherin protein blev udført ved Western blot. (D) Kvantificering af western blot resultater blev udført ved at beregne forholdet mellem værdien til kontrolgruppen. (E) aktiviteten af ​​MMP-2 og MMP-9 blev analyseret ved gelatinezymografi. (F) Kvantificering af gelatinezymografi resultaterne blev udført ved at beregne forholdet mellem værdien til kontrolgruppen. * P 0,05, ** p 0,01, sammenlignet med kontrollen. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.

5. α-Solanin Reguleret Associerede signalproteiner

Forskning indikerede, at Wnt /β-catenin, er Akt /mTOR og JAK /STAT pathways involveret i ekspressionen af ​​MMP’er og inducere metastase. α-Solanin inducerede ekspressionen af ​​phosphorylering af β-catenin og inhiberede phosphorylering af STAT3 i en dosis og tid afhængig måde (fig. 5). Data viste også, at α-Solanin reducerede phosphorylering af Akt og mTOR i en dosis og tid afhængig måde (fig. 6). Desuden α-Solanin nedregulerede niveauet af β-catenin og TCF-1 i kernen (fig. 7). Således kunne α-Solanin undertrykke celleinvasion og MMP-2/9-ekspression dels via inhibering Wnt /β-catenin, Akt /mTOR og JAK /STAT pathways.

PANC-1-celler blev behandlet med forskellige doser af α-solanin i 24 timer, eller 9 ug /pi α-solanin for 6,12,18,24 timer. Phosphoryleringen niveau af β-catenin (A, B), Stat3 (C, D) blev bestemt ved Western blot. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (E, F, G, H) Kvantificering af western blot resultater blev udført ved at beregne forholdet mellem værdien til kontrolgruppen. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollen

PANC-1-celler blev behandlet med forskellige doser af α-solanin i 24 timer, eller 9 ug /pi α- solanin for 6,12,18,24 timer. (A, C) phosphoryleringsniveauet af Akt og mTOR blev bestemt ved Western blot. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (B, D) Kvantificering af western blot resultater blev udført ved at beregne forholdet mellem værdien til kontrolgruppen. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollen

PANC-1-celler blev behandlet med forskellige doser af α-solanin i 24 timer. (A, C) Indholdet af NF-KB /p65, β-catenin og TCF-1 i kernen blev bestemt ved Western blot. Laminb1 blev anvendt som en kerneprotein loading kontrol. (B, D) Kvantificering af de densitometriske resultater blev udført ved at beregne forholdet mellem værdien til kontrolgruppen. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontrolgruppen

6. α-Solanin Nedsat Ekspressionen af ​​NF-KB /p65 i Nucleus of PANC-1-celler

Den relative nuklear niveau af NF-KB /p65 i PANC-1-celler blev bestemt ved anvendelse af Western blot-assay. Vi fandt, at behandling med α-Solanin signifikant decreasd ekspressionen af ​​NF-KB /p65 i PANC-1 celler (fig. 7A, 7B). Konstitutiv aktivering af NF-KB kan fremme celleproliferation, inhiberer celle apoptose og regulere ekspressionen af ​​gener associeret med angiogenese. Således kunne α-Solanin øge inhibering af cellevækst og proliferation og fremmer bugspytkirtelkræft celle apoptose ved at inhibere ekspressionen af ​​NF-KB.

7. a-solanin Undertrykker in vivo Vækst af bugspytkirtelkræft Cell PANC-1 tumorxenoplantater

Administration af solanin til nøgne mus hæmmede xenograft vækst i PANC-1 tumor (fig. 8). I slutningen af ​​14 dage efter undersøgelsen i PANC-1 xenograft, solanin faldt tumor volumen /mus fra 701.97 ± 157,86 mm

3 i kontrolgruppen til 273.54 ± 57,27 mm

3, svarende til en 61% (P 0,05) reduktion i tumorvægt. Vi observerede der var en lille nedgang i kropsvægt både i kontrolgruppen og i solanin behandlede gruppe. Grunden til det var endnu ikke klart.

PANC-1-celler blev subkutant injiceret i flankerne af nøgne mus. Når tumorerne kunne måles, blev musene givet DMSO eller α-solanin i 2 uger. (A) Tumorvolumen /mus som en funktion af tid. (B) Musen for hver gruppe blev overvåget for legemsvægt en gang om dagen. Mean legemsvægt /mus som en funktion af tid. (C) Tumorvolumen /mus og (D) tumorvægt /mus ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev analyseret. * P. 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen

8. α-Solanin Undertrykker Metastase, Cell Proliferation og angiogenese i Xenografter Model

MMP-2 og MMP-9 spiller en afgørende rolle i processen med metastaser blandt MMP. Vi undersøgte pancreatisk tumor xenograft ved Western blot og fundet α-Solanin kan væsentligt formindske ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 (fig. 9A, 9B). Proliferation og angiogenese er de to ekstensivt anvendte biomarkører, der har været ansat til at måle aggressivitet solide tumorer. Derfor blev tumorer analyseret for anti-proliferation og anti-angiogenese af α-Solanin af PCNA og VEGF-farvning gennem immunohistokemiske metoder. Den PCNA farvning og VEGF-farvning af tumorer udviste ringe immunoreaktivitet i solanin behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 9B, 9C). Kvantificeringen viste 78 ± 4% PCNA-positive celler i kontrolgruppen versus 29 ± 3% i solanin behandlede gruppe tegner sig for 63% reduktion (p 0,01), og den gennemsnitlige IOD af VEGF farvning udført 70% fald (p 0,01) i solanin behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. Denne undersøgelse bekræftede in vivo antitumor mekanisme af solanin effektivitet mod PANC-1 tumorvækst.

Når tumorxenografter blev separeret, dele af tumor blev anvendt til Western blot og immunohistokemi. (A) Udtrykkene af MMP-2 og MMP-9-protein blev analyzede ved Western blot. (B, C) Tumor tissus blev innunohistochemically analyseret for PCNA-positive celler og VEGF farvning tæthed. Repræsentative fotografier af IHC-farvning af PCNA og VEGF er vist ved 400 × forstørrelser. Scale bar: 50 pm. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± SE. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontrolgruppen

Diskussion

α-Solanin er en slags steroid alkaloider, som produceres af planter af sloanaceae familien . Høj koncentration af α-Solanin kan generere cytotoksiske virkninger, som inducerer hurtig beskadigelse af plasmamembranen forårsager dødelige sygdom i stofskiftet [26]. Adskillige undersøgelser viser, at α-Solanin hæmmer præimplantationsembryon udvikling [27], [28], normale humane leverceller [22]. Desuden har α-Solanin vist sig at reducere cytokin og nitrogenoxid produktioner i Con A-induceret Jurkat-celler og LPS-stimulerede Rå makrofager [24], inhibere tumornekrosefaktor-α (TNF-α) og interleukin (IL) -6 i muse peritoneale makrofager på grund af undertrykkelsen af ​​p38, JNK og ERK1 /2 [29]. Nyere undersøgelser har vist, at α-Solanin udfører antitumorvirkning, såsom fastholdende proliferationen af ​​cancer cellelinjer og inducere apoptose og fald i mutation af p53 af gastrisk cancercellelinier [22], [23], [30]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi ikke-toksisk koncentration af α-Solanin (3, 6 og 9 pg /pl) og fandt, at α-Solanin inhiberer metastase in vitro, såsom invasion, migration og angiogenese, hvilket indikerer, at den inhibitoriske virkning af α-Solanin på metastase var ikke ved dens cytotoksiske funktion. Vi først vurderede effekten af ​​α-Solanin in vivo og fandt α-Solanin kan hæmme proliferation, angiogenese og metastase i tumor xenograft i athymiske nøgne mus.

Kræft metastase er en mangesidet proces, som genetisk ustabile kræftceller udvikler tilpasning og ecesis til et væv mikromiljø, der er fjernt fra den primære tumor [31], der involverer tab af cellulær vedhæftning, øget migration og invasion, cirkulation gennem de vaskulære /lymfesystemet og spiring af koloniale tumorer på fjerne steder [32], [33] . Nedbrydning af ECM og BM af proteolytiske enzymer og i henhold invasion er uundværlige for metastaser [34]. MMP’er er de vigtige proteolytiske enzymer som nedbryder ECM og BM. Blandt disse er MMP-2 og MMP-9 stærkt udtrykt i pancreascancer [35]. Inhibering af pankreatisk cancercellelinie metastase medieret af nedregulering af ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 [36], [37]. EMMPRIN, stimulerende peritumorale fibroblaster til at producere MMP’er, udført med en særlig høj ekspression i bugspytkirtelkræft celle [38]. Kræft i bugspytkirtlen celle invasion og metastase kan undertrykkes gennem anti-EMMPRIN terapi [39]. CD44, et transmembrant glycoprotein med bindende domæner for hyaluronsyre, som er afgørende komponent i ECM, er stærkt udtrykt i bugspytkirtelkræft [40]. Endvidere E-cadherin er et centralt molekyle involveret i conditioning celle-celle adhæsion.