PLoS ONE: Kemoterapi sensibiliserer tyktarmskræft Start Celler til Vγ9Vδ2 T cellemedieret cytotoksicitet

Abstrakt

Tyktarmskræft består af en lille population af cancer indlede stamceller (CIC), der er ansvarlig for tumor vedligeholdelse og modstandsdygtighed over for anti-cancer behandlinger, muligvis giver mulighed for tumor rekapitulation når behandling stopper. Kombinationer af immun-baserede terapier med kemoterapi og andre antitumormidler kan være af signifikant klinisk fordel i behandlingen af ​​coloncancer. Imidlertid har cellulære immun-baserede terapier ikke eksperimenteret endnu i populationen af ​​kolon CIC. Her viser vi, at behandling med lave koncentrationer af almindeligt anvendte kemoterapeutiske stoffer, 5-fluorouracyl og doxorubicin, bevidstgøre kolon CIC til Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksicitet. Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksicitet blev stort set medieret af TRAIL interaktion med DR5, efter NKG2D-afhængig anerkendelse af kolon CIC mål. Vi konkluderer, at

in vivo

aktivering af Vγ9Vδ2 T-celler eller adoptiv administration af

ex-vivo

udvidede Vγ9Vδ2 T-celler med passende mellemrum efter kemoterapi kan væsentligt øge anti-tumor aktiviteter og repræsenterer en ny strategi for tyktarmskræft immunterapi

Henvisning:. Todaro M, Orlando V, Cicero G, Caccamo N, Meraviglia S, Stassi G, et al. (2013) Kemoterapi sensibiliserer Colon Cancer Iværksættelse celler til Vγ9Vδ2 T cellemedieret cytotoksicitet. PLoS ONE 8 (6): e65145. doi: 10,1371 /journal.pone.0065145

Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxembourg

Modtaget: Marts 5, 2013; Accepteret: April 23, 2013; Udgivet: 6 Juni 2013

Copyright: © 2013 Todaro et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af tilskud fra det italienske ministerium for undervisning, universiteter og forskning (kontrakt nr 2008L57JXW til FD.), det italienske sundhedsministerium (Progetto Ricerca Finalizzata 2007 “Stamceller i forskellige patologiske tilstande: innovative terapeutiske approches” til FD), Istituto Superiore di Sanità Oncoproteomic Projekt 2007-527 /B /3A /3 (til GS og FD) og University of Palermo. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer nogen finansiel eller kommerciel interessekonflikt. Den tilsvarende forfatter, Francesco Dieli, er en akademisk Redaktør af PLoS ONE. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

I de seneste år, nye indsigter i kræftforskning har foreslået, at evnen til at iværksætte og opretholde tumorvækst er en unik egenskab ved en lille delmængde af cancerceller med stemness egenskaber inden tumormassen, kaldet “cancer stamceller” (CSCS) eller “cancer-initierende celler” (CICS) [1]. Kemoterapi er stadig den primære behandling valg for mange avancerede kræftformer og har cytotoksisk anti-tumor aktivitet gennem en række mekanismer. Men de fleste kræftformer er resistente over for nuværende behandlinger på grund af de langsomme-cykling CIC, placeringen af ​​disse celler i hypoxiske nicher [2], [3], og fordi de maligne celler har kapacitet til at udvikle mekanismer til at modstå eller undslippe cytotoksiske virkninger af kemoterapi [4], som omfatter opregulering af adskillige ATP-bindende kassette transportører, aktiv DNA-reparation kapacitet og overekspression af anti-apoptotiske molekyler, der forårsager ændringer i signalveje, der kontrollerer proliferation, differentiering og apoptose [5] .

Flere undersøgelser har vist, at behandling af tumorceller med kemoterapeutiske lægemidler inducerer eller forøger deres følsomhed over for cytotoksicitet ved NK eller T-lymfocytter; Således kan kombinationer af cellulære immun-baserede terapier med kemoterapi og andre antitumormidler være af væsentlig klinisk fordel i behandlingen af ​​mange former for cancer [6].

γδ T-celler er af særlig interesse til anvendelse i sådanne kombinerede terapier på grund af deres potente anti-tumor cytotoksicitet og den relative lethed af generation

in vitro

[7]. Humane γδ T-celler kan opdeles i to hovedgrupper populationer baseret på δ kædeekspression [8]: γδ T-celler, der udtrykker Vδ1 kæden findes oftest i slimhindevæv, hvor de er involveret i at opretholde epitelvæv integritet over for beskadigelse, infektion eller tumor transformation, mens γδ T-celler, der udtrykker Vδ2 kæde parres med Vγ9 kæden (her og derefter kaldet Vγ9Vδ2 T-celler) dominerer i det perifere blod og sekundære lymfeorganer [9]. Mens liganden (er) genkendes af Vδ1 celler forbliver ukendt, Vγ9Vδ2 T-celler genkender ikke peptidiske antigen ved en MHC-ubegrænset mekanisme, et vigtigt træk, som adskiller dem fra αβ T-celler [9]. Specifikt Vγ9Vδ2 T-celler genkender phosphoantigens der er produceret gennem isoprenoid biosynteseveje [10] – [12]. Phosphoantigens er ikke stimulerende ved fysiologiske niveauer, men transformeres og inficerede celler, producerer forhøjede niveauer af metaboliske mellemprodukter, der er i stand til at aktivere Vγ9Vδ2 T-celler [13] – [15]. Følgelig kan Vγ9Vδ2 T-celler også aktiveres via en indirekte mekanisme, ved aminobisphosphonates, en klasse af lægemidler, der anvendes til behandling af visse knoglesygdomme, der inhiberer farnesylpyrophosphat syntase, og forårsage akkumulering af endogene opstrøms metabolitter, såsom isopentenylpyrophosphate (IPP) [16 ]. Vγ9Vδ2 T-celler kan indirekte bidrage til immunforsvaret mod kræftceller, ved at producere cytokiner typiske for Th1, Th2 eller Th17 celler [17] – [19], eller cross-taler med dendritiske celler [20], makrofager [21] og B celler [22] – [24]. Derudover Vγ9Vδ2 T-celler udføre direkte potent cytotoksisk aktivitet over cancerceller, som medieres på næsten samme måde som for CD8 T-celler og NK-celler, gennem perforin /Granzym, Fas /FasL, TNF /TNF-R og TRAIL-trail R pathways [10].

i denne undersøgelse har vi vurderet den potentielle synergi kombinere kemoterapi og Vγ9Vδ2 T-cellemedieret cytotoksicitet for antitumorterapi. Konkret som kolon CIC er resistente over for både kemoterapeutiske stoffer og til Vγ9Vδ2 T cellemedieret cytotoksicitet, har vi fastslået, om kemoterapi kan bruges til at bevidstgøre kolon CIC mål til Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksicitet, baseret på tre linjer af beviser: (1) banebrydende arbejde ved Mattarollo og kolleger [25] har vist høj cytotoksicitet over for faste tumorafledte cellelinjer med kombinationsbehandling ved anvendelse Vγ9Vδ2 T-celler og kemoterapeutiske midler; (2) IL-17-producerende γδ T-celler spiller en afgørende rolle i kemoterapi-induceret anti-cancer immunresponser i mus [26]; (3) behandling af kolon CIC med bisphosphonat zoledronat forbedrer deres følsomhed over for Vγ9Vδ2 T-celle drab [27].

Vi viser her, at kemoterapeutiske lægemidler øjeblikket anvendes til behandling af patienter med tyktarmskræft, 5-fluorouracyl og doxorubicin, er i stand til at bevidstgøre kolon CIC til Vγ9Vδ2 T-celle-medieret drab og vi viser, at de underliggende mekanismer involverer NKG2D og TRAIL.

Resultater

Resistance of Colon CIC til kemoterapi

vi har tidligere rapporteret, at tyktarmskræft omfatter et stort flertal af differentierede celler og en lille population af CIC, der er ansvarlige for tumor initiering og vedligeholdelse [28]. Til denne undersøgelse formål, vi oprenset og propageret coloncancer kugler fra kirurgiske fragmenter af 5 patienter med colon carcinoma. Disse cancer sfære linjer blev identificeret ved ekspressionen af ​​CD133 og epithelial antigen ESA, vises overholdelse dyrkningsskålene i nærvær af serum og efterfølgende differentieret til store, polygonale kolon celler, der udtrykker colonepitelceller markører, såsom villin, hvilket antyder, at kolon kræft kugler fastholdt evnen til at

in vitro

differentiere i enterocytterne-lignende celler. Vigtigst er det, når det injiceres subkutant i NOD /SCID-mus, et lavt antal coloncancer sfærer, men ikke kugle-afledte differentierede celler, bevarede evnen til at danne en tumor, der lignede den humane oprindelige tumor (Støtte fig S1).

CIC er kendetegnet ved høj resistens over for lægemidler og generelle toksiner, som hurtigt rettet mod prolifererende celler og skåne langsomme delende celler, på grund af en opregulering af flere ATP-bindende kassette transportører, aktiv DNA-reparation kapacitet, overekspression af anti-apoptotiske molekyler, der forårsager ændringer i signalveje, der kontrollerer proliferation, differentiering og apoptose [5]. Følgelig eksponering af 5 forskellige kolon CIC linjer (CIC # 1 til CIC # 5) til 5-FU (2,5 og 25 ug /ml) (figur 1A) eller DXR (0,025 og 0,25 uM) (figur 1B) i 24-72 hrs havde stort set ingen signifikant cytotoksisk virkning, som bestemt af PI farvning. Højeste doser af 5-FU (250 ug /ml) og DXR (2,5 uM) forårsagede lav, men påviselig cytotoksicitet CIC linjer spænder fra 15 ± 5% til 23 ± 6% (middelværdi ± SD). Omvendt 5-FU og DXR var fuldt ud i stand til at dræbe 3 differentierede tyktarmskræft cellelinjer DLD-1, SW620 og SW403, og 2 differentierede cellelinier (CDC # 3 og CDC # 4) opnået fra to patienter (P # 3 og P # 4) hvor dannelse CICS linjer blev også opnået med en dosisafhængig stigning i cytotoksicitet op til 85%. Levedygtigheden af ​​ubehandlede celler var over 90% (figur 1A og B).

Colon CIC, differentierede tyktarmskræft cellelinjer DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 og CDC # 4 blev behandlet med forskellige koncentrationer af 5-FU eller DXR i 48 timer. Cytotoksicitet (% ± SD) blev bestemt ved graden af ​​reduktion af levedygtige celler med evnen til at fastholde CFSE og eksklusive PI (CFSE

høj PI

-). Vist er et repræsentativt forsøg ud af tre.

Kemoterapi sensibiliserer Colon CIC til Vγ9Vδ2 T-cellecytotoksicitet

Analogt til deres resistens mod kemoterapi, de fem testede kolon CIC linjer, var også resistent over for Vγ9Vδ2 T-cellemedieret cytotoksicitet, selv når et E: T-forhold på 50:1 blev anvendt (Figur 2A). De fattige cytotoksisk aktivitet mod kolon CIC var ikke en iboende træk ved Vγ9Vδ2 T-celler, fordi de differentierede tyktarmskræft cellelinjer DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 og CDC # 4 blev effektivt dræbt af to Vγ9Vδ2 T-cellelinjer COLD2 -1 og COLD2-2 opnået fra to forskellige patienter med tyktarmskræft (P # 3 og P 4 #) (figur 2A), samt Vγ9Vδ2 T-cellelinier fra sunde individer (data ikke vist). Som en kontrol, alle de testede Vγ9Vδ2 T-cellelinier undladt at dræbe den normale colon cellelinie CCL-241 (figur 2A).

(A) Cytotoksicitet procentdel af 2 forskellige til Vγ9Vδ2 T-cellelinier, COLD2-1 og COLD2-2 opnået fra 2 patienter med tyktarmskræft, mod tyktarmskræft sfære celler fra 5 forskellige patienter (CIC # 1 til CIC # 5), differentierede tyktarmskræft cellelinjer DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 og CDC # 4, og den normale colon cellelinie CCL-241, ved et E: T-forhold på 50:1. (B) Tre forskellige mål kolon CIC (CIC # 2, CIC # 4 og CIC # 5) behandles med eller uden enten 5-FU (2,5 til 250 ug /ml) eller DXR (0,025 til 2.5 uM) i 48 timer blev testet for deres følsomhed over for 2 forskellige til Vγ9Vδ2 T-cellelinier, COLD2-1 og COLD2-2 opnået fra 2 patienter med coloncancer og anvendes ved et E: T-forhold på 20:01. Resultater viser cytotoksiciteten af ​​tumortargets følgende 6 timer co-kultur med Vγ9Vδ2 T-cellelinier. Data er gennemsnitlige procentvise ± SD af 5 forskellige forsøg, hver udført in triplo.

I tidligere undersøgelser har vi vist, at zoledronat sensibiliserer coloncancer CIC til Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksicitet [27]. Evnen til Vγ9Vδ2 T-celler til at dræbe kolon cancer CIC blev derefter vurderet efter behandling af målene med kemoterapi. Repræsentative resultater opnået med tre forskellige CIC linjer (CIC # 2, CIC # 4 og CIC # 5) er vist i figur 2B. Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksicitet blev forbedret i alle tilfælde ved forbehandling af target CIC med kemoterapi. I detaljer, næsten fuldstændig lysis af CIC linjer resulterede fra kombinationen af ​​de højeste doser af 5-FU (250 ug /ml) eller DXR (2,5 uM) og Vγ9Vδ2 T-celler, med celledød procenter over 90% ved et E: T forhold på 20:01. Behandling af mål med lavere doser kemoterapi (2,5 og 25 ug /ml 5-FU og 0,025 og 0,25 uM DXR) resulterede i forøget drab af CIC linjer ved Vγ9Vδ2 T-celler, hvilket viser, at kemoterapi og Vγ9Vδ2 T-celler har additiv aktivitet, selv når det anvendes i suboptimale doser.

kemoterapi opregulerer DR5 (TRAIL-R2) Død receptor Expression på CIC

for at dechifrere de molekylære mekanismer bag kemoterapi-medieret sensibilisering af CIC til Vγ9Vδ2 T celler cytotoksicitet, vi fokuseret på udtryk af mRNA, der koder for molekyler der vides at være ligander for vigtige aktiverende receptorer på Vγ9Vδ2 T-celler og dødsreceptorer, før og efter eksponering af CIC til kemoterapimidler. Som vist i figur 3, blev alle disse molekyler udtrykkes konstitutivt i CIC, selv om ekspression konsekvent varierede mellem forskellige CIC linjer; dog blev der ikke observeret væsentlige forskelle i alle testede CIC linjer for HLA-klasse I, ICAM-1, CD155, CD112, GLIMMER /B og ULPBP1-4 udtryk før og efter udsættelse for kemoterapeutiske stoffer.

RT PCR af ekspressionen af ​​mRNA, der koder for forskellige overflademolekyler i Colon CIC’er behandlet med eller uden enten 5-FU (25 ug /ml) eller DXR (0,25 uM) i 48 timer. Data repræsenterer middelværdier ± SD af 4 separate forsøg, hver udført med tyktarmskræft kugler fra 5 forskellige patienter (CIC # 1 til CIC # 5).

Ekspression af Fas (CD95), TNF R1, DR4 (TRAIL-R1) og DR5 (TRAIL-R2) dødsreceptorer blev forøget i de fleste CIC linjer efter eksponering for kemoterapeutiske midler (figur 3), men forøget ekspression af Fas, har TNF-R1 og DR4 ikke opnå statistisk betydning. Den største og signifikant stigning blev kun observeret for DR5 ekspression efter eksponering af CIC’er til 5-FU og, om end i et mindre omfang, DXR (figur 3). Opregulering af DR5 efter 48 timer eksponering af kolon CIC’er for kemoterapi blev bekræftet ved flowcytometri ved farvning med specifikke mAb (figur 4).

Colon CIC blev behandlet med medium, 5-FU (25 ug /ml) eller DXR (0,25 uM) i 48 timer, vasket ekstensivt og farvet med anti-DR5 mAb. Flowcytometri histogrammer viser DR5. Mean fluorescensintensitet (MFI) for DR5 farvning er angivet i øverste højre hjørne af hvert panel. Stiplede linjer repræsenterer isotypekontrol mAb, mens grå fyldt histogram repræsenterer anti-DR5 mAb.

Aflivning af kemoterapi-behandlede CIC ved Vγ9Vδ2 T-celler medieres af NKG2D og TRAIL

Vγ9Vδ2 T celler udnytter forskellige veje til drab af tumorceller, som er afhængige af sekretion af proinflammatoriske cytokiner og proapoptotiske molekyler eller på celle-kontakt-afhængig lysering gennem NK-lignende eller TCR-afhængige interaktioner [9]. Vi vurderede de mekanismer, der er ansvarlige for drab af kemoterapi-sensibiliseret CIC ved Vγ9Vδ2 T-celler, ved individuelt at blokere TCR eller NKG2D receptorer. Cytotoksicitet af kemoterapi-forbehandlet kolon CIC linjer ved to forskellige Vγ9Vδ2 T-cellelinier blev signifikant inhiberet af anti-NKG2D mAb, medens Vγ9Vδ2 TCR synes at spille en mindre rolle som angivet ved svigt af anti-CD3 og anti-pan γδ TCR mAb’er at inhibere cytotoksicitet (figur 5). Desuden blev Vγ9Vδ2 T-celle drab af kemoterapi-sensibiliserede mål vurderes i nærværelse af mevastatin, som inhiberer 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA og forhindrer zoledronat-medieret akkumulering af endogene phosphoantigens som IPP. Mevastatin undladt at inhibere drab af alle testede kemoterapi-forbehandlet kolon CIC linjer ved to forskellige allogene Vγ9Vδ2 T-cellelinier (figur 5), hvilket viser, at kemoterapi-induceret sensibilisering af CIC til Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksicitet er ikke afhængig af produktionen af ​​mevalonat metabolitter.

Vγ9Vδ2 T-cellelinie COLD2-1 var dyrket med to kemoterapi-behandlede kolon CIC (CIC # 3 og CIC # 5) ved et E: T-forhold på 20:01, i nærvær af blokerende antistoffer mod den γδ TCR, CD3, NKG2D, eller i nærvær af mevastatin. Specifikke cytotoksicitet niveauer opnået ved Vγ9Vδ2 T-celle linie COLD2-1 var 65 ± 11 for CIC # 3 og 71 ± 9 for CIC # 5. Data er gennemsnit ± SD af to forsøg udført tredobbelt. Procent hæmning med anti-NKG2D mAb var signifikant anderledes end værdier i alle andre grupper (* p 0,001).

For yderligere at belyse de mekanismer drab af kemoterapi-sensibiliseret kolon CIC ved Vγ9Vδ2 T-celler, vi inhiberede individuelt granulatet exocytose,-TNF-α-, trail, og FasL-medierede pathways. Killing-inhiberingseksperimenter afslørede, at Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksicitet af kemoterapi-forbehandlet kolon CIC-mål blev signifikant inhiberet af anti-DR5-mAb, medens mAb’er mod DR4, TNF-α, og FasL, eller behandling med CMA at blokere granulaholdige exocytose pathway, alle mislykkedes at hæmme. Figur 6 viser repræsentative data med to Vγ9Vδ2 T-cellelinjer og to kolon CIC linjer, CIC # 2 og CIC nr.4.

Vγ9Vδ2 T-celle linie COLD2-1 blev dyrket med to kemoterapi-behandlede kolon CIC ( CIC # 3 og CIC # 5) ved et E: T-forhold på 20:01, i nærvær af blokerende antistoffer mod TNF-α, FasL (CD95L), TRAIL-receptorer R1 (DR4) eller R2 (DR5), eller concanamycin A (CMA). Specifikke cytotoksicitet niveauer opnået ved Vγ9Vδ2 T-celle linie COLD2-1 var 61 ± 7 for CIC # 3 og 65 ± 12 for CIC # 5. Data er gennemsnit ± SD af forsøg udført tredobbelt. Procent hæmning med anti-DR5 og anti-TRAIL mAbs var signifikant anderledes end værdierne i alle andre grupper (* p 0,001).

Diskussion

Det er nu på vej, at kræft er genereret af en population af celler, som viser stemness funktioner, navngivet cancer stamceller eller cancerceller-initierende celler (CIC) [1], [2]. Disse celler, som kun bidrager til en mindre fraktion af den totale tumormasse, undergår langvarig udvidelse med bevarelse af deres evne til at reproducere den originale tumor-fænotypen, hvilket giver bevis for selvfornyelse og tumorfremkaldende kapacitet [1], [ ,,,0],2]. CIC befolkning er mere modstandsdygtig end differentierede primære celler til konventionel kemoterapi og radioterapi og til putative innovative terapier såsom de baseret på anvendelsen af ​​TRAIL. Denne ildfasthed er blevet tilskrevet det forhold, at CIC’er ekspres multilægemiddelresistens gener, herunder høje niveauer af anti-apoptotiske proteiner og ABC (ATP-binding kassette) transportører hvilken pumpe ud lægemidlerne, men også til det faktum, at kemoterapi mål delende celler og følgelig ikke dræbe den langsomme-cykling CIC [3] -. [5]

data fra de seneste kliniske undersøgelser har antydet, at kombinere kemoterapi med immunterapi har overlevelse fordele end kemoterapi alene [6], [29], som beskrevet for eksempel ved kombinationen af ​​kemoterapi og monoklonale antistoffer [30] – [32]. Desuden er det kendt, at kemoterapeutiske lægemidler kan sensibilisere tumorceller til cytotoksicitet medieret af CD8, NKT eller Vγ9Vδ2 T-celler [33] thorugh flere forskellige mekanismer [34]. Men vi for nylig fundet, at kolon CIC’er er resistente over for Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksicitet, medmindre de er sensibiliseret med zoledronat [35]: Tilsvarende har vi nu testet den mulighed, at kemoterapeutiske midler, der anvendes i behandlingen af ​​coloncancer kan også sensibiliserer kolon CIC til Vγ9Vδ2 T celledrab.

Indledende test af cytotoksicitet afslørede, at i analogi med vores tidligere rapporterede resultater [27], mange kolon CIC linjer var resistente over for den cytotoksiske aktivitet af Vγ9Vδ2 T-celler, men forbehandling med lav, subletal koncentrationer af kemoterapeutiske stoffer 5-FU og DXR sensibiliserer CIC mål til Vγ9Vδ2 T-celle drab, hvilket resulterer i additiv cytotoksicitet aktivitet.

Vγ9Vδ2 T-celler interagerer med og dræbe tumor mål indfoere flere forskellige mekanismer, herunder granulat exocytose, død receptor /ligander interaktioner med TNF, TRAIL og FasL, og TCR- eller NKG2D-medieret anerkendelse af phosphoantigens eller stress-inducerbare molekyler hhv. Alle testede kolon CIC linjer konstitutivt udtrykt mRNA, der koder for HLA-klasse I, ICAM-1, CD155, CD112, MICA /B, ULPBP1-4, Fas (CD95), TNF-R1, DR4 (TRAIL-R1) og DR5 (TRAIL -R2) molekyler på deres overflade, men udtryk for alle disse molekyler ikke gjorde CIC’er følsomme over for Vγ9Vδ2 T-celle drab. Men eksponering af kolon CIC til 5-FU og, om end i et mindre omfang DXR, signifikant forøget DR5 udtryk.

Adskillige tidligere offentliggjorte rapporter i litteraturen har vist, at mange kemoterapeutiske lægemidler, herunder 5-FU og DXR , opregulere DR5 udtryk på tumorcellelinier af særskilte væv oprindelse [36] – [42]. Imidlertid har denne effekt er rapporteret på differentierede kræftceller, mens, at vi ved, er der ingen tegn på lignende DR5 opregulering på CIC. Hvorvidt kemoterapi-induceret DR5 opregulering er begrænset til colon CIC eller er et generelt fænomen observeret på anden CIC’er er faktisk under studiet.

desto mindre fandt vi, at Vγ9Vδ2 T-celler udnyttes forskellige mekanismer til at dræbe CIC mål, som var strengt afhængig af vejen for målet CIC overfølsomhed. Uanset om kemoterapeutiske lægemidler eller zoledronat blev brugt til at bevidstgøre CIC, Vγ9Vδ2 T-celler dræber af disse mål var TCR- eller NKG2D-medieret: i overensstemmelse med vores tidligere rapport [27] kemoterapi-sensibiliseret kolon CIC blev dræbt efter NKG2D-medieret anerkendelse og TRAIL /DR5 interaktion, mens begge mekanismer var undværes til cytotoksicitet zoledronat-sensibiliseret kolon CIC, som næsten udelukkende blev dræbt af TCR-medieret interaktion og perforin /granzym vej.

Tidligere undersøgelser har understreget betydningen af ​​NKG2D -MICA /B-vekselvirkninger for tumorcelle anerkendelse og effektiv cytotoksisk aktivitet efter Vγ9Vδ2 T-celler [35] – [44]. Forskellen mellem NKG2D-medieret anerkendelse af kemoterapi-sensibiliserede kolon CIC og TCR-medieret anerkendelse af zoledronat-sensibiliserede CIC mål kan ikke forklares differentiel ekspression af MICA /B eller ULBPs da hverken 5-FU eller DXR ændret konstitutive ekspressionsniveauer af disse molekyler. Det er sandsynligt, at phosphoantigens produktion /udtryk ved kolon CIC er meget lav, under den tærskel kræves for effektiv anerkendelse af den reaktive Vγ9Vδ2 TCR, dermed målrette anerkendelse kun sker gennem NKG2D: konstateringen af, at kolon CIC bliver følsom over for Vγ9Vδ2 T-celle cytotoksicitet ved udsættelse til zoledronat [27], som forbedrer phosphoantigen ophobning og produktion, understøtter denne mulighed.

Vi konkluderer, at

in vivo

aktivering af Vγ9Vδ2 T-celler eller adoptiv overførsel af

ex vivo

-aktiverede Vγ9Vδ2 T-celler, sammen med eller kort tid efter administration af visse kemoterapeutiske lægemidler kan øge deres antitumorvirkninger. Yderligere kliniske studier er således nødvendige for at vurdere effekten af ​​denne kombinatoriske terapi, herunder eventuelt romanen γδ T-celle-baserede immunterapeutisk tilgang,

ex-vivo

udvidelse af polyklonale γδ T-celler efterfulgt af indførelsen af ​​et CD19-specifikt kimære antigen receptor gøre dem bispecifikke og mere effektiv i drab på CD19

+ tumorcellelinjer

in vitro

i xenografter [45].

Materialer og Metoder

perifert blod og tyktarmskræft prøver

humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) og tyktarmskræft væv blev opnået i overensstemmelse med de etiske standarder for institutionelle udvalg af menneskets eksperimenter fra patienter, der gennemgår et kolon resektion for colon adenocarcinom. Histologisk diagnose blev baseret på mikroskopiske træk ved carcinomceller bestemmer den histologiske type og kvalitet. PBMC blev isoleret fra patienter med tyktarmskræft ved densitetsgradientcentrifugering under anvendelse af Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige) og blev kryokonserveret i 80% RPMI 1640 (Life Technologies, Monza, Italien), 10% DMSO (Sigma, St. Louis, MO) og 10% varme-inaktiveret føtalt kalveserum (FCS, Life Technologies).

Ifølge italienske regler (artikel 13 i lovdekret nr. 196/03), denne undersøgelse ikke kræver tilladelse fra den lokale etisk komité. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsingfors-erklæringen, og alle personer gav skriftligt informeret samtykke til at deltage.

Rensning og Kultur CIC

Kræft væv blev vasket grundigt i saltvand buffer indeholdende antibiotika og inkuberet natten over i DMEM /F12 (Life Technologies) indeholdende penicillin (500 IE /ml), streptomycin (500 ug /ml) og amphotericin B (1,25 ug /ml) (Life Technologies). Enzymatisk fordøjelse blev udført under anvendelse collagenase (Life Technologies, 1,5 mg /ml) og hyaluronidase (Sigma, 20 ug /ml) i DMEM indeholdende antibiotika /antimykotika i 1 time. Indvundne celler blev derefter dyrket i serum-frit medium (DMEM /F12) suppleret med 6 mg /ml glucose, 1 mg /ml NaHCO3, 5 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 4 ug /ml heparin, 4 mg /ml BSA , 10 ng /ml βFGF, 20 ng /ml EGF, 100 ug /ml apotrasferrin, 25 ug /ml insulin, 9,6 ug /ml putrescin, 30 nM natriumselenit vandfrit og 20 nM progesteron (Sigma) til en slutkoncentration på 3 × 10

5 celler /ml. Disse dyrkningsbetingelser vælger for umodne tumorceller, der langsomt formere, der giver anledning, inden for 2-3 måneder, til tumor celle aggregater, kaldet “kugler”. Sphere-dannende celler kan formeres ved enzymatisk dissociation af kugler (3 mM EDTA, 50 nM DTT i PBS) efterfulgt af fornyet udpladning af enkeltceller og resterende små celleaggregater i frisk serum-frit medium [28], [46] , [47].

Tumorigenicitet blev evalueret ved subkutan implantation af enten disaggregerede tyktarmskræft sfære celler eller sfære-afledte differentierede celler [27]. Differentierede coloncancer cellelinier DLD-1, SW620 og SW403 (American Type Culture Collection) blev opnået fra Dr. Ruggero De Maria ( “Regina Elena” National Cancer Institute, Rom, Italien) og blev opretholdt i DMEM indeholdende antibiotika og 10% FCS . Alle cellekulturer blev udført ved 37 ° C i en CO 5%

2 fugtig inkubator.

Anti-tumor befuldmægtigede, Antistoffer og reagenser

kemoterapeutiske midler 5-fluorourcil (5 -FU) og doxorubicin (DXR) blev opnået fra Sigma, gennem apoteket i Universitetshospital. Lægemidler blev fortyndet i DMSO og fortyndet til de ønskede koncentrationer i PBS før anvendelse

Følgende ukonjugerede, FITC-, PE-, PE-Cy5- eller APC-konjugerede monoklonale antistoffer (MAB) blev anvendt:. Anti -TCR Vδ2 (B6, BD Biosciences, San José, CA), anti-NKG2D (1D11, eBioscience, San Diego, CA), anti-CD95L (2C101, Vinci Biochem, Firenze, Italien), anti-MICA /B (6D4 , BD Biosciences)

Derudover blev følgende oprensede mAb’er også anvendt:. anti-CD3 (blokering, MEM-57), anti-HLA klasse I monomorf (MEM-147) fra Prof. Vaclav Horejsi (Institut for Molekylær Genetik, Prag, Tjekkiet), anti-TCR pan γδ (IMMU510, en gave af Dr. Marc Bonneville, Institut de Biologie, Nantes, Frankrig), anti-TNF-α (Infliximab, en gave af Prof. Giovanni Triolo , Dipartimento Biomedico di Medicina Interna e specialistica, Università di Palermo, Palermo, Italien), anti-TRAIL-receptorer TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R3 (LIT, DcR1) og TRAIL-R4 (TRUNDD , DcR2) alle leveret af Dr. Henning Walczak (Tumor Immunology Unit, Division of Medicine, Imperial College, London, UK).

Concanamycin A (CMA) og mevastatin blev købt fra Sigma, mens zoledronat var fra Novartis Pharma, Basel, Schweiz.

Frembringelse af polyklonalt Vγ9Vδ2 T-cellelinier

Polyklonale Vγ9Vδ2 T-cellelinier blev dannet ved først at berige PBMC under anvendelse af en γδ T-celle-isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland), efterfulgt af sortering enkelt Vγ9Vδ2 T-celler gennem en FACSAria (BD Biosciences) med specifikke mAbs. Celler (2 x 10

3) blev derefter dyrket i hver brønd i rundbundede, 96-brønds plader indeholdende 2 × 10

4 bestrålede (40 Gy) allogen PBMC, 2 × 10

3 bestrålede ( 70 Gy) EBV-transformerede allogene B-celler, 0,5 ug /ml PHA (Sigma), og 200 U /ml rekombinant interleukin 2 (Proleukin, Novartis Pharma). Voksende linier blev ekspanderet i 200 U /ml IL-2 og restimuleret hver 2. uge. Normalt blev celler opsamlet efter 4-6 ugers kultur skal bruges til funktionelle assays

in vitro

.

cytotoksisk Assay

Target kolon CIC (10

5 cellsml) blev forbehandlet med 5-FU (2,5-250 pg /ml), DXR (0,025-2,5 gM) eller zoledronat (0,5 uM) i 24, 48 eller 72 timer. Celler blev vasket grundigt i PBS og farvet med CFSE (Merck, Milano, Italien) som følger: 50 pi CFSE blev tilsat til 1 ml target sfære cellesuspension (5 x 10

5 celler /ml) i PBS til opnåelse af den endelige koncentration på 2,5 uM CFSE. Cellerne blev inkuberet i 10 minutter ved 37 ° C og blandet forsigtigt hver 5 min. Ved slutningen af ​​inkubationen blev 1 ml FBS tilsat til cellesuspensionen for at standse farvning reaktionen, og cellerne blev centrifugeret ved 600 g i 5 minutter ved stuetemperatur, vasket to gange med kold PBS og resuspenderet i serum-frit medium.

Vγ9Vδ2 T-cellelinier blev resuspenderet ved slutkoncentrationer på 10

6 og 2,5 × 10

6 celler /ml, blev tilsat til CFSE-farvede target kolon CIC (1 × 10

5 ) og co-kulturer blev opretholdt i 6 timer en 37 ° C i nærvær af 5% CO

2. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev cellerne vasket med PBS og farvet med 20 pi propidiumiodid (PI, Sigma, 1 ug /ml) i 10-15 min i is. Endelig 100 pi kold PBS blev tilsat før købet på en FACSCalibur cytometer (BD Biosciences). Beregningen af ​​cytolytisk aktivitet var baseret på graden af ​​reduktion af levedygtige målceller med evnen til at fastholde CFSE og eksklusive PI (CFSE

høj PI

-), ifølge reference [27]

Blokeringsmidler blev anvendt til at evaluere de mekanismer Vγ9Vδ2 T-cellemedieret cytotoksicitet kolon CIC. At vurdere bidraget af mevalonat metabolitter tumormålceller blev behandlet med mevastatin (25 uM i 2 h) en selektiv opstrøms inhibitor af mevalonat-vejen. Efter denne inkubationsperiode blev målceller vasket og Vγ9Vδ2 T-celler tilsat i nærvær af 25 uM mevastatin, for at opretholde en konstant koncentration af dette stof under inkubation fordi dens virkning er hurtigt reversibel [27]. Til hæmning perforin-medieret cytotoksicitet, blev Vγ9Vδ2 T-celler inkuberet med concanamycin A (CMA, 15 nM) i 30 minutter ved 37 ° C før co-kultur med target CIC, uden yderligere vask [27]. For at blokere de relevante cytotoksiske veje, blev specifikke eller isotype-kontrol-mAb’er anvendt på 10 pg /ml endelig koncentration lige før co-inkubation assay [27].

Real-time kvantitativ RT-PCR