PLoS ONE: YAP Fremmer kræft i æggestokkene Cell tumorigenese og er tegn på en dårlig prognose for kræft i æggestokkene Patients

Abstrakt

YAP er et centralt element i Hippo signalvejen og spiller en afgørende rolle i udviklingen og progressionen af flere typer kræft, herunder kræft i æggestokkene. Men virkningerne af YAP på æggestokkene udvikling kræft

in vivo

og dens nedstrømseffektorer fortsat usikre. I denne undersøgelse fandt vi, at stærke YAP ekspression blev forbundet med dårlig ovariecancer patientoverlevelse. Specifikt viste vi for første gang, at høje YAP ekspressionsniveauer var positivt korreleret med TEAD4 genekspression, og deres co-ekspression var en prognostisk markør for dårlig æggestokkene overlevelse kræft. Hyperaktivering af YAP ved at mutere sine fem hæmmende phosphoryleringssteder (YAP-5SA) steg kræft i æggestokkene celledeling, modstandsdygtighed over for kemoterapeutiske lægemidler, celle migration og forankringsuafhængig vækst. I modsætning hertil udtryk for en dominerende negativ YAP mutant vendt disse fænotyper i æggestokkene cancerceller både

in vitro

in vivo

. Vores resultater foreslog, at YAP forårsagede disse effekter ved at fremme en epitelial-til-mesenkymale overgang. Således YAP fremmer æggestokkene vækst kræftcelle og tumorigenese både

in vitro

in vivo

. Endvidere høj YAP og TEAD4 udtryk er en prognostisk markør for ovariecancer progression og et potentielt mål for kræft i æggestokkene behandling

Henvisning:. Xia Y, Chang T, Wang Y, Liu Y, Li W, Li M, et al. (2014) YAP Fremmer kræft i æggestokkene Cell tumorigenese og er tegn på en dårlig prognose for kræft i æggestokkene patienter. PLoS ONE 9 (3): e91770. doi: 10,1371 /journal.pone.0091770

Redaktør: Hongmei Wang, Institut for Zoologi, kinesiske videnskabsakademi, Kina

Modtaget: 10. januar, 2014 Accepteret: 14 februar 2014; Udgivet: 12 marts 2014

Copyright: © 2014 Xia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81172473), National Basic Research Program Kina (2011CB944504, 2012CB944403), og videnskabelig grundforskning Finansiering af Zhejiang University (2011QN81001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epiteliale ovariecancer (EOCs) omfatter hovedparten af ​​maligne tumorer i æggestokkene hos voksne kvinder og har den værste prognose blandt kvindelige kræftformer baseret på deres 5-års overlevelsesrater. Disse patienter ofte til stede med ikke-specifikke bækken eller abdominale symptomer. Konventionelle behandlinger omfatter sædvanligvis kirurgi, platin og Taxol-baserede kemoterapier, og strålebehandling. På grund af manglen på specifikke symptomer og effektive screeningsmetoder, er patienterne ofte diagnosticeret, når på et fremskredent stadium, og deres prognose er endnu værre end med andre kræftformer.

Hippo vej er en nyligt opdaget signaltransduktionsvej. De centrale dele af Hippo vej, herunder MST1 /2, LATS, Sav1, og YAP, er stærkt konserverede fra frugten flyve (

Drosophila

) til pattedyr [1] – [6]. MST1 /2 aktivering resulterer i phosphorylering og aktivering af deres direkte substrater LATS1 /2. Aktiveret LATS1 /2 på sin side phosphorylere og inhibere YAP og TAZ transkription co-aktivator [7], [8]. YAP fremmer celleproliferation, inhiberer cellulær apoptose, og fremmer også en epidermal-mesenchymal overgang (EMT) [9] – [12]. YAP er tæt forbundet med tumorgenese som et kritisk transskription co-aktivator i Hippo-vejen.

Adskillige transkriptionsfaktorer, herunder ErbB4 RUNX2, TEAD familiemedlemmer, og p73, har vist sig at være YAP nedstrøms målgener [ ,,,0],13] – [16]. Fordi den mangler et DNA-bindende domæne, YAP binder til C-terminale region af TEAD for at regulere nedstrøms gener ‘transkription og translation. Zhao

et al

identificerede TEAD familie transkriptionsfaktorer som den mest potente YAP mål og TEAD familiemedlemmer var vigtige for vækstfremmende funktion af YAP [14], [17] – [21].

Tidligere undersøgelser viste, at YAP blev højt udtrykt i humane ovariecancer væv, og at høj YAP aktivitet fremmes proliferation og overlevelse af dyrkede ovariecancerceller [9], [22]. Men den rolle YAP i æggestokkene udvikling af kræft

in vivo

og sammenslutningen af ​​YAP /TEAD med kræft i æggestokkene patient overlevelse er ikke blevet grundigt undersøgt.

I denne undersøgelse viser vi, at kontinuerlig YAP aktivering inducerer forøget ovariecancer celleproliferation, resistens over for cisplatin-induceret cellulær apoptose, tab af kontaktinhibering, øget cellemigrering, og forankringsuafhængig vækst både

in vitro

in vivo

. I overensstemmelse med disse resultater, vi også fundet, at høj YAP ekspression blev forbundet med dårlig ovariecancer patientoverlevelse. Endvidere blev TEAD familiemedlemmer også til udtryk i kræft i æggestokkene væv. Interessant nok blev YAP udtryk positivt korreleret med TEAD4 udtryk og deres co-ekspression var tæt forbundet med dårlig ovariecancer patient overlevelse. Tilsammen disse resultater viser, at YAP er en vigtig kræft i æggestokkene onkogen og at YAP /TEAD4 co-ekspression kan være en indikator for en dårlig prognose for menneskelig kræft i æggestokkene.

Materialer og metoder

nøgne mus implanteret og

In vivo

behandlinger

nøgne mus blev opnået fra center for forsøgsdyr, Zhejiang University.

mus blev behandlet i overensstemmelse med NIH guide for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, der er godkendt af etiske komité i Zhejiang University. Mus blev opstaldet i en temperatur-kontrolleret rum med ordentlig mørke-lys cyklusser, fodret med en almindelig kost, og holdt under pleje af Laboratory Animal Unit, Zhejiang University, Kina. De ovariecancer celle-transplanterede mus blev examinined dagligt, og blev aflivet med CO2 inhalation metode før bliver ofret. For at undersøge effekten af ​​YAP aktivitet på tumorer

in vivo

, stabile cellelinier, der udtrykte YAP-5SA eller dominant negativ YAP blev dyrket og anvendes til at fremkalde tumorer ved at implantere 2 × 10

6 celler i 100 pi PBS subkutant i den højre abdominale flanker af 4-6 uger gamle nøgne hunmus. For at bestemme om YAP har virkning på kemo-resistens, A2780CP YAP-5SA-ΔC celler og kontrolceller (2 × 10

6 celler per mus i hver gruppe) blev separat inokuleret (s.c.) i nøgne mus. Efter tumorer voksede til ca. 5 mm i diameter, 3,5 mg /kropsvægt (kg) /dag i CDDP blev administreret (i.p.) til nøgne mus en gang om ugen i 4 uger. Tumorstørrelser (både langsgående og tværgående bredder) blev målt med en passer.

Tissue array og IHC analyser

Formalin-fikserede og paraffin-indlejrede æggestokkræft vævsarray blev opnået fra US Biomax, Inc . (Rockville, MD). Vævet microarray blev immunhistokemisk farvet for YAP (# 4912, Cell Signaling), S127 fosforyleret-YAP (# 4911S, Cell Signaling), TEAD1 (5178-1, Epitomics), TEAD2 (LS-C119063, Levetid Biosciences), TEAD3 (LS -C30406, Levetid Biosciences) og TEAD4 (ab97460, Abcam). Desuden 45 humane ovariecancer prøver til patient opfølgning er fra Patologisk Institut, Xijing Hospital i fjerde Military Medical University. Den kræft i æggestokkene eksemplar brug og forsøgsprotokollen blev godkendt af den etiske komité i Xijing Hospital, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient.

Alt det endelige resultat af hver prøve (negativ eller positiv) blev scoret uafhængigt ved to patologer og vurderet ved tilsætning scorerne for intensiteten og omfanget af farvning. Intensiteten af ​​farvningen blev scoret som 0 (negativ), 1 (svag), eller 2 (stærk). Omfanget af farvning blev scoret baseret på procentdelen af ​​positive tumorceller: 0 (negativ), 1 (1% -30%), 2 (30% -60%), og 3 (61% -100%). Hvert tilfælde blev endeligt betragtes som negative, hvis det endelige resultat var 0 (negativ) eller 1 (svag positiv) og positiv, hvis den endelige score var 2 til 3 (+) eller 4 til 5 (stærk positiv).

Cell linjer

Alle cellelinier anvendt i dette studie blev oprindeligt fremskaffet fra ATCC. Alle celledyrkningsmedier var fra Invitrogen. SKOV-3-celler blev dyrket i McCoys 5A-medium med 10% FBS. A2780 celler blev dyrket i DMEM High Glucose-medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin-opløsning. OVCAR3 celler blev dyrket i DMEM-medium med 0,01 mg /ml insulin og 15% FBS. OVCAR8 celler blev dyrket i RPMI 1640 medium med 10% FBS. Alle cellelinier blev dyrket med 10 enheder /ml penicillin og 10 ng /ml streptomycin. Stabile cellelinier blev dyrket i dyrkningsmedium og selekteres under anvendelse af forskellige koncentrationer af puromycin.

Celleproliferationsassay

I hver betingelse ovenfor beskrevne celler blev dyrket i tredobbelte brønde i plader med 96 brønde ved 2000 celler /godt. Cellevækst blev bestemt ved måling af absorbansen med en pladelæser (Bio-Rad) efter dyrkning i 24 timer. Tre uafhængige forsøg blev udført for hver behandling.

Western Blot-analyse

Celleekstrakter indeholdende 30 ug protein blev opløst ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore Corp., Bedford, MA ). Efter sondering med primære antistoffer blev membranerne inkuberet med peberrod peroxidase-bundne anti-kanin-antistoffer (cellesignalering Technologies, Danvers, MA) og derefter vasket. Bundne antistoffer blev visualiseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens Detection Kit (Amersham). De primære antistoffer var: YAP (# 4912), S127 phosphoryleret-YAP (# 4911S), PARP (# 9542), spaltet caspase-3 (# 9664), β-actin (# AC40), E-cadherin (# 3195) , Slug (# 3195), og Snail (# 3895) fra Cell Signaling. A TEAD1 (5178-1) antistof var fra Epitomics. TEAD2 (LS-C119063) og TEAD3 (LS-C30406) antistoffer var fra Levetid Biosciences. En TEAD4 (ab97460) antistof var fra Abcam.

Flad koloni og bløde agar kolonidannende analyser

Celler udpladedes i tre brønde i 6-brønds plader i 14 dage for en flad kolonidannelse assay . For en blød agar assay blev 2000 celler udpladet i komplet medium plus 0,6% agar i tredobbelte brønde i 6-brønds plader. Medium blev udskiftet hver 48 timer og synlige kolonier blev talt ved lysmikroskopi efter 21 dage.

Scratch assay

Celler blev udpladet i 6-brønds plader og dyrket i serum-frit medium til at blokere proliferation . Efter 12 timer blev cellerne ridset under anvendelse af en 200 pi pipettespids. Derefter blev eksemplarer af 10 ridser pr cellelinje opnået ved 0 timer, 12 timer og 24 timer.

Apoptose assay

Celler blev dyrket i medium med forskellige koncentrationer af cisplatin til 48 timer. Derefter blev cellerne høstet med en apoptose detektion kit (BD Biosciences, 559.763) ved flowcytometri og for Western blot-analyse.

In vitro

in vivo

metastatisk model og bioluminescerende billeddannelse

En 24-brønds transwell plade (8 um porestørrelse, Corning, USA) blev anvendt til at bestemme migration og invasive evne af hver cellelinie. For Transwell migration assays, 5 × 10

4-celler blev podet i øverste kammer, der var foret med et ikke-belagt membran. De nedre kamre blev alle sat til 500 ul dyrkningsmedium med 20% FBS. Middelværdierne af tredobbelte analyser for hver forsøgsbetingelse blev bestemt.

I

in vivo

metastase assays blev HO8910 PM-YAP △ C stabile celler inficeret med en lusiferase reporterplasmid og injiceres i caudale venerne i 4 ugers kvindelige null mus. Efter to uger blev dyrene afbildet ugentligt af dyret imaging maskine under anvendelse af en intensiveret ladningskoblet indretning (CCD) kamera system. For

in vivo

bioluminescens billeddannelse, mus blev bedøvet under anvendelse af en 1-2% isofluoran /luftblandingen og injiceret med en enkelt (ip) dosis på 100 mg /kg Luciferin (Promega, WI) og bioluminescens blev påvist med en IVIS 100 Imaging System (Xenogen).

Udover bioluminescens imaging, mus blev henrettet ved 60 dage efter ovariekræft celle-injektion for at undersøge de efter indpodning orgel metastaser.

Statistisk analyse

for de 45 forsøgspersoner med komplette immunhistokemiske og resultatet data, blev sygdomsspecifikke 5-års overlevelse estimeret ved brug af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet mellem grupperne ved hjælp af log-rank test. Korrelation analyse blev afsluttet ved Chi-square test. Students t-test blev anvendt til at sammenligne resultaterne af hvert målt variabel med kontrolresultater. P-værdier for 0,05 blev anset for signifikante. Alle analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (version 11.0).

Resultater

YAP betydeligt opreguleret i humane ovariecancer væv og høj YAP udtryk forudsiger dårlig patient prognose

For at undersøge hvis YAP blev opreguleret i human ovariecancer, blev samlet og phosphoryleret YAP (pYAP) registreres ved immunhistokemi (IHC) og dias blev vurderet på grundlag af cytoplasmatiske og nukleare YAP farvning niveauer. Disse IHC snit blev kategoriseret som havende enten negativ, lav eller høj farvning. Som kontrol blev 10 normale ovariale vævssnit immunhistokemisk farvet med YAP. Imidlertid blev YAP udtryk ikke påvist i disse afsnit (figur 1A)

A:. Immunhistokemi resultater for YAP og pYAP udtryk i normale humane ovarie væv og fire undertyper af kræft i æggestokkene væv. Snit blev modfarvet med hæmatoxylin. Forstørrelser på 40 × og 100 × vises. Scale bar = 100 pM for alle paneler. B: Kaplan-Meier analyse for associationer mellem YAP udtryk, lokalisering og phosphorylering og ovariecancer patient overlevelse. P-værdier er fra log-rank test.

YAP ekspression og subcellulære lokalisering varierede for forskellige tumortyper (figur 1A). nukleare Høje YAP niveauer blev observeret for 22,64% af de 106 æggestokkene tumor analyserede prøver, som omfattede 9 metastatiske kræft i æggestokkene prøver, mens pYAP blev observeret i 11,88% af tumor prøver. Af 24 prøver med stærke YAP IHC-signaler, 13 var også stærkt positiv for pYAP. Blandt de fire vigtigste typer af ovariecancer, blev YAP stærkt udtrykt i serøse og endometrioide cancinoma prøver (86,67%, N = 15).

For at afgøre, om YAP og pYAP distributioner var forbundet med kræft i æggestokkene patient overlevelse, YAP og pYAP lokaliserings- og ekspressionsniveauer blev evalueret i 45 ovariecancer patologiske sektioner. Disse resultater blev anvendt til Kaplan-Meier-analyse at estimere sygdomsspecifikke overlevelse. Både cytoplasmatisk YAP (cYAP) og pYAP alene ikke var forbundet med en dårlig prognose for menneskelig kræft i æggestokkene. Men når de samlede YAP ekspressionsniveauer blev taget i betragtning, disse var signifikant associeret med en dårlig prognose (figur 1B). Disse resultater tydede på, at høj YAP ekspressionsniveauerne snarere end dens subcellulære fordelinger var forbundet med kræft i æggestokkene patient overlevelse.

YAP fremmer ovariecancer celledeling og tumorigenese

Ud over de menneskelige ovariecancer prøver, vi også bestemt endogen YAP udtryk i 11 dyrkede æggestokkene kræft cellelinjer. Western blotting-resultater viste, at YAP blev højt udtrykt i de fleste af disse cellelinjer, med de svageste ekspression i A2780-celler og den højeste ekspression i OVCAR8 celler (figur 2A). Således blev disse to cellelinier anvendes til følgende eksperimenter

A:. Western blotting-resultater for endogen YAP ekspression i 11 ovarian cancer cellelinjer. B: Diagram over de vigtigste funktionelle strukturelle domæner og phosphoryleringssteder i humant YAP (fuld længde og C-terminal slettet, YAP-ΔC, formularer). C: Western blotting resultater for ekspression af FLAG-mærket YAP-5SA og YAP-5SA-ΔC i etablerede stabile cellelinier. D: Vækst kurver for celler, der stabilt udtrykte YAP-5SA (øverste panel) og YAP-5SA-ΔC (nederste panel) og deres kontrol celler i løbet af en 7-dages kultur periode. E: Billeder og kvantitative resultater for flad plade kolonidannelse analyser. Celler, der udtrykte YAP-5SA eller YAP-5SA-ΔC og deres kontrol celler blev dyrket i 6-brønds plader i 2 uger. F: Billeder og kvantitative resultater for kolonier dyrket i blød agar. Celler, der udtrykte YAP-5SA eller YAP-5SA-ΔC og deres kontrol-celler blev podet i blød agar i 3 uger. G: Billeder og kvantitative resultater for xenografter dyrket i nøgne mus. Mus blev subkutant injiceret med YAP-5SA udtrykkende og kontrolceller. Hvert punkt er middelværdien af ​​3 eksperimenter. Fejl- søjler repræsenterer s.d. ‘S; n = 5. Statistisk signifikante forskelle sammenlignet med en kontrolgruppe, som bestemt ved t-test er angivet med * (P 0,05) eller ** (P 0,01)

For at undersøge en rolle. for YAP i ovariecancer celledeling og metastase, genereret vi A2780 og OVCAR8 stabil cellelinjer, overudtrykt konstitutivt aktiv YAP (YAP med fem LATS1 /2 phosphoryleringssite mutationer; YAP-5SA) og dominant negativ YAP (YAP-5SA med en C- terminal transaktiveringsdomæne sletning; YAP-5SA-ΔC; figur 2B-C). Cell vækstkurver viste, at YAP-5SA udtrykkende celler havde større proliferativ aktivitet end kontrollerne (figur 2D, øverste panel). I modsætning hertil YAP-5SA-ΔC udtrykker OVCAR8 celler havde en nedsat proliferation sats i forhold til at styre celler (figur 2D, lavere panel).

Dernæst undersøgte vi, om YAP aktivitet påvirkede celletransformation og migration i æggestokkene cancerceller ved anvendelse af en plade kolonidannelse assayet. Disse resultater viste, at grundlæggende aktiv YAP-5SA forfremmet klon dannelse, men denne dominerende negative YAP-5SA-ΔC undertrykt klon dannelse (figur 2E). Derudover brugte vi en blød agar-assay til bestemmelse forankringsuafhængig vækst, en anden indikator for tumorigenicitet. Som vist i figur 2F, blev YAP aktivitet positivt korreleret med kræft i æggestokkene cellernes kolonidannelse kapacitet i blød agar.

YAP fremmer æggestokkene kræftceller spredning og tumorigenese

in vivo

Tidligere undersøgelser ikke undersøge om YAP kunne øge tumorigenese

in vivo

. Således har vi injiceret subkutant YAP-5SA og YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler, såvel som deres respektive kontrolceller, i 4 uger gamle nøgne mus. Efter 3 uger tumorerne afledt af YAP-5SA stabile celler var signifikant større end kontroller (Figur 2G). Disse resultater var i overensstemmelse med vores

in vitro

analyser.

YAP øger æggestokkene kræftceller modstand mod cisplatin og Taxol

Cisplatin og Taxol er de primære kræftlægemidler anvendes til ovariecancer terapi. Således har vi forsøgt at afgøre, om YAP aktivitet påvirkede æggestokkene kræftcellernes følsomhed for cisplatin og Taxol. Som vist i figur 3A, YAP-5SA udtrykkende celler var mere resistente over for begge disse lægemidler end var kontrolceller i forskellige doser. I modsætning hertil YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler var mere modtagelige for begge lægemidler end var kontrolceller. De apoptotiske cellemarkører spaltet PARP og spaltes caspase 3 blev påvist i A2780 kontrolceller efter cisplatin behandling på en dosis-afhængig måde (0-100 uM). Men den øgede udtryk for disse apoptose markører var mindre markant i tilsvarende behandlet YAP-5SA udtrykkende celler (figur 3B)

A:. Levedygtighed YAP-5SA og YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler efter behandling med Taxol eller CDDP, som vurderet ved MTT-analysen. B: Western blotting-resultater for apoptose markører spaltede caspase 3 og PARP i YAP-5SA udtrykkende og kontrolceller efter behandling med de angivne doser af CDDP i 48 timer. C: Flowcytometri resultater for apoptose af A2780CP celler med eller uden YAP-5SA-ΔC transfektion og efter behandling med forskellige doser af CDDP i 48 timer. D: Western blotting-resultater for spaltet caspase 3 og PARP i YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler og kontrolceller efter behandling med de angivne doser af CDDP i 48 timer. F-G: Billeder og kvantitative resultater for

in vivo

tumorigen kapacitet A2780CP celler med eller uden YAP-5SA-ΔC udtryk. Nøgne mus blev injiceret med CDDP gennem en caudalvenen en gang hver uge i fire uger efter tumorxenotransplantater nået 5 mm i diameter. H: IHC resultater for spredning Ki67 på de indikerede tumor vævssnit. Scale bar = 100 uM.

Flowcytometri Resultaterne viste, at en tidligere rapporteret cisplatin-resistente ovariecancer-cellelinje (A2780CP) var faktisk resistent over for cisplatin behandling ved lave doser (10-40 uM). Imidlertid YAP-5SA-ΔC ekspression i disse celler forårsagede en stigning i cellulær apoptose efter cisplatin behandling ved alle de testede doser (figur 3C-D). Desuden viste YAP-5SA-ΔC udtrykker A2780CP celler bemærkelsesværdigt forøget ekspression af spaltet PARP og caspase 3 end gjorde kontrol celler efter cisplatin behandling (figur 3E).

For at bestemme om YAP tillægges resistens til ovariecancerceller

in vivo

, vi subkutant injiceret nøgne mus med A2780CP celler, der stabilt udtrykte YAP-5SA-ΔC og med kontrol celler. Ved 1 uge efter celle injektioner blev musene behandlet med cisplatin ved caudal forgæves injektion hver tredje dag. Tumorstørrelser blev målt ved 5 uger efter ovariecancercellelinjer injektioner. Sammenlignet med kontroller, tumorer, der blev afledt af YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler var mindre i størrelse i forhold til dem, der stammer fra kontrol celler (Figur 3F-G). Celleproliferation markør Ki67 udtryk var svagere i YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler end i kontrol- celler (Figur 3H).

YAP øger migration og forankringsuafhængig vækst af kræft i æggestokkene celler

Vi Derefter undersøgte virkningerne af YAP aktivitet på ovariecancer cellemigrering. I begge scratch assays (Figur 4A) og transwell assays (figur 4B), YAP-5SA udtrykkende celler migrerede hurtigere, mens YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler migrerede langsommere end kontrol- cellerne.

A. Sårheling assay for migration af YAP-5SA og YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler efter kultur i 12 og 24 timer. Scale bar = 100 pM for alle paneler. B. Transwell analyser for migration af YAP-5SA og YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler. **, P 0,01. C. bioluminescens imaging undersøgelser, som viser lunge metastase af kontrol og YAP-5SA-ΔC udtrykkende HO8910PM celler efter at de blev injiceret i den kaudale vener nøgne mus. D. HE og IHC farvning af lunge metastase sites vist i C. E-F: billeder og analyseresultater statistisk af levermetastaser ved halevenen injiceret HO8910 PM celler. G: HE og YAP IHC resultater af levermetastaser sites vist i EH Western blot resultater for EMT markør udtryk i dyrkede YAP-5SA og YAP-5SA-ΔC udtrykkende celler og

in vivo

xenografter afledt af disse celler

Desuden gjorde vi

in vivo

eksperimenter for at teste, om YAP aktivitet var nødvendig for kræft i æggestokkene metastaser. Vi har etableret YAP-5SA-ΔC- og luciferase-udtrykkende stabile cellelinjer under anvendelse HO8910-PM-celler, en human ovariecancer cellelinie med en høj metastatisk kapacitet, og injiceres disse celler i nøgne mus via deres kaudale venerne (5 x 10

6 celler /mus). Efter to uger efter injektion blev musene afbildet for metastase under anvendelse af et dyr billedbehandlingssystem. Som vist i figur 4C-D, disse xenotransplantater afledt af YAP-5SA-ΔC-udtrykkende celler var mindre end dem, der stammer fra kontrolceller. IHC Resultaterne viste, at xenotransplantater var positive for CA125 og YAP, som bekræftede deres oprindelse fra de injicerede ovariecancerceller. Betydeligt, blev påvist efter indpodning metastaser i lever fra alle 10 mus, som blev injiceret med kontrol HO8910 celler, men kun i 2 af 10 mus injiceret med YAP-5SA-ΔC-udtrykkende celler (Figur 4E). Desuden YAP-5SA-ΔC-udtrykkende celler dannede langt færre metastatiske knuder (YAP-positive) end kontrol celler i lever fra injicerede mus (Figur 4F-G). Disse resultater tydede på, at faldet YAP aktivitet retarderet æggestokkene cancerceller metastaser

in vivo

.

En epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) menes at være en vigtig proces i løbet af erhvervelsen af ​​disse egenskaber kræves for tumormetastase. I begge dyrkede ovariecancerceller og i dem isoleret fra

in vivo

, YAP-5SA fremmet ekspressionen af ​​EMT markør Sneglen og inhiberede ekspressionen af ​​epitel markør E-cadherin. Men YAP-5SA-ΔC havde de modsatte virkninger (Figur 4H).

Høj nukleare YAP og TAED4 niveauer er forbundet med en dårlig menneske kræft i æggestokkene prognose

YAP ikke har en DNA-bindende domæne. Den fungerer som en transskription co-aktivator ved binding med TEAD familie transkriptionsfaktorer (TEAD1-4). Det har imidlertid ikke undersøgt, om TEADs spille nogen rolle i ovariecancer prognose. Således undersøgte vi TEAD1-4 udtryk i humane kræft i æggestokkene prøver. Udtrykkene for de 4 undertyper af TEAD familie proteiner blev undersøgt individuelt i en ovariecancer væv microarray ved IHC (figur 5A). Korrelation Analyseresultaterne viste, at YAP og pYAP positivt blev korreleret med TEAD1-4 ekspression, og var mest tæt korreleret med TEAD4 ekspression (figur 5B) .En association analyse under anvendelse 45 æggestokkene prøver kræftpatient blev udført ved hvilken rangeret vi Kaplan-Meier-estimater overlevelse . Disse resultater viste, at YAP udtryk var positivt korreleret med TEAD4 udtryk (figur 5C, P = 0,0284).

A. IHC-resultater for TEADs udtryk i humane kræft i æggestokkene væv. Scale bar = 100 uM. B. Foreninger mellem YAP /pYAP udtryk og TEAD udtryk i en æggestokkene kræftvæv vifte. C. Foreninger mellem YAP og TEAD4 udtryk i 45 æggestokkene prøver kræft klassificeret efter Kaplan-Meier-overlevelse skøn. D. YAP og TEAD4 co-ekspression er associeret med en dårlig prognose med human ovariecancer. Høj TEAD udtryk versus lav TEAD4 udtryk (til venstre), høj YAP udtryk kombineret med høj TEAD4 udtryk i forhold til andre kategorier (i midten), høj YAP udtryk og høj TEAD4 udtryk kombineret med høj β-catanin versus andre kategorier (til højre).

Vi yderligere undersøgt, hvis TEAD4 alene kan være forbundet med kræft i æggestokkene patient overlevelse. Kaplan-Meier-estimater og sammenligninger af sygdomsspecifikke overlevelse viste, at høj TEAD4 farvningsintensitet var forbundet med dårlig patient overlevelse (figur 5D, venstre panel). Overlevelsen af ​​patienter med både høj YAP og høj TEAD4 udtryk var betydeligt værre end for de øvrige kategorier (Figur 5D, midterste panel; P = 0,002). Derudover Kaplan-Meier estimat for kombineret høj YAP /TEAD4 og EMT markør β-catanin ekspression var også statistisk signifikant (figur 5D, højre panel). Tilsammen disse resultater viste, at YAP og TEAD4 var to væsentlige uafhængige markører for dårlig patient overlevelse og deres kombinerede evaluering kan være en stærk uafhængig prædiktor for sygdomsspecifikke overlevelse for patienter med ovariecancer.

Diskussion

YAP er blevet impliceret som en mulig onkogen med forskellige subcellulære lokaliseringer reguleret af sine upstream gener i Hippo pathway. Øget YAP udtryk og en nuklear lokalisering er blevet observeret i flere humane kræftformer, herunder lever, tyktarm, æggestokke, og lungekræft [23] – [30]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at YAP proteinniveauer var høje i multiple æggestokkene cancercellelinier. Vigtigere, YAP var stærkt udtrykt i ovariecancer prøver, men ikke i normalt ovarievæv, hvilket antydede, at YAP ekspression var direkte relateret til ovarieudvikling cancer eller progression.

Tidligere undersøgelser også foreslået, at YAP kan fungere som et onkogen i ovariecancer [31]. Ingen af ​​disse undersøgelser undersøgt mulige associationer mellem YAP /TEAD ekspressionsniveauer og ovariecancer patientoverlevelse. I denne undersøgelse viste vi, at høj YAP ekspression i ovarietumorer var forbundet med kortere sygdomsspecifik overlevelse for patienter med ovariecancer, og at lav YAP ekspression i ovarietumorer var forbundet med en længere sygdomsspecifik overlevelse for disse patienter. Endvidere fandt vi for første gang, at TEAD4, en direkte bindingspartner Yap, blev også tæt forbundet med patientens overlevelse. Den co-ekspression af YAP og TEAD4 i ovariecancer væv var endnu mere dramatisk forbundet med dårlig patient overlevelse. Således høj YAP /TEAD4 niveauer kunne være en prædiktor for bestemmelse æggestokkene kræft malignitet niveauer og for estimering af prognosen for disse patienter.

Primære epitelial ovariecancer er normalt behandles med platin-baserede lægemidler, såsom cisplatin kombineret med taxol. Disse lægemidler administreres enten intravenøst ​​eller intraperitonealt. Apoptotisk og anti-apoptotiske signaler er de to aspekter af celle krydstale mellem celle overlevelse og celledød veje, der bestemmer skæbner cellerne i deres reaktioner på eksogene omstændigheder. For tumorer, er lægemiddelinduceret apoptose styret ikke blot af opregulering af apoptotiske faktorer eller tumorsuppressorer, men også ved modulering af celle overlevelse faktorer. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at op- og nedregulering af YAP aktivitet kunne modulere proliferation, kolonidannelse og migration kapaciteter, og modstanden over for kemoterapeutiske midler ved æggestokkene cancercellelinier. En konstitutivt aktiv YAP mutant øget resistens over for narkotika-induceret apoptose ved ovariecancerceller, hvorimod dominant negativ YAP restaureret narkotika følsomhed i Cisplatin-resistente æggestokkene cancerceller.

De præcise mekanismer, som YAP forbedrer lægemiddelresistens fortsat uklare . Flere undersøgelser fokuseret på PI3K /Akt vej for kemo-resistens i ovariecancer og viste, at cisplatin kunne opregulere p53 og inducere apoptose i disse cancerceller efter udtryk for dominant negative AKT, der foreslog, at cisplatin-medieret p53 opregulering var modstander af AKT. Den PI3K /AKT-vejen kan også deltage i YAP-medieret resistens stof, som det er blevet tydeligt vist, at YAP var involveret i cross-talk med PI3K veje og lettet AKT aktivering i andre celletyper [32], [33]. Tidligere undersøgelser viste også, at hyperaktivering af PI3K pathway indledt ovariecancer udvikling i musemodeller. Samspillet mellem disse to veje skal undersøges nærmere i æggestokkene cancerceller.

Det er blevet en hypotese, at cancerceller mister deres epitel egenskaber og erhverve visse mesenkymale egenskaber, der fremmer ekstracellulære miljø invasion og fjernmetastaser i en EMT- lignende proces. Epiteliale markører, der er ned-reguleret i denne overgangsperiode omfatter E-cadherin, cytokeratiner, ZO-1 og andre. Hippo signalvejen komponenter er nødvendige for E-cadherin-afhængig kontakt inhibering af proliferation.