Abstrakt
Prostatakræft (PCA) er i øjeblikket den hyppigst diagnosticerede malignitet i de vestlige lande. Det er mere udbredt hos ældre mænd med 75% af de indfaldende tilfælde over 65 år. Efter radikal prostatektomi, ca. 30% af mænd udvikler klinisk tilbagefald med forhøjede serum prostata-specifikt antigen niveauer. Derfor er det vigtigt at optrævle de molekylære mekanismer, der ligger PCa progression at udvikle nye diagnostiske /terapeutiske fremgangsmåder. I denne undersøgelse er det formål at sammenligne microRNA (miRNA) profil tilbagevendende og ikke-tilbagevendende prostata tumorvæv at undersøge mulighederne for inddragelse af miRNA i PCa progression. Total RNA fra 41 tilbagevendende og 41 ikke-tilbagevendende PCA vævsprøver blev brugt til at undersøge miRNA signatur i PCA prøver. Først og fremmest blev 20 tilbagevendende og 20 ikke-tilbagevendende PCA prøver profileret hjælp miRNA microarray chips. Af de differentielt udtrykte miRNA blev miR-1, miR-133b og miR-145 * udvalgt til yderligere validering med QRT-PCR i et andet sæt af 21 tilbagevendende og 21 ikke-tilbagevendende PCA prøver. Data blev statistisk analyseret ved anvendelse tosidet t-test, Pearson Correlation test, Receiver operating characteristic analyse. Vores resultater viste, at miR-1 og mir-133b er blevet betydeligt nedreguleret i tilbagevendende PCa prøver i sammenligning med ikke-tilbagevendende PCA prøver og har tilstrækkelig magt til at skelne tilbagevendende prøver fra ikke-tilbagevendende dem på egen hånd. Her rapporterer vi, at den relative ekspression af miR-1 og mir-133b er blevet væsentligt reduceret i tilbagevendende PCa prøver i sammenligning med ikke-tilbagevendende PCA prøver, der kan tjene som nye biomarkører til forudsigelse af PCa progression.
Henvisning: Karatas AF, Guzel E, Suer I, Ekici ID, Caskurlu T, Creighton CJ, et al. (2014) miR-1 og miR-133b udtrykkes forskelligt hos patienter med tilbagevendende prostatakræft. PLoS ONE 9 (6): e98675. doi: 10,1371 /journal.pone.0098675
Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
Modtaget: Marts 13, 2014 Accepteret: April 30, 2014; Udgivet: 26 jun 2014
Copyright: © 2014 Karatas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Array data er blevet indsat på Gene Expression Omnibus (GEO) under tiltrædelsen nummer GSE55323
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af videnskabelig og teknologisk forskning Råd Tyrkiet (TUBITAK) (tilskud nummer 108S051), samt som delvist af USA ‘National Institute of Health (CJC og MI, tilskud P30 CA125123). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:. CJC er en PLoS ONE Editorial Board medlem og det ændrer ikke forfatternes overholdelse til PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.
Introduktion
Prostatakræft (PCA) er i øjeblikket den hyppigst diagnosticerede malignitet og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt mænd over en alder af 50 år i de vestlige lande [1]. PCa har en tilbøjelighed til at være meget mere udbredt i ældre mænd med 75% af de indfaldende tilfælde over 65 år [2]. Radikal prostatektomi, radikal strålebehandling og hormon ablation terapi er fortrinsvis anvendte teknikker til tidlig-fase klinisk lokaliserede tumorer at helbrede sygdommen, men disse teknikker ikke nødvendigvis sikrer bedre overlevelsesrater [3] og næsten 30% af mændene udvikler klinisk recidiv med forhøjet serum prostata-specifikt antigen (PSA) niveauer [4]. På den anden side, for avancerede og metastatiske tumorer, kemoterapi, som er den eneste mulighed, for det meste ikke træffer positive kliniske resultater [5]. Derfor er det af stor betydning for at forstå de molekylære mekanismer bag prostatakræft progression at udvikle nye diagnostiske og terapeutiske metoder.
MikroRNA’er (miRNA) er endogent syntetiseret, regulatoriske ikke-kodende små RNA består af omkring 20 nukleotider og anses som en ny klasse af gen regulatorer. De undertrykker udtryk for deres mål gennem mRNA nedbrydning eller translationel hæmning som følge af ufuldstændig binding til 3′-utranslaterede regioner (3’UTR) af mRNA’er [6]. MiRNA formodes at regulere ekspressionen af næsten 60% af humane gener [7]. Omkring halvdelen af de kommenterede menneskelige miRNA er placeret i skrøbelige steder i genomet tyder på, at disse små molekyler kan have en vigtig funktion i patogenesen af flere sygdomme, herunder cancer [8], [9]. De har vist sig at være i stand til at skelne differentieringsfaktorer stater af flere maligniteter, herunder bryst-, lunge- og coloncancer. Desuden er der undersøgelser tyder miRNA udtryk profilering kan skelne maligne fra ikke-maligne prostata væv [10], [11]. Der er dog et begrænset antal rapporter i litteraturen studerede miRNA i prostatakræft progression.
miRNA profilering gennem mikroarrays er en uvurderlig teknik til at bestemme en miRNA signatur, som nødvendigvis væsentligt at finde ud af den generelle og specifikke udtryk ændringer mellem forskellige typer af væv [12], [13]. I denne undersøgelse, vi havde til formål at sammenligne miRNA profil tilbagevendende og ikke-tilbagevendende prostata tumorvæv for at kaste lys over en mulig involvering af miRNA i PCa progression.
Materialer og metoder
Patienter
RNA blev isoleret fra 41 tilbagevendende og 41 ikke-tilbagevendende kræft fra radikale prostatektomi, som indeholdt mindst 70% tumorvæv, der blev opnået fra Baylor College of Medicine prostatakræft program. Gentagelse blev defineret som to på hinanden følgende serum PSA’er større end 0,2 ng /ml. Patienterne blev fulgt i indtil PSA recidiv eller mindst 4 år (til ikke-tilbagevendende tilfælde). Denne undersøgelse er blevet godkendt af en intern institutionel gennemgang bestyrelse Baylor College of Medicine. Patienterne blev inkluderet i studiet på at give deres skriftligt informeret samtykke. Kendetegnene for de tilbagevendende og ikke-tilbagevendende patienter er opsummeret i tabel 1.
Total RNA Isolation
Total RNA fra 41 tilbagevendende og 41 vævsprøver ikke-tilbagevendende bruger Trizol (Invitrogen , San Diego, CA) reagens ifølge producentens anvisninger. De renheder og koncentrationer af RNA-prøver blev bestemt spektrofotometrisk under anvendelse NanoDrop ND-2000c (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE). RNA integritet blev testet ved hjælp af gelelektroforese og Spot Check Nucleic Acid Kvantificering Kit (Sigma).
miRNA Microarray og dataanalyse
100 ng total RNA fra 20 tilbagevendende og 20 ikke-tilbagevendende prøver mærket med Cy3 ved hjælp Agilent miRNA mærkningskit efter fabrikantens protokol. Mærkede RNA er varme denatureret og hybridiseret til Agilent 8 × 15 k miRNA microarray V2 består af 799 sonder rettet mod et omfattende udvalg af 723 mennesker og 76 humane virale miRNA med kontrol sonder fra Sanger miRBase (frigive 10.1) ved 55 ° C i 20 timer. Efter hybridisering og post-hybridiserings-vaske blev objektglassene scannet straks i Agilent Microarray Scanner med SureScan High Resolution Technology (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Feature Extraction v10.7.3.1 (Agilent Technologies, CA) software blev anvendt til at udtrække alle funktioner i oplysningerne fra de scannede billeder og BioConductor software blev brugt til at analysere de rå data, som blev normaliseret ved fraktil normalisering. P-værdier (ved tosidet t-test) og fold ændringer mellem sammenligningsgrupper blev beregnet ved hjælp log-transformerede data. Ud af 15714-prober, ville antallet af ægte positive nødt til i høj grad overstige 157 for den forventede False Discovery Rate (FDR), der skal betragtes som lav (under anvendelse af fremgangsmåden af Storey et al. [14]). De nominelt betydelige sonder ikke oversteg chance forventet af flere test, der har nødvendiggjort den yderligere validering af udvalgte miRNA. Array data er blevet indsat på Gene Expression Omnibus (GEO, tiltrædelse nummer GSE55323).
cDNA Synthesis og Quantitative Real-Time PCR
For at validere den differentielle ekspression af miR-1, miR- 133b og miR-145 *, RNA-prøver fra et andet sæt af 21 tilbagevendende og 21 ikke-tilbagevendende patienter blev undersøgt. For miRNA QRT-PCR-forsøg, lige mængder af total RNA (30 ng) fra hver prøve blev anvendt til første streng-DNA (cDNA) syntese under anvendelse af miRNA specifikke primere købt fra Applied Biosystems og “TaqMan MicroRNA revers transkription Kit” ifølge producentens protokol (Applied Biosystems, Foster City, CA). TaqMan HSA-MIR-1 (assay ID: 002.222), -133b (Assay ID: 002.247) og -145 * (Assay ID: 002.149). Amplifikationsprodukter kits blev anskaffet fra Applied Biosystems (Foster City, CA)
mirna ekspressionsanalyse ved kvantitativ RT-PCR blev udført under anvendelse af en Roche LightCycler480-II realtid thermocycler (Roche, Schweiz). TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev anvendt, og microRNA specifikke prober blev anskaffet fra Applied Biosystems (Danmark). Mirna udtryk data blev normaliseret til RNU43. Hvert forsøg blev udført to gange. Den relative kvantificering blev udført ved delta-delta-Ct-metoden som tidligere beskrevet [15].
Statistical Analysis
Statistisk analyse blev udført under anvendelse af to-sidet t-test. En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Pearson Correlation test blev anvendt til at vise korrelationen af miR-1 og miR-133b udtryk i PCA prøver. Receiver opererer karakteristiske (ROC) kurver blev plottet hjælp SPSS 15.0 for at se effekten af PSA og validerede miRNA til at differentiere de tilbagevendende PCA prøver fra ikke-tilbagevendende prøver. For ROC analyse blev logistisk regression udføres, og de forudsagte sandsynligheder blev beregnet for hver enkelt miRNA eller miR-1 og miR-133b sammen. Derefter er området under kurven beregnes med 95% konfidensinterval. Arealet under kurven er accepteret signifikant forskellig fra 0,5 når p-værdien er større end 0,5 betyder, at den logistiske regression klassificerer gruppen signifikant bedre end tilfældigt.
Resultater
I alt 41 tilbagevendende og 41 ikke-tilbagevendende tumorer fra radikale prostatektomi, som blev indhentet fra Baylor College of Medicine prostatakræft program, blev inkluderet i denne undersøgelse at udføre miRNA profilering (tabel 1). Den gennemsnitlige alder på tidspunktet for kirurgi i PSA patienter med recidiv var 62,8 ± 6, mens dem uden recidiv havde en gennemsnitsalder på 61,7 ± 7,2 (ikke signifikant, p = 0,54, Mann Whitney). Mere end 80% af patienterne i begge grupper var ikke latinamerikanske kaukasiere. Gennemsnitlige måneder fra drift til 1
st tilbagefald eller sidste normal evaluering for tilbagevendende og ikke-tilbagevendende PCA patienter var 22,63 ± 3,89 og 76,59 ± 2,87 hhv. PSA niveauer spænder fra 4,2 til 100 og 3,1 til 40.3 i patienter med tilbagefald og ikke-gentagelse, henholdsvis. Som forventet, betyder præoperativ PSA niveau af tilbagevendende patienter var næsten dobbelt så stor som ikke-tilbagevendende patienter (22 vs. 11,3 ng /ml). I tilbagevendende patienter kun 3 prøver var Gleason 6 (3 af 41), mens ikke-tilbagevendende patienter 14 af 41 prøver var Gleason 5 eller 6. Tilsvarende 15 af 40 radikale prostatektomi fra tilbagevendende patienter, for hvilke der var tilgængelige data viste sædblæren invasion, men kun 4 af 41 ikke-tilbagevendende kræft havde denne funktion. Således mens de demografiske træk ved de to grupper er meget ens, de tilbagevendende kræft er meget mere stærkt aggressiv baseret på kliniske og patologiske træk.
For at sammenligne miRNA profiler af tilbagevendende og ikke-tilbagevendende PCA prøver, vi gennemført ud microarray analyse ved hjælp 20 prøver fra hver gruppe. Microarray analyse af 20 tilbagevendende og 20 ikke-tilbagevendende prøver viste, at 93 sonder er differentielt udtrykt med en p-værdi mindre end 0,01. Af de 93 nominelt betydelige sonder rapporteret, er der 84 kortlægning menneskelige miRNA, som er tilvejebragt i tabel S1.
Et zonekort repræsentation af differentielt udtrykte miRNA demonstreres i figur 1A. Blandt de væsentligt liberaliserede miRNA, MIR-1, mir-133b, og MIR-145 * (figur 1B), blev udvalgt til yderligere QRT-PCR bekræftelse i et andet sæt tilbagevendende og ikke-tilbagevendende PCA prøver.
(A) Heat-map repræsentation af væsentlig deregulerede miRNA i tilbagevendende PCa prøver vs. ikke-tilbagevendende PCA prøver. (B) Heat-map repræsentation af miR-1, miR-133b og miR-145 * i tilbagevendende PCa prøver vs. ikke-tilbagevendende PCA prøver.
QRT-PCR resultater viste, at udtrykket niveau af miR-1 var signifikant reduceret i tilbagevendende PCA prøver end for ikke-tilbagevendende PCA vævsprøver (figur 2A, p = 0,036). Nedregulering af mir-133b i tilbagevendende PCa (figur 2B, p = 0,012) blev også bekræftet. Tværtimod, selv om der er et lille fald i ekspressionsniveauet af MIR-145 * i tilbagevendende enheder sammenlignet med ikke-tilbagevendende dem, forskellen var ikke statistisk signifikant (figur 2C, p 0,05). For at vurdere korrelationen mellem miR-1 og miR-133b udtryk i både tilbagevendende og ikke-tilbagevendende PCA prøver, vi udnyttet Pearson korrelationsanalyse, som viste, at miR-1-ekspression var stærkt korreleret med miR-133b udtryk i PCA vævsprøver (figur 3, korrelationskoefficienten (R) = 0.780).
Relativ ekspressionsniveauer af (A) mIR-1, (B) mIR-133b, og (C) mIR-145 * i 20 tilbagevendende PCa eksemplarer sammenlignet med 20 ikke-tilbagevendende PCA prøver. RNU43 blev brugt til normalisering af miRNA udtryk analyser.
For at teste styrken af PSA, miR-1 og miR-133b til at skelne tilbagevendende PCa prøver fra ikke-tilbagevendende prøver, modtager drift kurver (ROC) blev plottet, som viste, at PSA, miR-1 og miR-133b havde areal under kurven (AUC) værdier på 0,950, 0,661 og 0,692 henholdsvis, hvilket viser deres tilstrækkelighed at have magt til at skelne tilbagevendende prøver fra engangsomkostninger dem på egen hånd. Desuden, når miR-1 og miR-133b blev evalueret sammen har de repræsenteret bedre effekt (AUC; 0,719). End det tilfælde, hvor miRNA blev analyseret individuelt (figur 4)
Kurver for individuelle miRNA og deres kooperativ magt at diskriminere to sæt patienter består af 20 tilbagevendende og 20 ikke-tilbagevendende PCA prøver.
diskussion
PCa er en meget heterogen sygdom, hvor de nuværende prognostiske indikatorer for det meste ikke bestemme resultatet og næsten 30% af de PCA patienterne oplever et tilbagefald efter en vellykket radikal prostatektomi eller adjuverende terapi [16], [17]. I øjeblikket er primær tumor stadium, serum PSA-niveau, og biopsi Gleason grad udnyttes under kliniske vurdering at forudsige den patologiske stadium af tumoren og behandling effektivitet, men ingen eller endog en kombination af disse indikatorer er tilstrækkelig til på pålidelig foregribe udfaldet for patienterne [3], [4]. Konsensus kriterier for definitionen af biokemiske gentagelse baseret på PSA niveauer, ikke er blevet veletableret, som forhindrer etableringen af en standard prognostisk model hos mænd behandlet med radikal prostatektomi [18]. Desuden kunne påvisning af PSA i sera fra PCA patienter efter radikal prostatektomi skyldes tilstedeværelsen af resterende godartet prostata væv, som misguides praktiserende læger til at komme med en falsk positiv diagnose [19]. Desuden patienter med lignende serum PSA-niveau, Gleason score og patologisk stadium har vist sig at have forskellige kliniske resultater på grund af heterogenitet af undertyper på molekylært niveau [20], [21].
På grund af den faktum, at der er et presserende behov for nye prognostiske biomarkører til at udvikle mere effektive, optimeret og individualiserede terapi strategier blev flere formodede prognostiske biomarkører foreslået i de seneste år, som har opnået begrænset succes i patient lagdeling [22]. For eksempel blev forskellige gener, som specifikt påvises i prostata, såsom humant KLK2, PCA3, prostata-specifikt membran-antigen og prostata stamcelle antigen foreslået som nyttige prognostiske markører til forudsigelse af patologiske træk i PCA patienter [23]. Ændrede udtryk for Bcl-2 og Bax blev også forbundet med efterfølgende udvikling af biokemisk tilbagefald [18]. Men blandt de foreslåede som prognostisk biomarkør afhængigt storstilet genekspression profilering undersøgelser gener, kun få gener kunne valideres i flere studier [24]. Desuden blev flere klinisk risiko forudsigelse modeller udviklet til at forudsige den biokemiske gentagelse risiko eller klinisk svigt, selv om disse modeller heller ikke pålideligt og præcist estimere det kliniske resultat skyldes heterogenitet af sygdommen [25]. I betragtning af de begrænsninger af de nuværende prognostiske værktøjer og modeller, er det vigtigt at indarbejde nye biomarkører til eksisterende modeller til at overvinde disse begrænsninger under kliniske beslutningsprocesser.
Derfor er det et vigtigt mål i den nuværende prostatakræft forskning at finde ud af effektive prognostiske molekylære biomarkører, der ville hjælpe præcist identificere patienter med aggressiv og metastatisk sygdom for at guide terapeutiske beslutninger og bestemme de patienter, der har behov for tættere opfølgning og intensiv pleje. Endvidere til identifikation af biomarkører, der har potentiale forudsige tilbagefald efter radikal prostatektomi vil være af afgørende klinisk betydning at afgøre, om adjuverende behandling er påkrævet. Sådanne biomarkører ville være særligt uvurderlig for patienter med forskellige resultater, selv om de har lignende kliniske karakteristika.
Den første implikation af miRNA i cancer biologi er blevet beskrevet gennem påvisning af miR-15 og miR-16 nedregulering i B-celle kronisk lymfocytiske leukæmier [26]. Siden da blev forskellige miRNA forbundet med tumor patogenese ved at spille rolle i initiering, progression, og metastase af kræft [27], [28]. Ud over at undersøge forskellen udtryk for miRNA i kræft, er det vigtigt at undersøge miRNA profiler af prøver at finde ud af en sammenslutning af miRNA udtryk med kliniske resultat.
MIR-1 og miR-133b, kodet fra miR -1 /133a og MIR-206 /133b klynger, blev betegnet som muskel-specifikke miRNA [29] og blev rapporteret at være hyppigt nedreguleret i forskellige tumortyper [30]. Desuden har deres ektopisk overekspression blevet påvist at inhibere cellevækst, cellevandring og inducere apoptose i flere typer af cancere [30]. MIR-1 er for nylig blevet foreslået som en prognostisk markør i PCa at forudsige gentagelse [31]. Dens nedregulering kan være involveret i PCa tilbagefald grundige forhøjede niveauer af sine mål. For eksempel overekspression af CXCR4 og SDF-1alpha, som validerede mål for miR-1 [32], var forbundet med lokalt recidiv og fjernmetastaser i PCa [33] og dårlig prognose i fase II pancreas ductus adenocarcinom [34], hhv. Opregulering af NOTCH3, et onkogent MIR-1 mål, er blevet også demonstreret at associere med PCa recidiv [35]. Med hensyn til den rolle, miR-133b i tilbagefald, har det været forbundet med samlet overlevelse og metastase i kolorektal cancer [36] og foreslået som en prognostisk biomarkør for PCa tilbagefald i en meget ny undersøgelse [37]. Forhøjede niveauer af validerede miR-133b mål som CXCR4 [38], FGFR1 [39], FSCN1 [40] er blevet forbundet med prognose af forskellige kræftformer.
Konklusioner
De nuværende teknikker gør ikke nødvendigvis forbedrede overlevelsesrater for PCA patienter og næsten 30% af mændene udvikler klinisk recidiv med forhøjet serum prostata-specifikke antigen-niveauer. Derfor er det af afgørende betydning at optrævle de molekylære mekanismer bag PCa progression at udvikle nye og effektive diagnostiske /terapeutiske redskaber. Her rapporterer vi, at miR-1 og mir-133b er blevet betydeligt nedreguleret i tilbagevendende PCa prøver i sammenligning med ikke-tilbagevendende PCA prøver, der kan tjene som nye biomarkører til forudsigelse af PCa progression.
Støtte Information
tabel S1.
Listen over differentielt udtrykte miRNA i tilbagevendende vs ikke-tilbagevendende prostatacancer prøver
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0098675.s001
(XLS)
Tak
Vi takker Yiqun Zhang til teknisk bistand i microarray analyse.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.