PLoS ONE: Epiteliale-Mesenchymale Transition Stimulerer humane cancerceller til at udvide mikrotubulus-baserede Invasive Fremspring og undertrykker cellevækst i Collagen Gel

Abstrakt

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er en afgørende begivenhed i tumor invasion og metastase. Men de fleste af tidligere EMT undersøgelser er blevet udført i den konventionelle todimensionale (2D) monolagskultur. Derfor er det fortsat uklart, hvad invasive fænotyper er erhvervet af EMT-induceret cancerceller. For at løse dette punkt, vi har forsøgt at karakterisere EMT-celler i mere fysiologiske, tredimensionale (3D) kollagengel kultur. EMT blev induceret ved behandling tre humane carcinoma cellelinier (A549, Panc-1 og MKN-1) med TGF-ß. TGF-ß behandling stimulerede disse celler til at overudtrykke invasion markører laminin γ2 og MT1-MMP i 2D kultur, ud over induktionen af ​​velkendte morfologisk ændring og EMT markør ekspression. EMT induktion forbedret cellemotilitet og klæbeevne til fibronectin og collagen i 2D kultur. Selvom EMT celler viste sammenlignelig cellevækst med kontrolceller i 2D kultur blev deres vækstrater ekstremt undertrykt i blød agar og kollagengel kulturer. Mest karakteristisk, EMT-induceret cancerceller almindeligvis og markant forlænget invasive fremspring i kollagengel. Disse fremspring blev primært støttet af mikrotubuli i stedet aktincytoskelettet. Snail-introduceret viste stabile EMT celler lignende fremspring i 3D forhold uden TGF-ß. Desuden blev disse fremspring undertrykt af colchicin eller inhibitorer af varmechokprotein 90 (HSP-90) og proteinphosphatase 2A. Desværre fik MMP-inhibitorer ikke undertrykke fremspringet formation. Disse data antyder, at EMT forøger tumorcelle infiltrationen i interstitiel stroma ved at udvide mikrotubulus-baserede fremspring og undertrykke cellevækst. Det forhøjede celleadhæsion til fibronectin og kollagen og høj celle motilitet synes også vigtige for tumor invasion

Henvisning:. Oyanagi J, Ogawa T, Sato H, Higashi S, Miyazaki K (2012) Epithelial-Mesenchymale Transition Stimulerer humane cancerceller til at udvide mikrotubulus-baserede Invasiv Fremspring og undertrykker cellevækst i Collagen Gel. PLoS ONE 7 (12): e53209. doi: 10,1371 /journal.pone.0053209

Redaktør: Olivier de Wever, Ghent Universitet, Belgien

Modtaget: August 23, 2012; Accepteret: November 27, 2012; Udgivet: December 31, 2012

Copyright: © 2012 Oyanagi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Aid (23112517 og 23300351) for videnskabelig forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ligesom normale epitelceller, duktalt carcinoma celler

in situ

opretholde celle polaritet, som understøttes af celle-celle-kontakt og celleadhæsion til basalmembranen. Under cancer progression, nogle carcinomaceller mister cellepolaritet og invadere gennem basalmembranen og derefter i bindevæv. Dette fænomen omtales som epithelial-mesenchymal overgang (EMT), og menes at være en afgørende begivenhed for kræft progression [1] – [3]. EMT er kritisk for mange udviklingsmæssige trin, såsom gastrulation og crista neuralis-dannelse, men også for patologiske begivenheder såsom sårheling og vævsfibrose [1], [3], [4]. EMT er generelt karakteriseret ved tabet af epitelial markør E-cadherin, opregulering af mesenchymale markører, såsom N-cadherin og vimentin, og erhvervelse af fibroblastlignende spindel celleform i monolagskulturer [4].

EMT af cancerceller induceres typisk ved TGF-ß [5], men andre vækstfaktorer og microenvironmental faktorer, såsom HGF, EGF og FGF, er også i stand til at inducere eller fremme tilsvarende fænotypiske ændringer afhængig af de celletyper [1] [3], [6]. TGF-ß udøver flere biologiske aktiviteter på udvikling og vækst, differentiering, ekstracellulære matrix produktion og apoptose af normale og cancerceller [7]. TGF-ß er en negativ vækst regulator af normale epitelceller. Henviser TGF-ß undertrykker tumorcellevækst i tidlige stadier af carcinogenese, det fremmer tumorprogression i senere stadier [7]. Det har længe været kendt, at TGF-ß i en kombination med andre faktorer, såsom TGF-α og EGF, fremmer forankringsuafhængig vækst af normale fibroblaster [8]. EMT-inducerende aktivitet af TGF-ß er primært medieret af Smad vej, en større vej af komplekse TGF-ß-signaler, som fremmer ekspression af EMT-relaterede transkriptionsfaktorer herunder Snail, Slug, Twist, og ZEB 1/2 [ ,,,0],6]. Disse transskriptionsfaktorer binder til E-box binding elementer af promotorsekvenser og undertrykke ekspression af E-cadherin på et transkriptionsniveau [9], [10].

EMT i cancerceller forøger ekspressionen af ​​invasion- eller metastase -relaterede gener, såsom matrixmetalloproteinaser (MMP’er). Vores seneste undersøgelse viste, at tumorinvasion markør laminin γ2, samt MMP-9, induceres af EMT induktion af gastriske cancerceller [11]. Andre nylige undersøgelser har antydet, at EMT-inducerede cancerceller har resistens over for anticancerlægemidler og radioaktivitet [12] og har kræft stamcellelignende egenskaber [13]. På trods af et antal af tidligere undersøgelser af EMT af cancerceller, er det imidlertid ikke klart, hvordan EMT bidrager til tumorinvasion og metastase og hvilke invasive fænotyper erhverves af EMT-inducerede cancerceller. Dette er i det mindste delvis som følge af, at de fleste EMT undersøgelser er blevet udført i den konventionelle todimensionale (2D) dyrkningssystem. Det er blevet klart, at celler dyrket i flad 2D kultur betydeligt forskellige fra dem, der dyrkes i tre-dimensionelle (3D) kultur i celle morfologi, proliferation, differentiering, celle-celle interaktion, celle-matrix interaktion og genekspression [14], [15 ]. For at forstå den patologiske konsekvens af EMT af cancerceller, forekommer det vigtigt at karakterisere EMT-inducerede celler i en mere fysiologisk 3D dyrkningssystem. Salg

I denne undersøgelse karakteriserede vi EMT-induceret kræftceller i både 2D monolagskultur og 3D kollagengel kultur, ved hjælp af tre cellelinier. Vi fandt, at EMT-inducerede celler viste fremtrædende forlængelse af mikrotubuli-baserede invasive fremspring og vækst undertrykkelse i 3D kollagen gel kultur.

Resultater

EMT Induktion af tre menneskelige kræftceller

for at undersøge fænotypiske forandringer som følge af EMT af kræftceller, vi brugte modeller af tre menneskelige kræftceller. Vi har tidligere rapporteret, at TGF-ß og TNF-a synergistisk inducerer EMT i serumfrit kultur af MKN-1 humane gastriske cancerceller [11]. Det er blevet rapporteret, at lungeadenocarcinom A549 [17] og pankreatisk cancercellelinie Panc-1 [16] underkastes EMT ved behandling med TGF-ß. I denne undersøgelse har vi først testet tre cytokiner (TGF-ß, TNF-a, og EGF) hvor EMT induktion af A549 og Panc-1-celler, analysere ekspression af nogle tumorinvasion markører samt EMT markører. I begge cellelinier, blev kun TGF-ß kræves for at inducere EMT som bedømt ved den mesenkymale morfologisk ændring (fig. S1), samt reduktion af E-cadherin ekspression og induktion af vimentin (Fig. 1A og B). TGF-ß simuleret også ekspressionen af ​​to tumorinvasion markører, MT1-MMP og laminin γ2-kæden, i begge cellelinier. Men en kombination af TNF-α med TGF-ß yderligere forøget niveauerne af laminin γ2-kæden og MMP-9 i A549-celler (fig. 1A). Laminin γ2-kæden og MT1-MMP blev også induceret af TNF-α og /eller EGF i Panc-1-celler (fig. 1B). Desuden fandt vi, at selv om både TNF-α og TGF-ß var nødvendige for EMT induktion af MKN-1-celler i serumfrit kultur, kun TGF-ß var nødvendigt i nærvær af serum (data ikke vist). Disse resultater viser, at TGF-ß er den mest almindelige og potent inducer af EMT for de tre cancercellelinier, men TNF-α er også påkrævet for effektiv ekspression af nogle invasion markører, afhængigt af celletyper.

A549 (A) og Panc-1 (B) celler blev inkuberet i serumfrit medium med 10 ng /ml EGF, 10 ng /ml TNF-α, 10 ng /ml TGF-ß eller TNF-α + TGF-ß . Efter 48 timers inkubation blev konditionerede medier (CMS) og cellelysater fremstillet og underkastet immunoblotting for EMT markører (E-cadherin og vimentin i cellelysaterne), invasionen markør laminin y2 (CMS), MT1-MMP (cellelysater ), og actin som intern ladningskontrol (cellelysater). De laveste paneler viser gelatinezymografi af MMP-9 og MMP-2 i CMS. Tallene i parentes angiver omtrentlig molekylær størrelse i kDa. Andre eksperimentelle betingelser er beskrevet i Materialer og metoder.

Effekt af EMT induktion på Cell Adhesion og migration i monolagskultur

Som det fremgår ovenfor, TGF-SS effektivt induceret EMT i tre forskellige carcinoma-cellelinier. Dernæst har vi undersøgt hvilke fænotyper blev erhvervet af EMT induktion af kræftceller for deres invasive vækst. Først blev celleadhæsions-aktivitet af A549-celler undersøgt efter EMT induktion, ved hjælp af tre celleadhæsion substrater, laminin-332, fibronektin og type I collagen. Cellerne blev forbehandlet med TGF-ß i 24 timer og derefter podet på disse substrater. Som vist i fig. 2A og 2B, ubehandlede kontrolceller mest effektivt klæbet til laminin-332. TGF-ß behandling faldt kun lidt i celleadhæsion til laminin-332. Derimod er det væsentligt forøgede celleadhæsion effektivitet til stromale substrater fibronectin og type I collagen. Den elektriske time-lapse celleadhæsionsassay viste klart EMT-inducerede ændringer i celleadhæsions-aktivitet af A549-celler til fibronectin og type I collagen (fig. 2C). Disse ændringer blev også observeret i Panc-1 og MKN-1-celler (data ikke vist).

(A og B) En plade seksoghalvfems brønde blev overtrukket med 2 ug /ml laminin-332 (Lm332 ), 5 ug /ml fibronectin (FN), og 2 pg /ml collagen i (Col i) ved 4 ° C natten over, og derefter blokeret med 1,2% BSA i 1 time ved 37 ° C. A549-celler blev inkuberet med 10 ng /ml TGF-ß i serum-frit medium i 24 timer. TGF-ß-behandlede celler (TGF-ß) og ubehandlede celler (kontrol) blev suspenderet og inokuleret på pladen. Efter inkubation i 30 minutter blev fasekontrast billeder taget (A) og celleadhæsions-aktivitet blev målt (B). En skala bar angiver 50 um. Det relative antal af vedhæftede celler blev bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Hver søjle angiver middelværdien ± SD af adhærente celler i tredobbelte brønde. (C) Elektrisk time-lapse celleadhæsionsassay med E-plader. Pladen blev belagt med fibronektin (○, •) og kollagen I (□, ▪) som vist ovenfor, og vedhæftningen af ​​TGF-ß-behandlede celler (TGF-ß: •, ▪) og ubehandlede celler (Kontrol: ○, □) til pladen blev overvåget hver 5 min. Celle indeks angiver vilkårlig enhed reflekterende fastgørelse og spredning af cellerne på mikroelektrode array i bunden af ​​brøndene. Andre eksperimentelle betingelser er beskrevet i Materialer og Metoder.

andet blev cellemigrering aktivitet undersøgt ved anvendelse af to forskellige assays. I

in vitro

sårheling assay TGF-ß fremmes signifikant cellevandring af A549 og Panc-1-celler i fravær af TNF-α under serum-suppleret betingelser (Fig. 3A og B). TNF-α afse yderligere effekt på cellemigration aktivitet (data ikke vist). Når cellemigration blev analyseret ved time-lapse video mikroskopi blev cellen motilitet forstærkes af TGF-ß behandling tydeligere vist med de to cellelinjer (fig. 3C). Vi bekræftede også, at TGF-ß behandling forøgede motilitet MKN-1-celler i sårheling assay (data ikke vist).

(A og B) For at måle cellemigration aktivitet, A549 (venstre paneler) og Panc-1 (højre paneler) celler blev underkastet den

in vitro

sårhelende assay i nærvær eller fravær (kontrol) af TGF-ß, som beskrevet i teksten. Fasekontrast mikrografier af kulturerne blev taget efter 16 timers inkubation. Sorte brudte linjer angiver indledende sårkanterne. Scale bar, 50 um. B) Cellemigrering område blev estimeret ved at analysere pixel med Image J. Hver søjle angiver middelværdien ± SD for de områder i migrerede celler i 3 forskellige områder (højre paneler). (C) Celler, der var blevet forbehandlet med eller uden TGF-ß i 24 timer blev inkuberet i 1% FBS-holdigt medium med eller uden TGF-ß på en plade med 24 brønde i 6 timer ved 37 ° C. migration Cellen blev overvåget med en tid-lapse videosystem i 12 timer. Cellemigration afstand blev målt i 15 tilfældigt udvalgte celler. Hver søjle angiver middelværdien ± SD for cellemigrering hastighed på 15 celler. Andre eksperimentelle betingelser er beskrevet i Materialer og Metoder.

Virkning af EMT Induktion på forankringsafhængige og -uafhængig cellevækst

det tredje cellevækst aktivitet af EMT-inducerede celler blev undersøgt under tre forskellige betingelser. I 2D monolagskultur, havde TGF-ß behandling påvirker ikke væksten af ​​MKN-1-celler og ubetydeligt eller kun svagt undertrykt den for A549 og Panc-1-celler (fig. 4A). Når kolonidannelse blev undersøgt på sparsomme 2D kulturer (500 celler /35 mm skål) af A549 og Panc-1-celler, var der ingen signifikant forskel mellem TGF-ß-behandlede og ikke-behandlede kulturer (data ikke vist). I suspensionskultur på ikke-klæbende plader, de tre cellelinier voksede langsomt danner celleaggregater eller sfæroider på pladerne. Under sådanne betingelser, TGF-ß behandling undertrykkes væksten af ​​MKN-1-celler, men havde ingen virkning på den af ​​A549 og Panc-1-celler (fig. 4B). I modsætning hertil blev kolonien dannelsen af ​​de tre cellelinier i blød agar kultur stærkt undertrykt af TGF-ß behandling. Både antallet af samlede kolonier og samlede koloni området var yderst reduceret i de TGF-ß-behandlede cellelinier end de ikke-behandlede dem (fig. 4C, 4D, og ​​S2). Imidlertid TGF-ß-behandlede Panc-1-celler dannet relativt store kolonier i forhold til de ikke-behandlede celler (fig. S2). Manglen på E-cadherin-medieret celle-celle adhæsion i TGF-ß-behandlede celler kan undertrykke potentialerne i cellulær overlevelse og spredning i forankringsuafhængig tilstand.

(A) MKN-1 (1,0 × 10

4 celler), A549 (0,5 × 10

4 celler) og Panc-1 (1,0 x 10

4 celler) blev inkuberet i hver brønd indeholdt 1% FBS-holdigt medium uden (kontrol) eller med TGF-ß på 24 brønds dyrkningsplader 7 dage i monolagskultur. Efter inkubationen blev antallet af celler målt med en celletæller. Hver søjle angiver middelværdien ± SD af celleantal i tredobbelte brønde. (B) Celler blev dyrket ved en densitet på 1 x 10

4 celler per brønd i 24-brønds suspension dyrkningsplader indeholdende 1% FBS-holdigt medium uden (kontrol) eller med TGF-ß i 7 dage. Det relative antal celler blev målt ved anvendelse Dojindo celletælling kit 8. Hver bjælke angiver middelværdien ± SD af absorbansværdierne ved 485 nm i tredobbelte brønde. (C og D) Celler blev inokuleret med en tæthed på 7.000 celler pr 35 mm skål i 10% FBS-holdigt blød agar medium uden (kontrol) eller med TGF-ß og inkuberet i 10 (MKN-1) eller 14 (A549 og Panc-1) dag. Efter inkubationen blev celler farvet med

s

-iodonitrotetrazolium violet, og antallet af samlede kolonier (C) og samlet koloni område (D) blev bestemt af Image J og vist som det relative antal med kontrollen ( 100%). Hver søjle angiver middelværdien ± SD i tredobbelte brønde. Andre eksperimentelle betingelser er beskrevet i materialer og metoder.

Behavior af EMT-inducerede kræftceller i 3D Collagen Gel Kultur

Genekspression

in vivo

er forskellig fra at i monolagskultur systemet (15). Som et kultursystem, som efterligner

in vivo

betingelser, vi anvendte 3D kollagengel kultur til yderligere at karakterisere de EMT-induceret cancerceller. Cancerceller blev dyrket i kollagengel lag indeholdende TGF-ß og /eller andre faktorer i 7 dage. I 3D kollagengel, viste MKN-1-celler fremtrædende membran udvidelser eller fremspring, når de behandles med TGF-ß (fig. 5A og B). En lignende morfologisk ændring blev observeret i A549 og Panc-1 cellelinjer (fig. S3). Tilsætningen af ​​TNF-α til TGF-ß-holdige kultur fremmes yderligere denne morfologisk ændring kun i tilfælde af MKN-1-celler (fig. 5B). EGF alene, som inducerede EMT i MKN-1-celler, inducerede også fremspringet dannelse i denne cellelinie, men denne virkning blev ikke observeret i A549 og Panc-1-celler. Disse resultater antyder, at den morfologiske forandringer er specifikt for EMT-induktion snarere end TGF-ß stimulation.

(A) MKN-1-celler blev inkuberet i 3D collagen med eller uden angivne cytokiner på 3-brønds kammerobjektglas for 7 dage. Dyrkningsmedium blev skiftet hver 3. dag. Scale bar, 50 um. (B) Efter 5 dages inkubation blev antallet af samlede celleklumper og dem med fremspring talt i et midterste felt under et mikroskop, og procentdelen af ​​fremspring-positive celle klumper blev beregnet. Hver søjle angiver middelværdien ± SD for de relative antal af fremspring-positive celle klumper i tredobbelte brønde. (C) Efter 7 dages inkubation blev cellerne i kollagengel farvet med Dojindo celletælling kit 8 i 4 timer, og absorbansen ved 485 nm af hver dyrkningsmediet blev målt. Hver søjle angiver middelværdien ± SD af absorbansværdierne i tredobbelte brønde. Andre eksperimentelle betingelser er beskrevet i Materialer og Metoder.

Vi undersøgte dernæst, om EMT induktion undertrykt cellevækst inden kollagengel. Som fundet i blød agar kultur, TGF-ß kraftigt undertrykt væksten af ​​alle undersøgte i kollagengel (fig. 5C) cellelinier. EGF aldrig eller kun svagt undertrykt væksten af ​​de tre cellelinjer i 3D kollagengel. TNF-α havde ikke nogen signifikant yderligere effekt i disse kulturer. Disse data viser, at EMT induktion fremmer fremtrædende forlængelse af fremspring men undertrykker cellevækst i 3D kollagengel kulturer af de tre cancercellelinier.

mikrotubulus-baserede Structure of EMT-inducerede Fremspring i 3D Collagen Gel

for at karakterisere EMT-inducerede fremspring, vi analyserede cytoskeletale ændringer efter EMT induktion ved TGF-ß. Filamentøs actin (F-actin) og mikrotubulus cytoskelet af EMT-inducerede celler blev farvet ved fluorescens med rhodamin phalloidine og en tubulin-specifikt antistof, henholdsvis. MKN-1-celler blev stimuleret med TGF-ß i 2D- og 3D-kulturer og derefter farvet for cytoskelet (Fig.6A og B). I 2D kultur af EMT-inducerede celler, robuste stress fibre af F-actin, samt mikrotubuli, støttede den unikke celleform (fig. 6A). I 3D kollagengel blev F-actinfilamenter kraftigt detekteret ved overfladen af ​​klumpformet struktur i ustimulerede celler (Fig. 6B). I TGF-ß-behandlede celler blev perifere actinfilamenter fundet rundt cellelegemet og fremspring, men stress fibre blev sjældent findes i fremspringene. I modsætning hertil blev der mange bundter af mikrotubuli tydeligt detekteret i centrum af fremspringene i EMT-inducerede celler. I kontrolceller, blev mikrotubuli jævnt fordelt i cytoplasmaet. Disse mønstre af cytoskelet var almindeligt forekommende i MKN-1 og Panc-1-celler (data ikke vist).

MKN-1-celler blev inkuberet uden (kontrol) eller med 10 ng /ml TGF-ß i serum- holdigt medium i 2D kultur (A) eller 3D kollagengel kultur (B) i 3 dage. Disse celler var fluorescens-farvet for α-tubulin (grøn) ved anvendelse af et specifikt antistof, F-actin ved rhodamin phalloidin (rød), og DAPI (blå). Fluorescensbilleder blev opnået med et konfokalt fluorescensmikroskop. Andre eksperimentelle betingelser er beskrevet i Materialer og Metoder.

For at undersøge om mikrotubulus er et princip cytoskelet støtter EMT-inducerede fremspring, undersøgte vi virkningen af ​​visse cytoskeletale inhibitorer på EMT-induceret celle forlængelse i collagen gel. Cytochalasin B og colchicin er kendt for at inhibere både polymerisation og stabilisering af F-actin og mikrotubuli, hhv. Når cellerne blev behandlet med disse inhibitorer på samme tid som TGF-ß behandling blev cellen forlængelse delvist inhiberet af 1 uM cytochalasin B, men fuldstændigt ved 10 nM colchicin (fig. 7A). Når disse inhibitorer blev tilsat 24 timer efter TGF-ß stimulering blev fremspringene betydeligt tilbagetrækkes af colchicin efter 3-h behandling, men ikke ved cytochalasin B (fig. 7B). Ligeledes to andre mikrotubuli inhibitorer vinblastin og taxol (paclitaxel) dosisafhængigt blokeret cellen extension når de tilsættes sammen med TGF-ß til 3D kultur (fig. S4). Vi analyserede også effekter af nogle signal inhibitorer på EMT-induceret celle forlængelse i kollagen gel. Den proteinphosphatase 2A (PP2A) inhibitor cantharidin og varmechokprotein-90 (HSP-90) inhibitor radicicol, både som inhiberer stabilisering af mikrotubuli, svagt inhiberede celle udvidelse (fig. 7C). Når både cantharidin og radicicol blev tilsat i kombination blev cellen udvidelse additivt undertrykt. Disse data antyder, at fremspringene af EMT-inducerede kræftceller i 3D kollagengel hovedsagelig understøttes af mikrotubuli, og begge PP2A og HSP-90 aktiviteter er nødvendige for fremspringet formation. Selvom actincytoskelettet kræves til udvidelse af fremspring, forekommer det unødvendigt for opretholdelse fremspringselementerne strukturer.

MKN-1-celler blev inkuberet med 10 ng /ml TGF-ß i serumholdigt medium i 3D kollagen gel kultur som beskrevet i figur 5 og 6. i det kollagen kultur blev tilsat forskellige inhibitorer, og fremspringet-dannelse blev kvantificeret 24 timer senere (A, C og D) eller 3 timer senere (B). (A) De angivne koncentrationer af cytochalasin B og colchicin blev tilsat til dyrkningsmediet på samme tid som TGF-ß tilsætning. (B) Cytochalasin B (5 uM) og colchicin (1 uM) blev tilsat i dyrkningsmediet efter inkubation med TGF-ß i 24 timer. (C) MKN-1-celler blev behandlet uden (kontrol) eller med cantharidin (1 uM) og /eller radicicol (1 uM) som beskrevet i (A). (D) MKN-1-celler blev forbehandlet med 10 pg /ml af hver neutral antistof ved 37 ° C i 30 minutter, og de forbehandlede celler blev indlejret i kollagen gel indeholdende 10 ug /ml af det angivne anti-integrin-antistof og 10 ng /ml TGF-ß. Alle disse inhibitorer var ikke cytotoksisk mindst under de ovennævnte forsøgsbetingelser, som analyseret ved den trypanblåt-farvning. Imidlertid blev tydeligt cytotoksiske virkninger, når cellerne blev inkuberet med 5 uM cytochalasin B eller 1 uM colchicin i 24 timer.

Fremspringene dannet i EMT-inducerede cancerceller inden kollagengel stærkt afveg i udseende fra cellemorfologien i monolagskultur. Dette indebærer, at interaktionen af ​​cellerne med kollagen i 3D-miljø er involveret i fremspringet formation. Denne mulighed blev undersøgt ved anvendelse af anti-integrin, neutrale antistoffer. Som forventet, anti-integrin-α2 og anti-integrin-SS1 antistoffer blokerede effektivt forlængelse af fremspring (fig. 7D). En kombination af de to antistoffer hæmmede mere kraftigt fremspringet formation end hvert antistof. Disse resultater viser, at dannelsen af ​​mikrotubuli-baserede fremspring kræver både EMT-inducerende cytokin og kollagen /integrin signaler.

Forskelle fra andre invasive fremspring.

Det er velkendt, at maligne cancerceller invadere i 3D ekstracellulære matrix ved at udvide nogle former for fremspring eller projektor. Invadopodium er en actin-baseret, typisk fremspring produceret af invasive cancerceller [18]. MT1-MMP menes at være en markør for invadopodia og dets aktivitet er nødvendig for invadopodium formation. For at teste, om de observerede i EMT-induceret cancerceller inde kollagengelen fremspring er identiske med invadopodia undersøgte vi virkningen af ​​et bredt spektrum MMP-inhibitor (TAPI) på fremspringet forlængelse. Da TAPI blev samtidigt tilsat TGF-ß ind i collagen dyrkning blev lidt eller meget svag virkning på fremspringet udvidelse opnået i de tre celle afprøvet (fig. S5, A-C) linjer. Væsentlige opnåedes de samme resultater, når TIMP-2, en naturlig MMP-inhibitor, blev i stedet anvendt af TAPI (data ikke vist).

Fordi Src-kinaseaktivitet også er forbundet med invadopodium dannelse, vi næste undersøgt virkningerne af tre slags Src kinase hæmmere, PP1 analog, SU6656 og lavendustin C, på fremspringet dannelse i 3D kollagen gel. Alle former for inhibitorerne ikke undertrykke fremspringet dannelsen af ​​MKN-1-celler (fig. S5, D). Disse resultater antyder, at EMT-inducerede fremspring er en anden cellestruktur fra invadopodium.

mikrotubulus-baserede Fremspring i Snail-induceret EMT celler indenfor Collagen Gel

Som vist ovenfor TGF-ß- stimulerede cancerceller almindeligvis strækker mikrotubulus-baserede invasive fremspring i 3D kollagengel kultur. Til mere generalisere dette fænomen, vi etableret stabilt EMT-inducerede celler ved at indføre en snegl cDNA ekspressionsvektor i Panc-1 celler (Snail-Panc-l). Ligesom TGF-ß-stimulerede celler, viste snail-Panc-l-celler spredt cellemorfologi i forhold til de tomme vektor-transficerede, kontrolceller (Mock-Panc-1) (fig. 8A). I overensstemmelse med den morfologisk ændring, blev E-cadherin ekspression undertrykkes og vimentin ekspression blev forøget i Snail-Panc-l-celler i sammenligning med kontrolcellerne (fig. 8A). Når disse transfekterede celler blev podet i 3D kollagen gel, Snail-Panc-l, men ikke Mock-Panc-1 celler udvidet mikrotubulus-baserede, robuste fremspring i fravær af TGF-ß (fig. 8B). Udvidelsen af ​​fremspring i Snail-Panc-l-celler blev stærkt inhiberet af colchicin men næppe ved cytochalasin B (fig. 8C og D). Disse data understøtter også, at mikrotubulus-baserede fremspring dannelse afspejler EMT i 3D kollagengel.

Panc-1-celler blev transficeret med en tom vektor (Mock-Panc-1) eller en snegl ekspressionsvektor (Snail-Panc -1), og deres stabile transfektanter blev etableret. Disse celler blev dyrket uden TGF-ß i 2D monolagskultur eller 3D kollagengel kultur. (A) Morfologi af Mock-Panc-1 (øverste felt) og snail-Panc-1 (nedre panel) celler inkuberet i 2 dage i 2D monolagskultur, og ekspression af E-cadherin, vimentin og sneglen i disse celler (højre paneler ). Se figur 1 for forsøgsbetingelser. Scale bar, 50 um. (B) Morfologi af Mock-Panc-1 (øverste felt) og snail-Panc-1 (nedre panel) celler inkuberet i 3D kollagengel kultur i 3 dage, og deres fremspring formation (højre figur). I figur 5 forsøgsbetingelser. Scale bar, 50 um. (C og D) Virkninger af 1 pM cholchicine (C) og 5 uM cytochalasin B (D) på fremspringet dannelse i 3D kollagengel kultur. Disse inhibitorer blev tilsat i dyrkningsmediet efter 24 timers inkubation med TGF-ß. Andre eksperimentelle betingelser er de samme som beskrevet i figur 5 og 7B.

Vi sammenlignede også vækstpotentiale i Anchorage-afhængige og uafhængige forhold mellem Mock-Panc-1 og Snail-Panc-L-celler. Der var ingen signifikant forskel i væksthastighed mellem de to slags celler i monolagskultur (fig. 9A). I blød agar kultur, både total koloni antal og samlet koloni område var klart lavere i Snail-Panc-l-celler end Mock-Panc-1-celler (fig. 9B og C), men store kolonier var mere rigelige i Snail-Panc-l celler end kontrolcellerne (fig. 9D). Cellen spredning i kollagen gel var lidt, men signifikant lavere i Snail-Panc-l celler end kontrol- celler (

s

0,05) (fig 9E.)

(A) monolag. kultur. Mock-Panc-1 (åben søjle) og snail-Panc-1 (lukket spalte) blev podet ved en densitet på 1,0 x 10

4 celler pr brønd i 24-brønds plader i 10% FBS-holdigt medium og inkuberet i 7 dage. Efter inkubationen blev antallet af celler målt med en celletæller. (B-D) Soft agar kultur. Mock-Panc-1 og snail-Panc-1-celler blev dyrket i blød agar medium i 14 dage. Efter inkubationen blev antallet af samlede kolonier (B) og total koloni område (C) analyseret af Image J. De bløde agar kulturer blev fotograferet og hver typisk billede er vist i (D). Scale bar, 500 pm. Andre forsøgsbetingelser var de samme som beskrevet i figur 4. (E) Collagen kultur. Mock-Panc-1 og snail-Panc-1-celler blev dyrket i 3D kollagengel i 7 dage som beskrevet i figur 5. Efter inkubationen blev det relative antal celler målt ved anvendelse Dojindo celletælling kit 8.

Discussion

i denne undersøgelse anvendte vi EMT modeller af tre humane carcinoma cellelinier (A549, Panc-1 og MKN-1) for at karakterisere de EMT-inducerede celler i både 2D og 3D dyrkningssystemer . Efter aftale med andre undersøgelser [16], [17], A549 og Panc-1 celler udviste typiske EMT fænotyper efter behandling med TGF-ß alene 2D monolagskulturer. MKN-1-celler krævede TGF-ß plus TNF-α i serumfrit medium til EMT-induktion som tidligere [11] rapporterede, men kun TGF-ß var påkrævet i serumholdigt medium. Ekspression af de to invasion markører laminin γ2 og MT1-MMP var forbundet med EMT induktion af disse cellelinier. Imidlertid ekspression af MMP-9 og laminin γ2 var meget større med TGF-ß plus TNF-α end TGF-ß alene [11]. Disse resultater tyder på, at erhvervelsen af ​​invasive fænotyper af cancerceller kræver TNF-α og /eller andre faktorer end TGF-ß, selvom TGF-ß alene er nok til den morfologiske EMT induktion.

Den foreliggende undersøgelse afsløret at EMT-induceret A549-celler mere effektivt klæbet til det stromale celle adhæsionssubstrater fibronectin og kollagen type i end ikke-inducerede kontrolceller, selvom celleadhæsion til basalmembranen substrat laminin-332 ikke blev ændret af EMT induktion. Dette stemmer overens med det faktum, at ekspression af stromale ekstracellulære matrixproteiner, såsom fibronectin og type I collagen forstærkes af EMT induktion [16]. Vi bekræftede også den øgede fibronectin produktion i EMT-inducerede celler i 2D kultur (data ikke vist). Det er stærkt forventes, at EMT-induceret ændring af celleadhæsion aktivitet afhænger af den for integrin ekspression. viste desuden, vi, at celle migration potentialer i de tre cellelinier i 2D kultur blev signifikant forhøjet ved EMT induktion efter aftale med resultaterne for Panc-1 celler rapporteret af Horiguchi et al. [17]. Disse fænotypiske ændringer, som er i overensstemmelse med det generelle begreb EMT, synes at være behov for kræftcellen invasion gennem interstitielle stromale væv.

Den foreliggende undersøgelse afslørede store forskelle i fænotyper af EMT-inducerede cancerceller mellem 2D og 3D-kulturer. For det første cellevækst i respons på TGF-ß var helt anderledes mellem de to kultursystemer.