PLoS ONE: Tab af Y-kromosom i perifert blod af kolorektal og prostatakræft Patients

Abstrakt

Baggrund

Selvom aldersrelateret tab af kromosom Y (LOY) i normale hæmatopoietiske celler er en velkendt fænomen, har de fænotypiske konsekvenser af LOY været undvigende. LOY har imidlertid vist sig, i association med rygning, kortere overlevelse og højere risiko for kræft. Det blev foreslået, LOY i blodceller kunne blive en prædiktiv biomarkør for mandlige carcinogenese

Mål, Metoder Resultaterne

For at undersøge sammenhængen af ​​LOY i blodceller med risiko for udvikling af kolorektal (CC) og prostatakræft (PC), har vi analyseret DNA-prøver fra perifert blod af 101 CC mandlige patienter (gennemsnitsalder 60.5 ± 11,9 år), 70 PC patienter (gennemsnitsalder 68,8 ± 8,0 år) og 93 raske kontrolpersoner mænd (gennemsnitsalder 65,8 ± 16,6 år). Metoden omfattede co-forstærkning af homologe sekvenser på kromosom Y og andre kromosomer ved hjælp af multiplex kvantitativ fluorescerende (QF) PCR efterfulgt af automatisk registrering og analyse på ABI 3500 Genetic Analyzer. Den gennemsnitlige Y /X-forholdet var signifikant lavere i hele gruppen af ​​kræftpatienter (0,907 ± 0,12; p = 1.17×10

-9) i sammenligning med kontrollerne (1,015 ± 0,15), samt i CC (0,884 ± 0,15; p = 3.76×10

-9) og pc-patienter (0,941 ± 0,06; p = 0,00012), når de analyseres hver for sig. Multivariat logistisk regressionsanalyse justering for LOY og alder viste, at LOY er en mere væsentlig prædiktor for kræft tilstedeværelse end alder, og at alder formentlig ikke bidrager til det øgede antal forsøgspersoner med påviselig LOY i kræftpatienter kohorte.

konklusion

Som konklusion, vores resultater understøtter seneste resultater af sammenslutning af LOY i blodceller med carcinogenese hos mænd

Henvisning:. Noveski P, Madjunkova S, Sukarova Stefanovska E, Matevska Geshkovska N, Kuzmanovska M, Dimovski A, et al. (2016) Tab af Y-kromosom i perifert blod af kolorektal og prostatakræft patienter. PLoS ONE 11 (1): e0146264. doi: 10,1371 /journal.pone.0146264

Redaktør: Ezio Laconi, University of Cagliari, Italien

Modtaget: 14. september 2015; Accepteret: 15. december 2015; Udgivet: 8. januar 2016

Copyright: © 2016 Noveski et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af projektet 13-3595 /1 fra Ministeriet for Undervisning og Videnskab, Makedonien (til DPK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tab af Y-kromosom (LOY) er et velkendt fænomen, der er forbundet med aldring og observeret med varierende frekvenser i knoglemarvsceller [1,2] eller i perifere blodceller [3,4] fra sunde ældre mænd. Foreningen af ​​LOY med hæmatologiske kræftformer har været undvigende. Imidlertid har LOY blevet rapporteret i leukæmier [5,6,7,8] og hos patienter forudsiges at have dårlig respons på cancerterapi [9]. Andre undersøgelser har vist foreningen kun hos patienter, der viste LOY i mere end 75% [10] eller 100% af de ramte celler [11]. Nylig undersøgelse undersøger LOY i to separate perifere blodlegemer fraktioner fundet signifikant højere frekvens af LOY i CD34 + celler hos patienter med myelodysplastisk syndrom sammenlignet med ældre mænd uden hæmatologiske sygdomme [12]. En undersøgelse, der viser ingen sammenhæng mellem LOY og hæmatologiske kræftformer er også blevet offentliggjort [13].

En sammenslutning af LOY er blevet rapporteret i kræftceller fra urotelial blærekræft [14], pancreascancer [15], esophageal carcinoma [16], hoved og hals carcinoma [17], renalcellecarcinom [18] og i cancercellelinier af hepatocellulært carcinom [19]. Disse undersøgelser har fokuseret på LOY i tumoren selv som en markør for cancer undertype og /eller sygdomsprogression og mulige resultat.

Flere undersøgelser har undersøgt mosaik LOY i perifere blodceller i forhold til forekomst af sygdom. En forening blev fundet med primær biliær cirrose [20], autoimmun thyroiditis [21], men ikke med mandlige brystkræft [22]. Store kohorte SNP-array-baserede undersøgelser fundet en sammenslutning af mosaik LOY i perifere blodceller med øget risiko for kræft, kortere overlevelse og rygning [23,24].

Vi her præsentere vores resultater af en forening undersøgelse af LOY i perifere blodceller i mandlige patienter med kolorektale og prostatakræft.

Materialer og metoder

emner

Vi studerede 101 mandlige patienter med kolorektal cancer (gennemsnitsalder 60,5 ± 11,9 år ), 70 mandlige patienter med prostatakræft (gennemsnitsalder 68,8 ± 8,0 år) og 93 raske mænd fra den almindelige befolkning (gennemsnitsalder 65,8 ± 16,6 år). Kræft forsøgspersoner blev rekrutteret fra Institut of Urology, Medicinske Fakultet, Skopje, Makedonien, og blev henvist til Farmakogenetisk Laboratory, Det Farmaceutiske Fakultet, mens DNA-prøver fra raske kontroller blev opnået fra DNA-bank på RCGEB “Georgi D. Efremov “. Nogle klinisk-patologiske karakteristika af tumorer i kræftpatienter er givet i tabel 1. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i den makedonske Videnskabernes Arts (Godkendelse nr 2010/1), og den etiske komité for Det Naturvidenskabelige Apotek, University Ss Cyril og Methodius (Godkendelse nr 03-95), Skopje, Makedonien,. Alle emner har givet skriftligt informeret samtykke til deltagelse i undersøgelsen ifølge erklæringen fra Helsinki.

DNA isolation

DNA blev isoleret fra fuldblod. Efter lyse blev leukocytterne pelletteret og fordøjet med proteinase K og DNA blev ekstraheret efter standard phenol-chloroform-protokol.

Bestemmelse af mosaik LOY i blod

Tilstedeværelse af LOY blev bestemt med multiplex kvantitativ fluorescens polymerasekædereaktion (QF-PCR) oprindeligt udviklet til detektion af mikrodeletioner i AZF regioner af Y-kromosom og køn kromosom aneuploidier hos patienter med mandlig infertilitet [25,26]. Relativ mængde af Y-kromosom blev vurderet gennem chromosomeY /chromosomeX (Y /X) forholdet mellem fluorescerende signal af co-forstærket korte sekvenser fra Y-X homologt amelogenin gener (

Amely

AMELX

).

AMELX

indeholder en 6 basepar (bp) sletning i intron 1, der mangler i

Amely

, således at co-forstærkede fragmenter er dimensioneret 112 bp fra kromosom Y og 106 bp fra kromosom X og adskilles let og kvantificeres ved kapillarelektroforese (~ 1: 1-forhold mellem 112/106 bp toppe i normale mandlige DNA-prøver og tilstedeværelsen af ​​kun 106 bp peak hos kvindelige DNA-prøver) [27]. Falske positive resultater i tilfælde af tab eller gevinst på kromosom X blev kontrolleret ved opformering af 152 bp fragment af

TAF9B

gen på kromosom X med primere, som også co-forstærker 148 bp homolog sekvens på kromosom 3. Forholdet af peak områder af de to co-forstærkede fragmenter (148/152 bp; kromosom 3 /kromosom X) er ~ 2: 1 i normale mandlige DNA-prøver og ~ 1: 1 i normale kvindelige DNA-prøver

. deletioner eller gentagelser i

Amely

region blev udelukket af to andre primer sæt. Den første forstærker homologe sekvenser af

DAZL

gen på kromosom 3 (to kopier af 217 bp fragment) og

DAZ

gener på kromosom Y (fire kopier af 214 bp fragment). Det andet primersæt forstærker

MYPT2

genet på kromosom 1 (175 bp fragment) og to homologe sekvenser (180 bp fragmenter) fra kromosom Y. Primersekvenser og PCR-betingelser for multiplex QF-PCR var som beskrevet andetsteds [ ,,,0],26]. Co-forstærket fluorescens-mærkede PCR-produkter blev kørt på Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer med LIZ500 som intern standard og analyseret med GeneMapper 4.1 software (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Repræsentative electrophoregrams fra to fag, en med med amelogenin Y /X-forhold på ~ 1 og et med amelogenin Y /X-forhold på 0,28 er vist i fig 1.

Electrophoregrams fra individer med a) normal amelogenin Y /X forhold (omtrent lige store peak områder af X-kromosomet og Y-kromosom-sekvenser) og b) patient med kolorektal cancer og signifikant øget andelen af ​​celler med LOY (amelogenin Y /X-forhold på 0,28).

for at validere QF-PCR-metodik har vi brugt to forskellige DNA-prøver: en normal mandlig prøve (46, XY), og en prøve med Turner syndrom (45, X0) (for at efterligne cellerne med LOY). Begge prøver blev blandet i forskellige forhold til at repræsentere prøver med 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% og 90% LOY. Forud for analysen begge prøver blev justeret til den samme koncentration. Nukleinsyre koncentration og prøve renhed blev bestemt ved NanoVue ™ Plus spektrofotometer (GE Healthcare, Little Chalfont, Storbritannien), mens præcis dobbeltstrenget DNA-koncentrationen blev målt med qubit

® dsDNA HS assay kit på en qubit 2,0 Fluorometer (Thermo Fisher Videnskabelige, Waltham, Massachusetts, USA). Med begge målinger DNA koncentrationer og renhed for begge prøver var identiske.

Reproducerbarheden af ​​Y /X-forhold bestemmelse blev målt ved at gentage QF-PCR-amplifikation og analyse i 11 forsøgspersoner med amelogenin Y /X-forhold under 0,80 . Desuden blev variationskoefficienten af ​​amelogenin Y /X-forholdet beregnet ud fra de gentagne QF-PCR-analyser udført i 14 forsøgspersoner med Y /X forholdet mellem 0,8-1,0 og 12 forsøgspersoner mellem 1,0-1,2. For at eliminere den mulige bias forskellige PCR sæt ups, PCR-reaktioner for en tredjedel af raske kontrolpersoner og to tredjedele af kræftpatienter blev udført samtidig i hver af PCR kører.

Statistisk analyse

Forskelle mellem hjælp af to grupper blev analyseret med Students t-test efter at have vurderet for ligestilling mellem varianser med Levene`s test. Sammenhæng mellem to variable blev analyseret ved anvendelse Pearson korrelationskoefficient (r). Detektionsgrænse blev beregnet på grundlag af standardafvigelsen for respons og hældningen af ​​en regressionslinje [28]. Forskelle mellem hjælp af gentagne målinger blev analyseret med parrede prøver t-test. Multivariat logistisk regression blev anvendt til at modellere sammenslutning af LOY og alder variabler med tilstedeværelse kræft. Niveau af signifikans blev anset når p-værdien var mindre end 0,05. Variationskoefficient fra dobbelte målinger blev beregnet med MedCalc til Windows, version 12.5 (MedCalc Software, Ostend, Belgien) i henhold til deres beskrevne metode. Data-analyser for alle andre statistiske test blev udført ved hjælp af statistiske Package for Social Sciences, Version 19 (SPSS, Chicago, IL, USA).

Resultater

Validering af amelogenin Y /X peak forholdet som en metode til påvisning af mosaik LOY i blodlegemer og testning for reproducerbarhed

Normal 46, XY DNA-prøve og ni blandede DNA-prøver med forskellige andele af 46, XY og 45, blev X0 DNA-prøver forstærkes i tre eksemplarer og tilsvarende amelogenin Y /X-forhold blev opnået for hvert forhold. Korrelation analyse baseret på midlede værdier af tredobbelte målinger viste stærk negativ korrelation (r = -0,999, p = 8.03×10

-13) mellem procentdel af 45, X0 prøve og amelogenin Y /X-forholdet.

detektionsgrænse (LOD) af LOY opgjort til 4,6%, ved hjælp af standardafvigelse og hældningen på regressionslinien af ​​de midlede værdier af tredobbelte målinger (figur 2).

Dots repræsenterer gennemsnit amelogenin Y /X-forhold værdier svarende til 0%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% og 90% af 45, X0 i de blandede DNA-prøver. Regressionslinjernes blev estimeret ved hjælp procentdel af 45, X0 prøve som selvstændig og amelogenin Y /X-forholdet som afhængig variabel. Slope (r) og standardafvigelse (σ) af regressionslinjen blev brugt til at beregne detektionsgrænsen ved brug af formlen LOD = 3.3σ /s [28].

reproducerbarhed amelogenin Y /X-forhold blev vurderet i 37 fag. Den lave variationskoefficient på 4,62% ​​og ingen signifikant forskel i midlerne mellem to målinger (p = 0,1097, parret t-test) bekræfter, at QF-PCR er en pålidelig fremgangsmåde til estimering af amelogenin y /x-forhold.

Mosaik LOY i blodceller er signifikant associeret med cancer tilstedeværelse

Vi har analyseret Y /X-forholdet ved hjælp QF-PCR i 264 DNA-prøver isoleret fra leukocytter fra perifert blod hos patienter med kolorektal cancer (n = 101 ), prostatacancer (n = 70) og raske kontroller (n = 93), matchet for alder. Fordeling af Y /X nøgletal præsenteres som histogrammer i figur 3. Det betyder Y /X-forholdet var signifikant lavere hos kræftpatienter (0,907 ± 0,12; p = 1.17×10

-9) end kontrollerne (1,015 ± 0,15) . Statistisk signifikans blev bevaret, også når gennemsnitlige Y /X forhold mellem kolorektale patienter (0,884 ± 0,15; p = 3.76×10

-9) og prostata cancer patienter (0,941 ± 0,06; p = 1.15×10

-4) blev analyseret separat.

Middelværdier og standardafvigelser er også vist.

Brug multivariable logistisk regression, vi har modelleret procentdel af LOY (udledes amelogenin Y /X-forhold) og alder for at vurdere deres styrke til at forudsige kræft tilstedeværelse. Begge forudsigelsesvariable blev anvendt som kontinuerlige variable mens resultatet var kræft tilstedeværelse og ingen cancer som reference (tabel 2). LOY procentdel forudsiger cancer tilstedeværelse med en betydelig styrke (p = 2.043×10

-9), mens alder viste kun borderline signifikans (p = 0,024). De to prædiktor variabler i modellen tyder på, at stigningen i alder, når der justeres for LOY procentdel ikke øger risikoen for tilstedeværelse af kræft i vores kohorte af kræftpatienter.

Diskussion

En række forskergrupper undersøger ikke-invasive cancer biomarkører for at forbedre tidlig diagnosticering og behandling af kræftpatienter. For nylig, LOY blev foreslået som en mulig biomarkør for forskellige kræftformer hos mænd. Data fra store årgange associeret LOY i perifert blod med risiko for død af alle årsager og ikke-hæmatologisk kræft dødelighed [23]. Der er behov for Bekræftende fald kontrol studier forbinder mosaik LOY i perifere blodceller med øget risiko for kræft.

For at bidrage til afklaring af den rolle, den LOY i perifert blod som en kræft biomarkør hos mænd, har vi udført tilfælde kontrol undersøgelse hos mandlige patienter med to forskellige former for kræft.

den metode vi brugte var baseret på en indirekte bestemmelse af LOY tilstedeværelse ved QF-PCR, måling af forholdet mellem toparealer af fluorescens-mærkede PCR-fragmenter af faste længder repræsenterer homologe sekvenser på Y-kromosomet og nogle andre kromosom. Denne metode til måling af forholdet mellem toparealer er meget udbredt i hurtig prænatal diagnose af fælles kromosom aneuploidier [29]. Det er også anvendes til påvisning af kønskromosomer aneuploidier samt for sletninger og rearrangementer i AZF regioner på Y-kromosom [25]. I modsætning til den cytogenetisk analyse af dyrkede blodlegemer (kun T-lymfocytter), som er tidskrævende og udsat for tekniske artefakter såsom kromosom tab under præparatglaspræpareringsprotokol [3], QF-PCR-metodik udføres på en DNA isoleret fra leukocytter fra helblod , og det er billigt og mere robust. Vi var i stand til at sammenligne resultaterne af amelogenin Y /X-forhold ved hjælp af direkte tælling af celler med cytogenetisk analyse, men vi har godkendt vores metode ved at simulere LOY med brug af 45, X0 DNA-prøve. Den høje korrelation mellem 45, X0 procent og amelogenin Y /X-forholdet bekræfter, at QF-PCR er en pålidelig metode til estimering af Y /X-forhold. Selv om der er rapporter for

Amely

allel dropout som følge af sletningen i denne region af Y-kromosom, den øgede frekvens er primært rapporteret i asiatiske befolkning [30,31,32]. Vi har ikke registreret tab af

Amely

blandt mænd indgår i denne undersøgelse, samt mere end 4000 mænd prøver analyseret i vores laboratorium for tilstedeværelse af de mest almindelige kromosomale aneuploidier, faderskab og mandlig infertilitet (upublicerede data).

I vores undersøgelse, vi omfattede mandlige patienter med prostata- og tarmkræft. Selvom amelogenin Y /X-forholdet ikke giver en præcis værdi af procentdelen af ​​celler med LOY, de gennemsnitlige forhold mellem værdier opnået inden samme forsøgsbetingelser repræsenterer en anslået refleksion for omfanget af LOY for de undersøgte grupper. De gennemsnitlige Y /X-forhold var signifikant lavere i kolorektale patienter end patienter med prostatacancer. Den højere procentdel af patienter med LOY i vores kohorte af kræftpatienter er i overensstemmelse med de seneste resultater viser signifikant øget hyppighed af kønskromosomer monosomier hos patienter med lunge- og blærekræft i forhold til raske kontrolpersoner [33].

Fordi LOY er rapporteret til at være forbundet med alderen, har vi matchet vores kræftpatienter og styre ikke-kræft individer med alder og efterfølgende modelleret alder og LOY procentsats for kræft tilstedeværelse forudsigelser. Resultaterne viste, at øget antal forsøgspersoner med LOY i vores kohorte af cancerpatienter sandsynligvis påvirkes ikke af deres alder.

Den nøjagtige mekanisme, ved hvilken cellerne er ved at miste Y-kromosom ikke er kendt. En foreslået mekanisme er indflydelsen af ​​telomer afkortning under aldring, som fører til rivejern af Y-kromosom, der har kortere telomerer end autosomer [34] ustabilitet og nedbrydning. En anden foreslået mekanisme er relateret til ejendommen af ​​Y kromosomet til at replikere sent i S-fase [21] og dermed forkorte af cellecyklussen (og miste Y-kromosom), kunne give en proliferativ fordel for en sygdom påvirkede organisme. Forskellige veje kan blive aktiveret, hvilket fører til forskellige opformeringsrater og antal hæmatopoietiske celler med LOY i forskellige kræftformer som reaktion på signaler fra cancerceller. Variation i genomet mellem forskellige cancer populationer kan desuden modulere responset af hæmatopoietiske celler til cancercellelinjer signaler. Yderligere bevis for denne foreslåede mekanisme af signal induceret LOY er relateret til det faktum, at rygning har en forbigående og dosisafhængig mutagene effekt på LOY-status [24]. Også denne mekanisme er i overensstemmelse med den foreslåede indflydelse af ændrede væv microenvironmental signalering på somatisk udvikling i en tid-afhængig måde [35]. For nylig blev klonal hæmatopoiese med somatiske mutationer vist ikke kun at være mere og mere almindeligt hos ældre mennesker, men også for at øge risikoen for blodkræftsygdomme og død [36,37], med den mulighed, at dødelighed skyldes en øget risiko for hjertekarsygdomme [36]. Disse undersøgelser analyseres kun enkelte nukleotid varianter og små indels og rapporterer ikke stor aberration som Y-kromosom tab. Også store kromosomafvigelser ( 2Mb) blev af autosomer i DNA fra blod fundet at være hyppigere blandt personer med solide tumorer end i kræft-fri individer [38]. Det ville være interessant at se, om forekomsten af ​​LOY, somatiske mutationer og /eller visse typer af kromosomafvigelser er forbundet og præsentere sammen i samme celler eller celletyper. Hvis sundhed værdiforringelse fremmer samtidig forekomst af forskellige typer af genomiske mutationer, kunne let påviselige mosaik LOY blive en værdifuld biomarkør.

Som konklusion, resultater fra vores case-kontrol undersøgelse viste stærk sammenhæng mellem kræft tilstedeværelse og mosaik LOY i perifert blod fra mænd ramt med colon og prostatakræft er de to mest almindelige faste tumorer hos mænd. De understøtter også de seneste fund af sammenslutning af LOY i blod med carcinogenese hos mænd.