PLoS ONE: Co-ekspression af hendes familiemedlemmer i patienter med Dukes ‘C og D tyktarmskræft og deres virkninger på Patient Prognose og overlevelse

Abstrakte

human epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er en vigtig terapeutisk mål i patienter med metastatisk colorectal cancer og anti-EGFR-antistoffer cetuximab og panitumumab er blevet godkendt til behandling af sådanne patienter. Trods disse fremskridt kan varigheden af ​​respons hos nogle patienter være begrænset. Da EGFR kan danne heterodimerer med de øvrige medlemmer af HER (Human epidermal receptor) familie, er det vigtigt at undersøge co-ekspression og prognostisk betydning af alle medlemmer af sin familie i patienter med tarmkræft. Udtrykket af hendes familiemedlemmer blev bestemt i tumor prøver fra 86 patienter med Dukes ‘C og D (metastatisk) tyktarmskræft hjælp immunhistokemi. Snit blev scoret af procentdelen af ​​positive tumorceller og intensiteten af ​​farvning. Deres foreninger med klinisk-patologiske parametre, og samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse blev vurderet ved hjælp af univariate og multivariate analyse. Samlet set 43%, 77%, 52% og 92% af tilfældene var EGFR, HER-2, HER-3 og HER-4 positive hhv. Interessant, 35%, 24%, 43% og 18% af tilfældene havde co-ekspression af EGFR /HER-2, EGFR /HER-3, EGFR /HER-4 og alle fire medlemmer af HER-familien hhv. Af disse er kun udtryk for EGFR og co-ekspression af EGFR /HER-4 var forbundet med dårligere sygdomsfri overlevelse i både univariate og multivariate analyse. Co-ekspressionen af ​​alle medlemmer af sin familie i tyktarmskræft understøtter behovet for yderligere undersøgelser på deres prædiktiv værdi for respons på behandling med anti-EGFR mAbs og om en sådan sub-population af patienter kan have gavn af behandling med den nye generation af pan -Hendes hæmmere

Henvisning:. Khelwatty SA, Essapen S, Bagwan i, Green M, Seddon AM, Modjtahedi H (2014) co-ekspression af hendes familiemedlemmer til patienter med Dukes ‘C og D tyktarmskræft og deres indvirkning på Patient Prognose og overlevelse. PLoS ONE 9 (3): e91139. doi: 10,1371 /journal.pone.0091139

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: 11. december 2013; Accepteret: 7 februar 2014; Udgivet: 7 marts 2014

Copyright: © 2014 Khelwatty et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af en bevilling fra BRIGHT kræft velgørenhed (UK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er stadig en af ​​de førende årsager til kræftdødsfald i hele verden. I 2013 er tyktarmskræft skønnes at være den fjerde mest almindeligt diagnosticeret kræft (142.820), men den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald (50.830) efter lungekræft i USA [1]. Øjeblikket, af de forskellige stoffer, der er udviklet til målrettet terapi af humane cancere, anti-epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) monoklonale antistoffer (mAb’er), cetuximab og panitumumab, og anti-vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) mAb bevacizumab har været inkorporeret i behandlingsparadigmer for størstedelen af ​​patienter med metastatisk colorectal cancer [2] – [5]. Mens medtagelse af disse midler har forbedret overlevelse af patienter med metastatisk colorectal cancer, kan varigheden af ​​respons være begrænset. Desuden har der ikke været nogen pålidelig prædiktiv markør for respons på disse anti-EGFR målrettede terapier [6] – [10]. Udviklingen og identifikation af sådanne markører ikke blot kunne hjælpe i udvælgelsen af ​​en mere specifik sub-population af kolorektal cancer patienter, der er mere tilbøjelige til at drage fordel af sådanne behandlinger, men de kan også reducere unødvendige behandlinger og dermed de høje omkostninger til sundhedspleje systemet [11].

i de sidste fire årtier, den afvigende ekspression af forskellige medlemmer af hendes familie og deres ligander er blevet rapporteret i en række humane cancere. I nogle undersøgelser, er disse blevet associeret med resistens mod konventionelle former for terapi og en dårligere prognose [6], [12], [13]. Men der er en bred variation i rapporterede udtryk for de hendes familiemedlemmer til patienter kolorektale cancer [6], [14] – [16]. Ud over dannelsen af ​​homodimerer, HER familiemedlemmer såsom EGFR er i stand til at blive aktiveret ved at danne heterodimerer med andre medlemmer af HER-familien [17] – [19]

Mens et begrænset antal. studier har undersøgt ekspressionen og prognostisk betydning af individuelle medlemmer af HER-familien hos patienter med colorectal cancer [20] – [23], men så vidt vi ved, har der ikke været omfattende undersøgelser af co-ekspression og prognostisk betydning af komplette medlemmer af sin familie i kolorektal kræftpatienter til dato [6]. Derfor i denne undersøgelse har vi undersøgt ekspressionsniveauerne for alle medlemmer af HER-familien, individuelt såvel som deres co-ekspression i tumorprøver fra 86 patienter med Dukes ‘C og D tyktarmskræft. Vi undersøgte også enhver sammenhæng mellem forekomsten af ​​de hendes familiemedlemmer og klinisk-patologiske parametre, sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse.

Materialer og metoder

Patientinformation

Etisk godkendelse blev opnået fra Udvalget for Forskning og Udvikling i Royal Surrey County Hospital til undersøgelse af tumor prøver fra patienter med tyktarmskræft til brug i denne retrospektive undersøgelse. Da kun arkiverede tumor prøver blev inkluderet i denne undersøgelse, den etiske komité frafaldes behovet for samtykke og patientjournaler /oplysning blev analyseret anonymt. Firs-seks patienter med Dukes ‘C og D tyktarmskræft, der undergik radikale indgreb på Royal Surrey County Hospital (Guildford, UK) mellem april 2002, og november 2007 blev inkluderet i denne retrospektive undersøgelse. Dem uden opfølgende oplysninger, mis-diagnose, og ufuldstændig histologi blev udelukket. Tilfælde af peri- og postoperativ død blev også udelukket fra dette studie, som var dem med tumorblokke i en tilstand for dårlig til immunhistokemisk brug. Detaljerede klinisk-patologisk oplysninger, herunder patientens alder og køn var til rådighed for hver patient.

Immunhistokemi

formalin paraffinindlejret (FFPE) dele af tumor prøver (3 uM) blev skåret i serielle snit og blev farvet under anvendelse af følgende primære antistoffer muse-anti-EGFR (1:10, Novacastra, UK), muse-anti-HER-2 (1:150, Insight bioteknologi, UK), muse-anti-HER-3 (1:20, Novacastra , UK) og kanin-anti-HER-4 (1:20, Fisher Scientific, UK). Efter antigen hentning blev tumor sektioner inkuberet med primære antistoffer anti EGFR, HER-3 og HER-4 til 60 minutter og HER-2 til 32 minutter. Protokol optimering blev udført ved anvendelse af etablerede hendes positive cancercellelinie pellets, nemlig EGFR overudtrykker humane kolorektal cancer cellelinje Difi, der venligt blev leveret af Dr. Z Fan (MD Anderson Cancer Center, USA), HER-2 overekspression human brystcarcinoma cellelinie SKBR3 (HER-2), HER-3 og HER-4 positive humane brystcarcinoma MCF-7 som beskrevet tidligere [24]. Farvning blev udført på en Venatana Benchmark XT Autostainer med Ultraview DAB kit (Roche, UK). Endelig blev alle dias rehydreret og modfarvet med hæmatoxylin, monteret og dæksel gled.

Scoring System

I den aktuelle litteratur, cut-off-værdier for at lave positiv HER immunfarvning af tumor sektioner er variabel . I denne undersøgelse blev den immunfarvning af tumorsektioner scoret baseret på den procentdel af tumorceller, som havde hendes immunfarvning (dvs. 5%, 10%, og 50%) og intensiteten af ​​immunfarvning (dvs. negativ 0, svagt positive 1+, moderat positiv 2+ og stærkt positiv 3+) og om farvningen var overvejende til stede i membranen, cytoplasmaet eller kernen af ​​cellerne [15]. Af HER immunofarvning, HER-4 havde de højeste niveauer af baggrundsfarvning og derfor immunfarvning over baggrundsniveauet kun blev anset [22]. To uafhængige observatører (herunder en konsulent histopatolog), uden forudgående kendskab til klinisk-patologiske parametre, gennemførte scoring og enhver forskel i scoring blev løst ved samtidig revurdering af farvningen af ​​begge observatører.

Statistisk analyse

Sammenhængen mellem immunhistokemiske scores og patientdata klinisk-patologiske data blev vurderet ved hjælp af Chi-Squared test (Pearson Chi-Square) og Fishers eksakte test. Kaplan-Meier overlevelsesrater parceller blev anvendt til at udføre univariate analyse og forskellene mellem grupperne blev vurderet ved at udføre log rank-test. For multivariat analyse blev Cox multi regressionsmodel anvendes, og p ≤ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af PASW statistik 21 (SPPS Inc.).

Resultater

klinisk-patologisk funktioner

Patient klinisk-patologiske karakteristika er sammenfattet i tabel 1. Den mediane patient follow-up tid var 6 år. Ingen af ​​patienterne havde modtaget strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. Fifty-to patienter fik postoperativ adjuverende kemoterapi, som overvejende var 5-fluorouracil baseret med nogle patienter, der fik oxaliplatin og irinotecan baserede terapier. Et dårligere samlet overlevelse blev observeret hos patienter med Dukes ‘D sammenlignet med Dukes C (3,2 ± 0,6 versus 6,2 ± 0,4 år,

P = 0,005

), og dem med mere end 3 positive lymfeknuder (4,3 ± 0,4 versus 6,7 ± 0,5

P = 0,008

). Ingen signifikant sammenhæng blev fundet mellem patient resultat og de andre klinisk-patologiske parametre (tabel 1).

immunhistokemisk ekspression af hendes familiemedlemmer

Ved cut off værdi på ≥5%, tumor prøver fra 43%, 77%, 52% og 92% af tilfældene var EGFR, HER-2, HER-3 og HER-4 positive (tabel 2). I modsætning til EGFR, som havde overvejende membranøs farvning, det fremherskende placering af HER-2, HER-3 og HER-4 immunfarvning var cytoplasmisk (tabel 2 figur 1). I denne undersøgelse har vi undersøgt co-ekspression af alle medlemmer af HER-familien hos patienter med tyktarmskræft, og resultaterne er præsenteret i tabel 3. Co-ekspression af EGFR med HER-2, HER-3, HER-4, og HER-2 /HER-4 var til stede i 35%, 24%, 43% og 76% af de undersøgte tilfælde (tabel 3). Interessant nok blev 18% af patienterne i denne undersøgelse viste at co-udtrykke alle fire medlemmer af HER-familien (tabel 3 figur 2).

immunfarvning af EGFR 3+, HER-2 3+, HER-3 2+, og HER-4 3+ i formalinfikserede paraffinindlejrede tumor- snit farvet immunhistokemisk, som beskrevet under metoder og patienter sektion. Forstørrelse:. × 200

Co-ekspressionen af ​​EGFR, HER-2, HER-3, og HER-4 i en formalin fast paraffin indlejret tumor snit farvet immunhistokemisk som beskrevet under metoder og patienter sektion. Forstørrelse:. × 200 Vejviser

Den procentdel af hendes positive kolon kræfttilfælde blev også evalueret, da immunfarvning var til stede i mere end 10% og 50% af tumorcellerne (tabel 2). Brug af cut-off værdier på over 10% og 50%, andelen af ​​sager med EGFR-positive tumorer var 30% og 4%, HER-2-positive tumorer were12% og 8%, og HER-3 positive tumorer var 45% og 22 % (tabel 2). Antallet af Her-4 positive tumorer forblev den samme, uanset de afskæringsværdier af procentandelen af ​​positive tumorceller, som havde alle patienter HER-4 immunfarvning i mere end 50% af tumorcellerne i denne undersøgelse (tabel 2) .

Expression og Co-ekspressionen af ​​hendes familiemedlemmer er associeret med klinisk-patologisk Parametre

Sammenhængen mellem klinisk-patologiske karakteristika og udtryk for hendes familiemedlemmer blev bestemt ved Chi-squared test. Alle underkategorier (dvs. procent positive celler, intensitet og placering af immunfarvning), som viste sig at have en statistisk signifikant sammenhæng med klinisk-patologiske parametre er opsummeret i tabel 4.

Når immunfarvning var til stede i større end 5% af tumorcellerne, blev en signifikant forbindelse findes mellem ekspressionen af ​​EGFR og alder (

P = 0,022

), og tumorstedet (

P = 0,022

), med en signifikant højere antal patienter over 70 år med EGFR-positive tumorer i venstre colon (tabel 4). Desuden blev en betydeligt højere antal Dukes ‘C tumorer fundet at udtrykke HER-4 (

P = 0,011

) (tabel 4). Ligesom EGFR, at co-ekspression af EGFR /HER-4 blev også signifikant associeret med patienter over 70 år (

P = 0,031

) og præsenterer tumorer i venstre colon (

P = 0,039

) i denne undersøgelse. Desuden blev et signifikant højere antal tumorer i venstre colon fundet at co-udtrykker EGFR /HER-2 /HER-4 (

P = 0,036

) (tabel 4).

ved afbrød værdi på over 10%, ekspressionen af ​​HER-2 blev forbundet med involvering af mere end 3 positive lymfeknuder (

P = 0,047

) (tabel 4). Desuden et betydeligt højere antal tumorer udtrykker HER-3 (

P = 0,037

), eller co-udtrykker EGFR /HER-3 (

P = 0,035

) eller HER-3 /HER-4 (

P = 0,026

) findes i tumorer pT4 etape i denne undersøgelse (tabel 4). Når analyseret på grundlag af intensiteten af ​​HENDES farvning blev en signifikant sammenhæng fundet mellem HER-4 immunfarvning intensitet på 1+ og 2+ og et større antal af G3 tumorer (tabel 4).

sygdomsfri overlevelse er signifikant associeret med Expression og Co-ekspressionen af ​​hendes familiemedlemmer

Sammenhængen mellem ekspression af individuelle, to, tre eller alle fire medlemmer af sin familie og sygdomsfri overlevelse blev undersøgt ved hjælp af Kaplan-Meier kurver og log rank-test. Sygdomsfri overlevelse viste sig at være markant dårligere hos patienter med EGFR på afskårne værdier af både over 5% (

P = 0,019

) og 50% (

P = 0,005

), membranøs ekspression af EGFR (P = 0,004) og EGFR immunfarvning intensitet på 1+ (

P = 0,041

) (figur 3 tabel 5). Derudover var der en signifikant sammenhæng mellem co-ekspression af EGFR og HER-4 mindst 5% eller over 10% af tumorcellerne og fattigere sygdomsfri overlevelse (

P = 0,019

) (tabel 5 ). Den co-ekspression af HER-2 /HER-3 blev også fundet at være signifikant associeret med dårligere sygdomsfri overlevelse (

P = 0,031

) (tabel 5).

Kaplan-Meier overlevelseskurver viser effekten på sygdomsfri overlevelse af patienter med EGFR (A), membranøs EGFR (B), EGFR 1+ immunfarvning (C) og EGFR /HER-4 co-ekspression (D). En log-rank test værdi på

p ≤ 0,05

blev anset statistisk signifikans.