PLoS ONE: Anti-MUC1 monoklonalt antistof (C595) og Docetaxel markant Reducer Tumor Burden og Ascites, og forlænge overlevelse i en in vivo Kræft i æggestokkene Model

Abstrakt

MUC1 er forbundet med cellulær transformation og tumorigenicitet og betragtes som en vigtig tumor-associeret antigen (TAA) for kræftbehandling. Vi har tidligere rapporteret, at anti-MUC1 monoklonalt antistof C595 (MAb C595) plus docetaxel (DTX) øgede effektivitet af DTX alene og forårsagede dyrkede humane epitelceller ovariecancer (EOC) celler til at undergå apoptose. For yderligere at undersøge mekanismerne for denne kombination-medieret apoptose, undersøgte vi effektiviteten af ​​denne kombinationsterapi

in vivo

i en intraperitoneal (i.p.) EOC musemodel. OVCAR-3 celler blev implanteret intraperitonealt hos kvindelige athymiske nøgne mus og lades vokse tumor og ascites. Mus blev derefter behandlet med enkelt MAb C595, DTX, kombination test (MAb C595 og DTX), kombination kontrol (negativ MAb IgG

3 og DTX) eller vehikelkontrol i.p. i 3 uger. Behandlede mus blev aflivet 4 uger efter behandling. Ascites volumen, tumor vægt, CA125 niveauer fra ascites og overlevelse af dyr blev vurderet. Ekspressionen af ​​MUC1, CD31, Ki-67, TUNEL og apoptotiske proteiner i tumorxenotransplantater blev vurderet ved immunohistokemi. MAb C595 alene hæmmet i.p. tumorvækst og ascites-produktion i en dosisafhængig måde, men ikke åbenbart forhindre tumorudvikling. Men kombineret test reduceret ascites volumen, tumorvækst og metastaser, CA125 niveauer i ascites og forbedret overlevelse behandlede mus sammenlignet med enkelt agent-behandlede mus, kombineret kontrol eller køretøjskontrolsystemer-behandlede mus (

P

0,05). Dataene var i en god aftale med, at der fra dyrkede celler

in vitro

. Mekanismerne bag de observerede virkninger kunne være gennem målrettet MUC1 antigener, hæmning af tumor angiogenese, og induktion af apoptose. Vores resultater tyder på, at denne kombination tilgang effektivt kan reducere tumor byrde og ascites, forlænger overlevelsen af ​​dyr gennem induktion af tumor apoptose og nekrose, og kan give en potentiel behandling for avanceret metastatisk EOC

Henvisning:. Wang L, Chen H, Pourgholami MH, Beretov J, Hao J, Chao H, et al. (2011) Anti-MUC1 monoklonalt antistof (C595) og Docetaxel markant Reducer Tumor Burden og Ascites, og forlænge overlevelse i en

in vivo

Kræft i æggestokkene Model. PLoS ONE 6 (9): e24405. doi: 10,1371 /journal.pone.0024405

Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA

Modtaget: 23. maj 2011; Accepteret: August 9, 2011; Udgivet: 9 September, 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af en international Collaborative Grant fra Henan Health Board, Kina (LW, HMC og HTC), en Cancer Institute NSW Karriereudvikling Fellowship (YL) og St George Hospital æggestokkene Cancer Research Trust Fund (YL og JK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er den mest dødbringende gynækologisk malignitet og den femte mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald blandt kvinder i USA, hvilket resulterer i en anslået 21.880 nye tilfælde og 13,850 dødsfald i 2009 [1 ]. Patienter med fremskreden sygdom har en svarprocent på mere end 80% efter kirurgi og adjuverende kemoterapi med platin-taxan, med en median progressionsfri interval på 18 måneder [2]. Desværre vil kræften igen i de fleste af disse patienter, og den samlede 5-års overlevelse for patienter med fremskreden sygdom er kun 23-30% [3]. Konventionel cancer kemoterapi resulterer ofte i alvorlige bivirkninger relateret til ikke-specifikke virkemåder. Undersøgelser evaluere forskellige cytotoksiske midler i tilbagevendende EOC har fundet responsrater på 10-28% med en ledsagende progressiv stigning i antallet af resistente tumorer [4]. Således er et presserende behov for nye terapeutiske strategier til at forbedre resultatet for denne dødelige sygdom. En lovende fremgangsmåde, der kan forbedre patientens resultat er anvendelsen af ​​monoklonale antistoffer (mAb’er) kombineret med traditionel kemoterapi.

MUC1 er en stor molekylvægt transmembrane glycoprotein, som overudtrykkes i mange carcinomer [5], [6], herunder EOC [7] – [9], og medierer signaltransduktionshændelser der stimulerer motiliteten, invasion og metastase af cancerceller [10]. MUC1 er overudtrykt på 90% af EOC celleoverflader [7], [8]. De forbedrede niveauer af MUC1 udtryk ved kræftceller kan maskere ekstracellulære domæner fra immun overvågning, giver en overlevelse fordel maligne celler og spiller en vigtig rolle i evnen af ​​tumorer til at invadere og metastaserer [11]. Således tumorassocieret MUC1 er en lovende molekylært mål for en hidtil ukendt terapi for EOC patienter.

C595 er et IgG

3, murint MAb rejst mod proteinet kerne af humane MUC1 (urin epiteliale mucin1) [ ,,,0],12]. Epitopkortlægning har vist, at C595 genkender et tetrapeptid motiv (RPAP) i proteinet kerne af MUC1 mucin, der indeholder et stort domæne af multipla af et højt konserveret 20-amino-syre-gentagelsessekvens (PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA) [12], [13]. MAb C595 er blevet mærket med γ-emitterende radioisotop (

111In) for at teste sin kapacitet for kræft lokalisering og identifikation i 19 patienter med en klinisk mistanke om æggestokkene malignitet, og opnåede endelige nøjagtighed på 79% og 64% i forhold til magnetisk resonans billeddannelse og ultralyd i forhold til den endelige tumorhistologi [14]. Efter mærkning med α-emitter (

213Bi),

213Bi-C595 α-konjugat (AC) er blevet anvendt til at målrette enkelt prostata [15], pancreas [16] og ovarieceller [17]

i vitro

og relatere pancreas subkutane xenotransplantater

in vivo

[18]. Disse resultater understøtter den hypotese, at MAb C595 er nyttig, enten alene eller i kombination med andre behandlinger for at forbedre behandlingen af ​​fremskreden EOC.

Selvom paclitaxel anvendes i første-linje-behandling, dets analoge docetaxel (DTX) har fordele, herunder langsommere cellulære efflux og højere opløselighed, der giver mulighed for højere intracellulære koncentrationer [19]. I kliniske forsøg, DTX resulterede i tilsvarende responsrater og har vist aktivitet mod paclitaxel-refraktære karcinomer [20], [21]. DTX har vist betydelig aktivitet i både prækliniske og kliniske studier til behandling af en lang række solide maligniteter inklusive EOC [22] – [25]. Det er sandsynligt, at DTX kan blive en del af den første linje behandling for EOC. DTX kombineret med en platinforbindelse (såsom carboplatin) er blevet den systemisk kemoterapi valg for primær EOC, med høj effektivitet. Men dosisrelateret toksicitet og eventuel udvikling af resistens er store spørgsmål, der kræver opmærksomhed i en gynækologisk onkologi indstilling. I sidste ende de fleste af disse patienter vil dø af metastatisk sygdom. Opretholde lave lægemiddelniveauer i den systemiske cirkulation gennem lokal afgivelse kan følgelig falde toksiske bivirkninger og forøge lokale medikamentkoncentrationer i peritoneum, hvor ovarietumorer og ascites bor. Dette kan opnås ved i.p. administration. The National Cancer Institute har anbefalet, at i.p. kemoterapi overvejes til behandling af fremskreden ovariecancer [26]. Kombinationsbehandling specifikt beskæftiger strategier såsom et kemoterapeutisk middel plus et antistof via i.p. administration kan effektivt reducere dosisbegrænsende toksicitet og forbedre behandlingen effektivitet

I en nylig undersøgelse, viste vi, at MAb C595 alene kunne dræbe EOC-celler i en dosisafhængig måde.; dette drab var også afhængig af MUC1 ekspressionsniveauer. Lavdosis MAb C595 kombineret med DTX øget EOC følsomhed overfor kemoterapi lægemiddel og reducerede den nødvendige dosis [27]. I denne undersøgelse har vi den hypotese, at denne kombination behandling effektivt kan arbejde i en

in vivo

EOC dyremodel. Vi fandt, at MAb C595 kunne inhibere i.p. tumorvækst og ascites produktion i OVCAR-3 muse xenograftmodel og forbedre den terapeutiske effektivitet af DTX i en koncentrationsafhængig måde, og at efter i.p. injektion, kan denne kombination behandling (test) (MAS C595 og DTX) markant reducere tumor byrde og ascites og dermed forlænge overlevelsen af ​​behandlede dyr. Vores resultater tyder på, at denne ny kombination lover som en potentiel terapi til behandling af fremskreden metastatisk EOC.

Materialer og metoder

Drug

DTX blev købt fra Sigma-Aldrich , Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australien. Lægemidlet blev først fortyndet i [hydroperoxymethyl cellulose (HPMC) fremstillet som 0,5% i PBS] og opbevaret ved 4 ° C til anvendelse.

Antistoffer

MAb C595 blev venligst leveret af Nottingham University ( Nottingham, UK). Muse-anti-humant IgG

3 isotypekontrol MAb blev indkøbt fra Zymed Laboratories Inc (South San Francisco, CA, USA). Kanin-anti-humant Ki-67, caspase-3 (aktiv), og PARP-1 (spaltet p85) MAb’er blev tilvejebragt af Epitomics (Burlingame, CA, USA). Rotte-anti-muse CD31 MAb blev indkøbt fra BD Pharmingen (Bedford, MA, USA). Svine-anti-ged, -mouse, -rabbit IgG /biotinyleret kanin anti-rotte IgG /biotinyleret, streptavidin /peberrodsperoxidase (HRP) og muse-IgG

1 negativ kontrol MAb blev indkøbt fra Dakopatts (Glostrup, Danmark).

Cell linje og dyremodel

For alle eksperimenter, 6~8 uger gammel kvinde nøgen athymiske BALB /c nu /nu mus (Animal Resources Centre, Perth, Western Australia) blev anvendt. Musene blev opstaldet og vedligeholdes i laminare flow kabinetter under specifikke patogenfrie forhold i anlæg, der er godkendt af University of New South Wales (UNSW) Animal Care og etiske komité (ACEC). Denne undersøgelse blev godkendt af ACEC, UNSW (ID: 08 /110A). Dyrene blev holdt i mindst 1 uge før forsøgets udførelse.

Den primære OVCAR-3 EOC cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), og sub-linje af OVCAR-3 blev udvalgt og med succes etableret i en ip xenograft model ved hjælp nøgne mus i vores laboratorium [28]. Dette valg kan øge tumorgenicitet af OVCAR-3 celler

in vivo

. Kort fortalt levedygtig OVCAR-3 celler (5 x 10

6/500 gl i DPBS) blev injiceret intraperitonealt anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 26-gauge nål og fik lov til at vokse. Tumor progression blev dokumenteret gang ugentlig i 10 uger ved målinger af abdominal omkreds for abdominal stigning med en blød lineal. Ved aflivning blev tumorer fjernet for vægtning og fortsætter til histologisk test

Behandling protokoller

Toksicitet studier i nøgne mus uden tumorer:. Toxicity undersøgelser blev udført for at bestemme den maksimale tolerance dosis (MTD) i mus for enkelt MAb C595, muse IgG

3 negativ kontrol MAb, DTX, kombination test (MAb C595 og DTX) og kombinationen kontrol (negativ MAb IgG

3 og DTX). Dosis-tolerance forhold blev undersøgt i nøgne mus (uden tumorer) i en enkelt i.p. administration af MAb C595, DTX og kombinationsbehandling (test) sammenlignet med kombinationen kontrol behandling. Grupper på fem mus modtog i alt injiceret koncentration på 1, 5, 10, 15, 20 mg /kg af MAb C595 eller 3, 5, 7, 10, 15 mg /kg af DTX samt kombineret MAb C595 (1 /3 af MTD dvs. 5 mg /kg) eller 5 mg /kg MAb IgG

3 med 3, 5, 7, 10 mg /kg af DTX i 3 uger. De valgte doser af MAb’er var baseret på MTD enkelt MAb C595 og DTX. Mus vægte blev sammenlignet med dem på dag 0 (første behandlingsdag administration) at bestemme procentvise vægtændring. Toksicitet den dosisbegrænsende blev defineret som slutpunkter: 15% tab af kropsvægt eller nødstedte adfærd (dvs. tab af appetit og aktivitet, krum stilling). MTD blev defineret som den højeste dosis, hvor en tredjedel af kohorten nåede dosisbegrænsende toksicitet slutpunkter [29]. Efter 10 uger blev sunde mus aflivet. De følgende forsøg var baseret på MTD fra toksicitetsundersøgelserne

Virkningsfuldhedsundersøgelser i OVCAR-3 EOC dyremodel:. Efter udvikling af ascites, blev den peritoneale kavitet vasket med 2 ml sterilt normalt saltvand. De peritoneale Indholdet blev blandet ved at styre forsigtigt og derefter fuldstændig aspireret [28]. Mus blev derefter fordelt vilkårligt i enten MAb C595 eller DTX alene enkelt behandlingsgruppe eller kombinationen test (MAb C595 og DTX) og kombinationen kontrol (MAb IgG

3 og DTX) gruppe (n = 10 pr gruppe). Forskellige behandlinger blev initieret umiddelbart efter opsugning af ascitesvæsken.

a). For enkelt MAb C595 behandling, lav dosis (LD) (5 mg /kg) eller høj dosis (HD) (15 mg /kg) MAb suspenderet i 1 ml saltopløsning, og det samme volumen saltvand med 15 mg /kg mus MAb IgG

3 (kontrol) blev indgivet en gang /uge i 3 uger.

b). For enkelt DTX behandling, LD (5 mg /kg) eller HD (10 mg /kg) DTX suspenderet i 1 ml HPMC (fremstillet som 0,5% i PBS) som et køretøj, og det samme volumen af ​​HPMC som en kontrol.

c). For kombinationen test (MAS C595 og DTX) og kombinationen kontrol (Mab IgG

3 og DTX) grupper blev følgende anvendt. Kombination test omfattede en enkelt dosis af MAb C595 (1/3 dosis af MTD, dvs. 5 mg /kg suspenderet i 0,5 ml saltvand) kombineret med en enkelt dosis af DTX (10 mg /kg DTX suspenderet i 0,5 ml HPMC). Kombination kontrol omfattede en enkelt dosis af MAb IgG

3 (5 mg /kg suspenderet i 0,5 ml saltvand) kombineret med en enkelt dosis af DTX (10 mg /kg DTX suspenderet i 0,5 ml HPMC). Kombinationen behandling (test og kontrol) blev administreret sekventielt fra MAb C595 eller MAb IgG

3 til DTX.

Alle behandlinger blev udført i.p. og forventede varighed af behandlingen var 4 uger baseret på vores tidligere undersøgelser. Efter behandlinger, hvis dyrets abdominal omkreds nåede 9,5 cm, eller hvis de var forventet at blive døende inden for kort tid blev dyrene aflivet. Overlevelsestiden for hvert dyr blev beregnet som antallet af dage mellem behandlingens start og eutanasi. Ved slutningen af ​​eksperimenterne blev mus aflivet ved cervikal dislokation, mens under urethrane anæstesi.

prøvetagning

Før eutanasi blev en blodprøve indsamlet via hjertepunktur under anæstesi. Ved udgangen af ​​eksperimenter blev 2 ml fysiologisk saltvand injiceret i.p. og bughulen var vasket fuldstændigt og aspireret for CA125 detektion. Ascites mængder i bughulen blev registreret. Ascitesvæsken vask, tumorer dissekeret fra bughulen, og plasmaet blev alle opbevaret ved -80 ° C til efterfølgende analyse. Kumulativ faktiske omfang af ascites opsamlet efter hver aspiration blev beregnet ved at subtrahere 2 ml fra den samlede mængde opsamlet.

CA125-niveauer i ascitesvæske

tumormarkør niveauer (CA125 Ku /L) i celle -fri ascites væske fra enkelt MAb C595, DTX og kombinationsbehandlinger (test og kontrol) blev bestemt ved en ELISA-assay følge instruktionerne på St George Hospital Biokemi Laboratories. Koncentrationen af ​​CA125 i ascites blev normaliseret til den faktiske mængde af ascites indsamlet.

Mus væv og histologi

De tumorvæv fra enkelte MAb, DTX, kombination eller køretøjskontrolsystemer-behandlede dyr var enten straks lynfrosset til frosne snit eller fikseret i 10% formalin i 24 timer, indlejret i paraffin blok for H positive celler dukkede brun. Kontrolglas blev behandlet på identisk måde, og farvet med isotypen MAb eller undladelse af det primære antistof som negativ kontrol. Positive kontroller blev valgt afhængigt af forskellige MAb’er, koloncarcinomvæv for MUC1, tungevæv for Ki-67 og DTX-behandlede OVCAR-3 cellelinie til caspase-3 (aktiv) og PARP-1 (spaltet p85).

i CD31-farvning, blev frosne snit optøet, lufttørret og fikseret i kold acetone i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter en hurtig lufttørre og vask med TBS blev sektionerne inkuberet med rotte-anti-muse CD31 MAb (1:100 fortynding) o /n ved 4 ° C. Efter skylning med TBS, blev snit inkuberet med kanin-anti-rotte biotinyleret IgG (1:200 fortynding) i 45 minutter, og derefter med konjugeret streptavidin /HRP (1:200 fortynding) i yderligere 30 minutter. Sektioner blev udviklet ved hjælp af DAB-opløsning (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australien), og modfarvet med hæmatoxylin. Kontrol slides blev behandlet på samme måde, og farvet med isotype MAb eller undladelse af det primære antistof som negativ kontrol.

TUNEL assay for apoptotiske celler

in vivo

Apoptose blev vurderet på tumor xenograft væv under anvendelse af TUNEL-metoden med TdT-fragEL in situ apoptotisk detektion kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Specificiteten af ​​TUNEL reaktivitet blev bekræftet med passende negativ (TdT udeladt fra mærkning mix) og positive (behandlet HL-60 slides, som selskabet) kontrol. Objektglas blev undersøgt under anvendelse af et Leica lysmikroskop (Nussloch, Tyskland).

Vurdering af immunofarvning

farvningsintensitet (0-3) blev vurderet ved anvendelse af lysmikroskopi (Leica mikroskop, Tyskland) ved en × 40 mål som – (negativ), + (svag), ++ (moderat), og +++ (stærk). Evaluering af væv farvning blev gjort uafhængigt af to erfarne observatører (LW og HMC). Alle prøver blev bedømt blindt og et gennemsnit på kvaliteter blev taget. Hvis der blev opnået uoverensstemmende resultater, blev forskelle løst ved fælles evaluering og høring af en tredje observatør, oplevede i immunhistokemisk patologi.

Statistisk analyse

Alle numeriske data blev udtrykt som gennemsnittet af de værdier opnået og standardafvigelsen (SD) blev beregnet. Dataene fra behandlede og kontrolgrupper blev sammenlignet under anvendelse af to-tail Students t-test. Alle

P

værdier var to-sidet. Envejs-ANOVA efterfulgt af Dunnetts post hoc test blev udført for at bestemme signifikante forskelle i gennemsnitlige mus vægtændringer i toksikologiske undersøgelser. Overlevelse blev beregnet som antallet af dage gået mellem behandlingens start og eutanasi, og% overlevende mus var det antal dyr, der er tilbage i hver gruppe (× 10) ved slutningen af ​​hver uge efter påbegyndelse af behandlingen.

P

0,05 blev betragtet som signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 4.00 pakke (GraphPad, San Diego, CA, USA).

Resultater

Toksikologisk vurdering af enkelt MAb C595, DTX og kombinationsbehandlinger

enkeltdosis-administration af MAb C595 ved 1, 5, 10, 15 mg /kg og DTX ved 3, 5, 7, 10 mg /kg for de første 3 uger ikke nåede toksicitet slutpunkter på 70 dage efter behandling (fig. 1A og B). En enkelt administration af kontrol MAb IgG

3 ved 15 og 20 mg /kg i de første 3 uger nåede ikke toksicitet slutpunkter på 70 dage efter behandling (data ikke vist). Mus behandlet med 20 mg /kg MAb C595 /uge eller 15 mg /kg DTX /uge begyndte at tabe sig og blev aflivet 4 uger efter behandlingen på grund af tegn på lidelse; histopatologisk undersøgelse angivet mild nefropati i disse grupper. Resultaterne tyder på, at MTD for enkelt dosis MAb C595 ligger mellem 15 og 20 mg /kg, mens MTD for en enkelt administration af DTX ligger mellem 10 og 15 mg /kg.

Gennemsnitlige procentvise vægt ændringer i forhold til dag 0 (dvs. dag i enkelt eller kombination administration). A. Dose-tolerance forholdet i mus ved en enkelt MAb C595. ▪: MAb C595 (1 mg /kg); ▴: MAb C595 (5 mg /kg); ▾: MAb C595 (10 mg /kg); ♦: MAb C595 (15 mg /kg); •: MAb C595 (20 mg /kg). Den signifikant forskel blev fundet mellem 20 mg /kg af MAb C595-behandlede gruppe og andre MAb C595-behandlede grupper (5-15 mg /kg) (

P

0,05). B. Dosis-tolerance forholdet i mus ved enkelt DTX. ▪: DTX (3 mg /kg); ▴: DTX (5 mg /kg); ▾: DTX (7 mg /kg); ♦: DTX (10 mg /kg); •: DTX (15 mg /kg). Den betydelige forskel blev fundet mellem 15 mg /kg DTX-behandlede gruppe og andre DTX-behandlede grupper (5-15 mg /kg) (

P

0,05). C. Dosis-tolerance forholdet i mus ved kombination test [MAb C595 (5 mg /kg) + DTX (3-10 mg /kg)]. ▪: MAb C595 + DTX (3 mg /kg); ▴: MAb C595 + DTX (5 mg /kg); ▾: MAb C595 + DTX (7 mg /kg); ♦: MAb C595 + DTX (10 mg /kg). D. Dosis-tolerance forholdet i mus ved kombination kontrol [MAb IgG

3 kontrol (5 mg /kg) + DTX (3-10 mg /kg)]. ▪: MAb IgG

3 + DTX (3 mg /kg); ▴: MAb IgG

3 + DTX (5 mg /kg); ▾: MAb IgG

3 + DTX (7 mg /kg); ♦: MAb IgG

3 + DTX (10 mg /kg). Punkter, mean (n = 5 i hver gruppe); bar, SD.

For kombinationsbehandlinger, vi brugte 1/3 MTD MAb C595 (dvs. 5 mg /kg) som en test og 5 mg /kg af negativ MAb IgG3 som kontrol kombineret med en række DTX (1~10 mg /kg) for yderligere at vurdere toksicitet af kombinationsbehandlinger. Ingen toksicitet blev fundet i kombinationsbehandlinger (fig. 1C og D). Der var ingen makroskopiske tegn på kronisk toksicitet til store organer til nogen mus. Leukocyttal var trykkede i perifert blod i behandlede mus på 2 uger efter injektion, med inddrivelsen sker ved 4 uger og normal hæmatologi blev set ved 70 dage. Disse resultater tyder på, at kombinationsbehandlinger med MAb C595 og DTX eller med kontrol MAb IgG

3 og DTX kunne benyttes sikkert i dyremodeller for at studere effekten.

Effekt af enkelt MAb C595 og DTX på tumorvækst hæmning og ascites produktion

Vi først sammenlignet antitumoraktivitet enkelt MAb C595 MAb IgG

3 kontrol, enkelt DTX og vehikelkontrol (HPMC) efter udvikling af ascites og indledende aspiration i 3 uger. Kumulativ mængde ascitesvæske produceret pr dyr er vist i fig. 2A. Vehikelbehandlede mus fortsatte med at producere ascites ved en hyppigere hastighed og måtte opsuget gentagne gange i løbet af behandlingen (28 dage), mens MAb C595-behandlede mus producerede mindre ascites relateret til dosis af MAb C595 (4 ± 1 ml til HD og 5 ± 1 ml for LD) sammenlignet med mAb IgG3 kontrolmus (7 ± 2 ml) (fig. 2A). DTX-behandlede mus udviklede ascites langsomt sammenlignet med HPMC kontrol (6 ± 1 ml) og produktion af ascites var relateret til dosis af DTX (2 ± 1 ml til HD og 4 ± 1 ml for LD, henholdsvis) (fig. 2A ). HD af DTX (10 mg /kg) reducerede signifikant udvikling af ascites (P . 0,05, figur 2A). Foruden ascitesproduktion, vurderede vi også den samlede tumorvægtændring i hver gruppe ved afslutningen af ​​forsøgene (4 uger efter behandling). Den tumorvægtændring er i overensstemmelse med ændringen af ​​ascites-produktion (fig. 2B). Single MAb C595 inhiberede kun delvist væksten af ​​OVCAR-3 tumorer, hvilket fremgår af tumorvægt af 380 ± 80 mg hos LD (5 mg /kg) og 260 ± 76 mg i HD (150 mg /kg) versus 560 ± 77 mg i mus, der modtager negativ MAb IgG3 kontrol (15 mg /kg) (P 0,05), henholdsvis mens enkelt DTX tydeligvis hæmmede væksten af ​​OVCAR-3 tumorer, hvilket fremgår af tumorvægt på 230 ± 66 mg i LD (5 mg /kg ) og 75 ± 14 mg i HD (10 mg /kg) versus 540 ± 96 mg i mus, der modtog det samme volumen HPMC (P 0,05), (fig 2B).. Disse resultater antyder, at både MAb C595 og DTX kan inducere regression af OVCAR-3 tumorvækst på en dosis-afhængig måde, og at anti-tumor aktiviteten af ​​DTX er mere effektiv end den for MAb C595.

Efter eutanasi, bughulen på hver mus blev vasket med 2 ml normalt saltvand, og efter aspiration, blev registreret mængden af ​​ascites stede. A. Kumulative volumener ascites opsamlet fra hvert dyr fra påbegyndt behandling [MAb C595 (H og L), MAb IgG, DTX (H og L) er vist

3. Den indlysende forskel blev set mellem DTX (H) -behandlet gruppe og andre-behandlede gruppe (

P

0,05). B. Tumorvægte (mg) ved slutningen af ​​forsøgene efter enkelt MAb C595 MAb IgG

3, DTX eller vehikel behandlinger med forskellige doser. Tumoren vejer var tydeligvis lavere i MAb-behandlede og DTX-behandlede grupper i forhold til MAbIgG

3-behandlede og HPMC-behandlede kontrolgrupper (

P

0,05). C. Virkning af enkelt MAb C595 MAb IgG

3, DTX eller køretøj på at undertrykke stigningen i tumoren markør CA125 (CA125 Ku /L) i ascitesvæsken (peritoneal vask) ved afslutningen af ​​forsøgene. Niveauet af CA125 var tydeligvis lavere i MAb C595 (H) -behandlede og DTX-behandlede grupper i forhold til MAbIgG

3-behandlede og HPMC-behandlede kontrolgrupper (

P

0,05). H: høj dosis; L: lav dosis. Repræsentative grafer er vist.

Virkning af kombination af MAb C595 og DTX på tumorvækst, ascites produktion og overlevelse

Vi derefter sammenlignet antitumoraktiviteten af ​​kombinationen af ​​1/3 MTD MAb C595 (5 mg /kg) eller kontrol MAb IgG

3 (5 mg /kg) med en dosis DTX (10 mg /kg) efter udvikling af ascites og indledende aspiration i 3 uger. Kombinationen test (5 mg /kg MAb C595 og 10 mg /kg DTX) kunne signifikant inhibere udviklingen af ​​ascites sammenlignet med kombinationen kontrol (5 mg /kg MAb IgG3 og 10 mg /kg DTX) og vehikelkontrol (fig. 3A) . Mønstret af ascites produktion i kombinationen kontrolgruppen ligner den, der ses for en enkelt 10 mg /kg DTX behandling som beskrevet ovenfor. Kumulativ mængde ascitesvæske produceret per dyr præsenteres for kombination test (0,4 ± 0,2 ml), kombination kontrol (2 ± 1 ml) og vehikelkontrol (7 ± 2 ml) i fig. 3B (P 0,05). Fire uger efter behandlingen kombination testbehandlingen inhiberede signifikant væksten af ​​OVCAR-3 tumorer, hvilket fremgår af tumor vægt på 15 ± 11 mg vs. 65 ± 16 mg i kombination kontrolgruppen og 560 ± 100 mg i bærerkontrolgruppen (P 0,05). (. Figur 4C)

A. Ved slutningen af ​​eksperimenterne er ingen tydelige tegn på ascites dannelse set i kombination test (5 mg /kg MAb C595 + 10 mg /kg DTX) -behandlet mus (a); tegn på ascites-dannelse blev fundet i kombination kontrol (5 mg /kg MAb C595 + 10 mg /kg DTX) -behandlet mus (b); tydelige tegn på ascites-dannelse blev fundet i køretøjet (1/2 saltvand + på 1/2 HPMC) -behandlet mus (c). B. De kumulative ascites mængder fra kombination test, kombineret kontrol eller bærerbehandlede mus er vist (

P

0,05). C. Virkning af kombination test, kombination kontrollen eller bæreren på at undertrykke stigningen i tumormarkør niveau (CA 125 Ku /L) i ascitesvæsken (peritoneal vask) ved afslutningen af ​​forsøgene (

P

0,05 ). Repræsentant billede og grafer vises.

A. Tumor vægt ændrer ved afslutningen af ​​forsøgene efter kombination test, kombineret kontrol eller køretøjer behandlinger med forskellige doser (

P

0,05). B. tumor volumen i kombination test-behandlede mus var signifikant lavere end i køretøjskontrolsystemer-behandlede mus (

P

0,01). C. For alle dyr, den planlagte varighed af behandlingen var 4 uger. Mus (10 per gruppe) blev aflivet, hvis grund af dårligt helbred, blev de forventes at blive døende inden for kort tid. Overlevelse blev beregnet som antallet af dage gået mellem behandlingens start og eutanasi, og% overlevende mus var det antal dyr, der er tilbage i hver gruppe (× 10) ved slutningen af ​​hver uge efter påbegyndelse af behandlingen. Overlevelsesraten for dyrene i kombination testgruppen var meget bedre end i kombinationen kontrolgruppen eller køretøj gruppe (

P

0,05). Repræsentative billeder og graf vises.

Enkelt eller kombinationsbehandling påvirker tumor markør CA125 niveauer

I slutningen af ​​eksperimenter, ændring i gennemsnitlige CA125 niveauer for enkelt MAb C595 i LD var ikke væsentligt anderledes i forhold til MAb IgG

3 kontrol, mens ændringen i gennemsnitlige CA125 niveauer for enkelt CA125 i HD eller enkelt DTX var tydeligvis anderledes i forhold til MAb IgG

3 eller HPMC kontrol, henholdsvis (

P

. 0,05) (fig 2C). Det er klart, at kombinationen forsøgsgruppen havde signifikant hæmmede CA125 niveauer sammenlignet med kombinationen kontrolgruppen (

P

0,05) eller køretøj kontrolgruppen (

P

0,01) (fig. 3C). Ved eutanasi, de CA125 vehicle værdier var 68.000 ± 12.000 Ku /L, sammenlignet med kombinationen test og kombinationen kontrol med 14.030 ± 5.022 Ku /L og 28.306 ± 11.403 Ku /L. Reduktionen i cellefrie ascitesvæske CA125-niveauer er i overensstemmelse med reduktionen i ascites volumen og tumorvægt.

Histologiske ændringer i tumorxenotransplantater efter kombinationsbehandling

At sammenligne histologi af hver gruppe, vi høstede tumorer fra kombination behandlet, MAb C595 kontrol-behandlede og køretøjskontrolsystemer-behandlede mus ved afslutningen af ​​forsøgene og farvede paraffinsnit med H & E.