PLoS ONE: CBX7 modulerer ekspression af gener Kritisk for Cancer Progression

Abstrakt

Baggrund

Vi har tidligere vist, at ekspressionen af ​​CBX7 drastisk reduceres i flere humane carcinomer, og at dens udtryk gradvis aftager med fremkomsten af ​​en stærkt malign fænotype. Formålet med vores undersøgelse har været at undersøge den mekanisme, hvormed tabet af CBX7 udtryk kan bidrage til fremkomsten af ​​en mere ondartet fænotype.

Metoder

Vi analyserede genekspressionsprofilen af ​​en thyreoideakarcinom cellelinje efter restaureringen af ​​CBX7, og herefter analyseret den transkriptionelle regulering af identificerede gener. Endelig evaluerede vi udtryk for CBX7 og regulerede gener i et panel af skjoldbruskkirtlen og lunge karcinomer.

Resultater

Vi fandt, at CBX7 negativt eller positivt regulerer ekspressionen af ​​flere gener (såsom SPP1 , SPINK1, STEAP1, og FOS, fosB, EGR1, henholdsvis) forbundet til cancer progression, ved at interagere med deres promotorregioner og modulerende deres transkriptionsaktivitet. Kvantitativ RT-PCR-analyser i menneskelige skjoldbruskkirtlen og lungecarcinom væv afslørede en negativ korrelation mellem CBX7 og dets ned-regulerede gener, mens en positiv sammenhæng blev observeret med up-regulerede gener.

Konklusion

Afslutningsvis kan tabet af CBX7 udtryk spiller en kritisk rolle i fremskredne stadier af carcinogenese ved deregulering af ekspressionen af ​​specifikke effektor gener

Henvisning:. Pallante P, Sepe R, Federico a, Forzati F, Bianco M, Fusco A (2014) CBX7 modulerer ekspressionen af ​​gener Kritiske for Cancer Progression. PLoS ONE 9 (5): e98295. doi: 10,1371 /journal.pone.0098295

Redaktør: Tanya V. Kalin, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: Oktober 3, 2013; Accepteret: April 30, 2014; Udgivet: May 27, 2014

Copyright: © 2014 Pallante et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-AIRC (IG 5346), Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica-MIUR (PRIN 2008), “Progetto di Interesse strategico Invecchiamento (PNR-CNR Aging Program) PNR-CNR 2012-2014 “og Progetto PON01-02782:” Nuove strategie nanotecnologiche per la Messa en punto di Farmaci e Presidi diagnostici diretti verso cellule cancerose circolanti “. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne bekræfter, at Pierlorenzo Pallante og Alfredo Fusco er Akademiske Redaktion af PLoS ONE. Pierlorenzo Pallante og Alfredo Fusco tilstand, at dette ændrer ikke deres tilslutning til PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

CBX7 er et Polycomb protein medlem af Polycomb undertrykkende kompleks 1 (PRC1), en multiproteinkompleks der sammen med Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2), fastholder vigtige udviklingsmæssige gener i en transkriptionelt undertrykt tilstand [1] – [3]. Vi har tidligere vist, at CBX7 genet er drastisk nedreguleret i skjoldbruskkirtlen carcinomer og dets ekspression gradvis aftager med malign kvalitet og neoplastisk stadie [4]. Endvidere har yderligere undersøgelser vist, at korrelationen af ​​tabet af CBX7 med en stærkt malign fænotype og en deraf følgende dårlig prognose er en generel begivenhed i onkologi. Faktisk har tabet af CBX7 ekspression nylig blevet vist at være associeret med stigende malignitet klasse i colon [5], blære [6], pancreas [7], bryst [8], gastrisk [9] og lungecarcinom [10] , mens tilbageholdelsen af ​​CBX7 udtryk korrelerer med en længere overlevelse i tyktarmen og bugspytkirtlen kræftpatienter [5], [7]. Genoprettelsen af ​​CBX7 ekspression i skjoldbruskkirtlen, gastriske og colon carcinom-cellelinjer hæmmer cellevækst med en ophobning af cellepopulationen i G1-fasen af ​​cellecyklussen, hvilket antyder en negativ rolle CBX7 i styringen af ​​G1 /S overgang af cellecyklus.

det er for nylig blevet påvist, at CBX7 er i stand til positivt at regulere ekspressionen af ​​genet kodende for E-cadherin [11], der er kendt for at spille en kritisk rolle i opretholdelsen af ​​normal epitelcelle morfologi, og hvis tab af ekspression betegner en generelt træk ved epitel-mesenchymale overgang [12], [13]. Faktisk er det blevet vist, at CBX7 er i stand til at bevare ekspressionen af ​​E-cadherin ved interaktion med histon deacetylase 2 og hæmme dets aktivitet på CDH1 promotoren [11]. Konsekvent, har en direkte sammenhæng mellem niveauerne af E-cadherin og CBX7 udtryk blevet rapporteret i skjoldbruskkirtlen og bugspytkirtelcarcinomer [7], [11]. Derfor ville disse resultater tyder på, at tabet af CBX7 genekspression, kan spille en kritisk rolle i de sene stadier af menneskets carcinoma progression.

tumor suppressor rolle CBX7 er blevet meget nylig bekræftet af fænotypen af ​​cbx7 knockout-mus. Faktisk er disse mus udvikler lever og lunge adenomer og karcinomer, og følgelig, mus embryonale fibroblaster (MEF’er) afledt af cbx7 knockout-mus har en højere vækstrate og en nedsat følsomhed over for ældning end deres vildtype modparter [10]. Cyclin E overekspression på grund af manglende cbx7 der negativt regulerer dets ekspression, sandsynligvis udgør fænotypen af ​​de cbx7 knockout-mus. En lignende mekanisme er sandsynligvis involveret i human lunge carcinogenese siden cyclin E opregulering, der er forbundet med tabet af CBX7 ekspression er blevet observeret i de fleste af de humane lungecarcinomer analyseret [10].

Formålet med nærværende undersøgelse har været at undersøge andre mekanismer, som tabet af CBX7 ekspression kan bidrage til fremkomsten af ​​et stærkt malign fænotype. Vi først genereret seks thyreoideakarcinom cellekloner, hvor ekspressionen af ​​CBX7 er blevet genoprettet, derefter ved hjælp af kraftige oligonucleotid microarray hybridisering teknik, analyserede vi genekspressionsprofilen af ​​FRO cellelinie, i hvilken ekspressionen af ​​CBX7 blev genoprettet, sammenlignet til den samme cellelinje ikke udtrykker CBX7.

Vi fandt, at CBX7 kunne positivt regulere 120 gener og negativt regulerer 196 gener. Blandt dem, vi identificeret flere specifikke effektor gener, såsom SPP1 (koder for osteopontin protein), hvis funktion er kendt for at være af afgørende betydning for erhvervelse af et fuldt maligne fænotype. Kromatin immunopræcipitationsforsøg viste, at CBX7 protein direkte binder sig til initiativtagerne til disse regulerede gener og funktionelle undersøgelser bekræftede, at CBX7 udtryk var i stand til at modulere fortalerne for de CBX7-regulerede gener. Endelig kvantitativ RT-PCR-analyser viste en omvendt korrelation mellem CBX7 og dens ned-regulerede gener og en positiv korrelation med dens opregulerede dem i humane skjoldbruskkirtel og lungecarcinom prøver ved forskellige grader af malignitet.

Taget sammen , de indberettede data her viser, at CBX7 negativt eller positivt kontrollerer ekspressionen af ​​flere gener, der koder for proteiner, der har en kritisk rolle i human cancer progression.

Materialer og metoder

microarray analyse

GeneChip human Gene 1.0 ST Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA), der består af 764,885 probesæt omfattende over 28.869 gener, blev anvendt til at evaluere gener udtrykkes differentielt. Hybridiseringsproceduren hele blev udført ved at følge Affymetrix instruktioner. De forstærkning og mærkning processer blev verificeret ved hjælp af en GeneChip eukaryot Poly-A RNA Kontrol Kit (Affymetrix) med eksogene positive kontroller. 15 ug af hver biotinyleret cRNA forberedelse var fragmenteret og placeres i hybridisering blanding, der indeholder biotinylerede hybridisering kontroller (GeneChip Expression Hybridiseringsbe Controls, Affymetrix). Prøver blev derefter hybridiseret til en GeneChip Human Gene 1.0 ST Array ved 45 ° C i 16 timer ved konstant rotation (60 rpm) i en hybridiseringsovn (Affymetrix). Microarray scannede billeder blev opnået med en GeneChip Scanner (Affymetrix) ved hjælp af standardindstillingerne. Billeder blev analyseret med Affymetrix Gene Expression Analysis Software (Affymetrix). Der blev foretaget sammenligninger mellem did-EV-1 og FRO-CBX7-1 prøver, overvejer FRO-EV-1 som baseline. De fold ændre værdier, der angiver den relative ændring i udtrykket niveauer mellem FRO-EV-1 og FRO-CBX7-1, blev brugt til at identificere gener udtrykkes forskelligt.

er tilgængelige i ArrayExpress database microarraydata (www .ebi.ac.uk /arrayexpress) under tiltrædelsen nummer E-mtab-2420.

menneskelige vævsprøver

De menneskelige skjoldbruskkirtlen kræft væv, tilstødende normale væv eller normale kontralaterale lapper, opnået fra kirurgisk prøver, blev indsamlet til Servicecentret d’anatomisk-Pathologie, Centre Hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, Frankrig, i henhold til retningslinjerne i den etiske komité af dette institut, og blev straks nedfrosset i flydende kvælstof til efterfølgende udføre udvinding af RNA.

“TissueScan Real-Time Lung Cancer sygdom Panel III” af cDNA blev købt fra Origene (Origene Technologies Inc., Rockville, MD). Denne lungekræft cDNA panel (HLRT103) indeholder 8 normale lunge prøver og 40 lungekræft eksemplarer af forskellig histotype, hvis klinisk patologiske funktioner er frit tilgængelige på følgende adresse: https://www.origene.com/qPCR/Tissue-qPCR- Arrays.aspx.

RNA-ekstraktion, kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) og microarray analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellelinier og væv ved hjælp af RNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Integriteten af ​​RNA blev bedømt ved denaturerende agarosegelelektroforese. For at generere cDNA blev QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) anvendes til revers transkribere 1 ug totalt RNA fra hver prøve. En optimeret blanding af oligo-dT og vilkårlige primere blev anvendt.

Real-time kvantitativ PCR blev udført med CFX 96 thermocycler (Bio-Rad, Hercules, CA) i 96-brønds plader under anvendelse af et slutvolumen af 20 pi. Til PCR brugte vi 10 pi 2 × Sybr Green (Applied Biosystems, Foster City, CA), 200 nM af hver primer, og cDNA dannet fra 20 ng samlet RNA. De anvendte primere er angivet i Datasæt S1. Termisk protokol var som følger: 2 min 95 ° C; derefter 45 cykler 20 s 95 ° C og 1 min 60 ° C. Hver reaktion blev udført i to eksemplarer og 2

-ΔΔCT metode blev anvendt til at beregne de relative ekspressionsniveauer [14]. G6PD blev anvendt som reference gen.

cellekulturer og transfektioner

thyreoideakarcinom celler FRO [15] til rådighed i vores laboratorium og HEK 293 celler (American Type Culture Collection, LGC Standards Srl, Sesto San Giovanni, Italien) blev dyrket i DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt kalveserum (Life Technologies), 1% glutamin, 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies) i en CO 5%

2 atmosfære. FRO og HEK 293-celler blev transficeret under anvendelse af enten Lipofectamine reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og Neon Elektroporation System (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. For at generere CBX7 stabil udtrykkende celler blev transficerede celler udvalgt i et medium indeholdende geneticin (Life Technologies), adskillige kloner blev opsamlet og ekspanderet til yderligere analyser. Rotte normal thyroid PC CL3 celler [16] blev dyrket i modificeret F12-medium suppleret med 5% kalveserum (Life Technologies) og seks vækstfaktorer (thyrotropisk hormon, hydrocortison, insulin, transferrin, somatostatin og glycyl-histidyl-lysin, Sigma, St . Louis, MO). PC CL3 celler blev transficeret med kontrol siRNA og siRNA mod rotte cbx7 som tidligere rapporteret [11]. Muse embryonale fibroblaster (MEF’er) fra cbx7 knockout-mus blev etableret, dyrket og transficeret (passage P3 og P4) som beskrevet andetsteds [10].

Protein ekstraktion og western blot-analyse

Protein ekstraktion og western blot procedure blev udført som tidligere beskrevet [11]. Efter elektroforese og blotting procedurer blev nitrocellulosemembraner inkuberet natten over med det primære antistof i et koldt rum (+ 4 ° C). Membraner blev derefter inkuberet med det sekundære antistof (peberrodsperoxidasekonjugeret, 1:3000) i 60 minutter (ved stuetemperatur), og reaktionen blev påvist med et western blot detektionssystemet (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). De anvendte antistoffer var anti-HA (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland), anti-CBX7 (sc-70.232, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-CBX7 (ab21873, Abcam, Cambridge, UK) , anti-His-probe (sc-804, Santa Cruz Biotechnology), anti-EGR1 (sc-189, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-c-Fos (sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-Fos B (sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-tubulin γ (sc-17787, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) og anti-β-Actin (Clone AC-15 A5441, Sigma-Aldrich Co. ., St. Louis, MO).

Luciferaseaktivitet assay

Luciferase transaktivering assay blev udført som rapporteret andetsteds [11]. En region, der spænder over 1000 bp opstrøms for tanscriptional startstedet (TSS) af CBX7-regulerede gener (primere sekvenser er tilgængelige i Datasæt S1) blev PCR-amplificeret og indsat opstrøms for den åbne læseramme af luciferasegenet indeholdt i pGL3 vektor (Promega, Fitchburg, WI). Alle reporterkonstruktioner genereret blev kontrolleret for mutationer ved direkte sekventering. CMV-β-galactosidase-ekspressionsvektor blev anvendt til at normalisere transfektionsaktivitet ifølge galactosidaseaktivitet. Proteinlysater blev opnået 36 timer efter transfektion af HEK 293-celler og luciferaseaktivitet blev målt for hvert punkt ved at anvende en Lumat LB9507-luminometer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland) og Dual Light System kit (Life Technologies). Alle assays blev udført in duplo, og resultaterne er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg.

chromatin immunoprecipitation assay (chip)

Chromatin prøver fra celler og væv blev forarbejdet til chromatin immunoprecipitation som rapporteret andetsteds [ ,,,0],10], [11]. Prøver blev underkastet immunpræcipitation med anti-CBX7 antistoffer (ab21873, Abcam). Ikke relateret IgG blev anvendt som negativ kontrol af immunfældning. For qPCR 3 pi 150 pi IP-DNA blev anvendt, og input-DNA-værdier blev anvendt til at normalisere værdierne fra kvantitative chip prøver. Procent input blev beregnet efter formlen 2

ACt × 3, hvor ACt er forskellen mellem Ct

input og Ct

IP [10]. Alle kvantitative data blev afledt fra tre uafhængige forsøg, og for hvert forsøg blev udført qPCR tredobbelt. Sekvenserne for de anvendte primere er rapporteret i Datasæt S1. Promotoren af ​​mennesker og mus GAPDH genet blev anvendt som negativ kontrol af CBX7 kromatin interaktion [4].

Etik

Den etiske komité af det medicinske fakultet og staten medicinske bestyrelse for centret hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, Frankrig, enige om at disse undersøgelser, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienterne i denne undersøgelse.

statistiske analyser

Statistisk vurdering blev udført ved hjælp af Graph Pad Prism. Students t-test blev anvendt til sammenligning mellem to grupper af eksperimenter. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD og forskelle blev anset for at være signifikant, hvis p 0,05. Fordeling af QRT-PCR gange ændring værdier i forhold til hvert gen i papillær skjoldbruskkirtlen carcinomer og lungecarcinomer blev opnået og afbildet ved hjælp af feltet og whiskers (min til max) og percentil metode. For korrelationsanalyse blev gange ændring værdier anvendes til at konstruere scatter diagrammer, for at opnå en tendens linje og at beregne Pearson R-værdi.

Resultater Salg

Genekspressionsprofil af thyreoidea carcinomceller efter re- udtryk for CBX7

for at undersøge den mekanisme, hvormed tabet af CBX7 udtryk kan bidrage til erhvervelse af en ondartet fænotype, vi analyserede genekspressionsprofilen af ​​en skjoldbruskkirtlen carcinom cellelinje (FRO), hvor ekspression af CBX7 blev genoprettet (FRO-CBX7, figur 1A). RNA udvundet fra FRO-EV-1 (en klon stabilt transficeret med den tomme vektor) og FRO-CBX7-1 klon, blev hybridiseret til en Affymetrix oligonukleotid array med flere tusinde udskrifter. Ekspressionsprofilen af ​​FRO-CBX7-1 celler blev derefter sammenlignet med den for FRO-EV-1. Flere udskrifter resulterede ændret i deres udtryk niveau mellem FRO-CBX7-1 og FRO-EV-1 (tabel 1 og 2, tabel S1 og S2). 53 transkripter (17 opreguleret og 36 nedreguleres) havde en absolut fold ændring mere end 2,0 (tabel 1 og 2), mens 263 transkripter (103 opreguleres og 160 nedreguleres) viser en absolut fold ændring omfattede 1,5-2,0 (tabel S1 og S2). Som en kontrol af microarray analyse, vi observeret, at CBX7 blev højt udtrykt i FRO-CBX7-1 (tabel 1).

A) CBX7 ekspression blev vurderet ved QRT-PCR-analyse i FRO (wt), og flere FRO-EV (tom vektor) og FRO-CBX7 celle-kloner. Værdierne er udtrykt som relative udtryk med hensyn til den FRO prøve, der blev sat lig med 1. B, C) De valgte CBX7-regulerede gener blev analyseret ved QRT-PCR-analyse i FRO (wt), og flere FRO-EV og FRO- CBX7 cellekloner. FOS, fosB og EGR1 genekspression var mere rigelige i FRO-CBX7 celle kloner end i FRO-EV celler omvendt, SPP1, SPINK1 og STEAP1 udtryk var mindre udtalt i FRO-CBX7 celler sammenlignet med den FRO-EV og FRO (vægt ) celler. Værdierne er udtrykt som relative udtryk med hensyn til den FRO prøve, der blev sat lig med 1. D) Ekspressionen af ​​FOS, fosB og EGR1 blev vurderet i et FRO-CBX7 celleklon (FRO-CBX7-1), en FRO-EV (FRO-EV-1) og tilbage vildtypeceller. p-actin blev evalueret som ladningskontrol. Pile angiver båndene svarende til FOS og EGR1. Vejviser

Blandt generne reguleres af CBX7 i humane skjoldbruskkirtel carcinomceller vi koncentrerede vores opmærksomhed på FOS, fosB og EGR1 (tabel 1) der var positivt reguleret, og SPP1, SPINK1 og STEAP1 (tabel 2), der blev omvendt negativt reguleret af CBX7, da disse gener er kendt for at spille en relevant rolle i erhvervelsen af ​​et fuldt maligne fænotype. Faktisk FOS, fosB og EGR1 er proteiner der er blevet rapporteret at blive nedreguleret i flere humane carcinomer tyder på en kritisk rolle af disse proteiner i cancer progression [17] – [19]. På den anden side, SPP1, SPINK1 og STEAP1 er proteiner, der er opreguleret i flere humane carcinomer og deres overekspression er også forbundet til kræft progression [20] – [22]. Vi evaluerede ekspressionen af ​​disse transkripter ved QRT-PCR i flere CBX7-udtrykkende FRO kloner (figur 1B og C) sammenlignet med FRO-EV-kloner og med de FRO (wt) celler. For dem alle, QRT-PCR-analyse bekræftede den differentielle ekspression er forbundet med ekspressionen af ​​CBX7 protein (figur 1B og C). Desuden Western blot eksperimenter bekræftede en forøget ekspression af FOS, fosB og EGR1 proteiner i en FRO celleklon stabilt udtrykker CBX7 (FRO-CBX7-1) i sammenligning med FRO-EV (FRO-EV-1) og tilbage vægt- celler ( Figur 1D).

Analyse af CBX7-regulerede gener i rotter skjoldbruskkirtlen celler og MEF udtrykker eller ej cbx7 gen

Vi næste undersøgte, om generne udtrykkes forskelligt i FRO-CBX7 celler viste en differential udtryk også i MEF’er isoleret fra cbx7 knockout-mus [10]. Som vist i figur 2, QRT-PCR-analyse bekræftede modulation af de udvalgte CBX7-regulerede gener også i dette cellesystem, i virkeligheden, blev generne positivt reguleret af cbx7 fundet nedreguleret i cbx7

– /- MEF’er (figur 2A), medens gener negativt reguleret af cbx7, blev fundet opreguleret i cbx7

– /- MEF’er, i sammenligning med cbx7

+ /+ MEF’er (figur 2B). Western-blot eksperimenter viste, at ekspressionen af ​​fos- og EGR1 proteiner fald i cbx7

– /-. MEF’er, hvis forhold til cbx7

+ /+ MEF’er (Figur 2D)

Kvantitativ RT-PCR-analyse blev udført for at analysere ekspressionsniveauerne af CBX7-regulerede gener i cbx7

+ /+ og cbx7

– /- MEF’er. Værdierne er udtrykt som relative udtryk med hensyn til den cbx7

+ /+, der blev sat lig med 1. A) Fos, FosB og EGR1 blev mindre udtrykt i cbx7

– /- MEF’er forhold til cbx7

+ /+ MEF. B) Tværtimod SPP1, spink1 og steap1 gener blev mere udtrykt i MEF cbx7

– /- i forhold til de MEF cbx7

+ /+. C) Cbx7

– /- MEF’er blev transient transficeret med en mammal vektor, der udtrykker muse cbx7 (myc-His-mærkede) mRNA (cbx7

– /- R). Genoprettelse af cbx7 ekspression er i stand til at vende tilbage fænotypen af ​​cbx7

– /- MEF’er (A, B). Værdierne er udtrykt som relative udtryk med hensyn til den cbx7

+ /+, der blev sat lig med 1. D) Ekspressionen af ​​fos- og EGR1 proteiner blev bedømt ved western blot i MEF’er opnået fra cbx7

– /- mus i forhold til cbx7

+ /+ MEF. β-Actin udtryk blev vurderet til at normalisere protein lastning

Restaureringen af ​​cbx7 genekspression i cbx7

-. /- MEF’er (Figur 2C) førte til en forøget ekspression af fos, FosB og EGR1 (figur 2A) og en nedsat udtryk for spink1, SPP1 og steap1 (figur 2B) bekræfter reguleringen af ​​disse gener ved CBX7 udtryk.

for yderligere at verificere rolle CBX7 i modulering af disse gener, vi vurderede deres ekspression i normale rotter thyroid cellelinie PC C! 3, hvor syntesen af ​​cbx7 blev undertrykt af RNA-interferens. Undertrykkelse af cbx7 genet kontrolleres på flere timer efter siRNA behandling (figur 3A) resulterede i en reduktion af den CBX7 positivt regulerede gener (figur 3B) og i en forøget ekspression af CBX7 negativt regulerede gener (figur 3C), i sammenligning med de ubehandlede celler eller dem behandlet med den ikke-silencing kontrol siRNA (krypteret).

A) PC CL3 celler blev transient transficeret med lille interfererende RNA (siRNA) mod rotte cbx7 mRNA. Efter transfektion kan vi observere en effektiv knockdown af cbx7 mRNA-niveauer, som vurderes af QRT-PCR-analyse. B er C) CBX7-regulerede gener ekspression vurderet ved QRT-PCR i rotte PC CL3 celler efter transfektion med rotte cbx7 siRNA. Ekspression blev evalueret 48 timer efter transfektion. Værdier er udtrykt som relativ udtryk i forhold til de PC CL3 celler transficeret med en ikke silencing kontrol siRNA (krypteret), der blev sat lig med 1.

CBX7 binder sig til fortalere for regulerede gener og modulerer deres aktivitet

for at vurdere, om CBX7 var direkte involveret i den differentielle ekspression af disse gener

in vivo

, vi udførte en kromatin immunofældning (chip) assay. Derefter FRO-EV-1 og tilbage-CBX7-1 celler tværbundet og immunpræcipiteret med anti-CBX7 eller IgG-antistoffer. Immunopræcipitation af kromatin blev efterfølgende analyseret ved qPCR anvendelse af primere spænder over regionen af ​​disse gener promotoren (Datasæt S1). Resultaterne vist i figur 4A resultater viser, at CBX7 kunne binde til disse promotorer. Faktisk anti-CBX7 antistoffer præcipiterede region fra promotoren af ​​disse gener i FRO-CBX7-1 celler, sammenlignet med did-EV-1-celler (figur 4A). Desuden blev der ikke berigelse observeret i prøver immunfældet med normalt kanin IgG og når primere til den humane GAPDH kontrol promotoren blev anvendt, hvilket viser, at bindingen er specifik for disse promotorer (figur 4A). Det samme resultat blev opnået ved anvendelse chromatin opnået fra HEK 293-celler transient transficeret med CBX7 ekspressionsvektor (fig S1).

A) FRO-EV-1 og FRO-CBX7-1 celler blev underkastet en chip under anvendelse af antistoffer mod CBX7. Som negative kontroller blev uafhængige IgG antistoffer anvendes. Den associerede DNA blev amplificeret ved qPCR anvendelse af primere specifikke for det tilsvarende gen-promotor og, som en kontrol chip specificitet, primere genkender det humane GAPDH-gen-promotoren. B) MEF’er opnået fra cbx7

+ /+ og cbx7

– /- blev analyseret for binding af cbx7 protein til promotorerne for sine regulerede gener. Som negative kontroller blev ubeslægtede IgG-antistoffer anvendes, og, som en kontrol chip specificitet, blev primere genkender muse GAPDH genpromotoren anvendes. Data er rapporteret som procent input og blev beregnet ved hjælp af følgende formel: 2

ACt × 3, hvor ACt er forskellen mellem Ct

input og Ct

IP

. for at bekræfte bindingen af ​​endogene cBX7 protein til initiativtagerne til disse gener, tog vi også fordel af MEF’er og væv fra det cbx7 knockout mus [10]. CHIP eksperimenter blev udført på MEF’er, nyre og milt væv fra cbx7

+ /+ og cbx7

– /- mus. Anti-CBX7 antistoffer var i stand til at genkende endogene cbx7 og at udfælde kromatin fra cbx7

+ /+, men ikke fra cbx7

– /- MEF’er (figur 4B) og væv (Figur S2) bekræfter bindingen af ​​endogene cbx7 til disse promotorregioner. Disse CHIP eksperimenter derfor angivet at CBX7 fysisk interagerer med promotorregioner af disse gener

in vivo

derfor direkte modulere deres ekspression.

Efterfølgende at vurdere effekten af ​​CBX7 ekspression på transkription af disse regulerede gener, HEK 293-celler blev transient co-transficeret med ekspressionsvektoren kodende CBX7 og med en reporter vektor, der bærer luciferasegenet under kontrol af en 1000 bp promotorregion placeret opstrøms for TSS i hver af disse gener. Som vist i figur 5, CBX7 forøgede transskriptionelle aktivitet af FOS, fosB og EGR1 promotorer (figur 5A), mens den undertrykte den transkriptionelle aktivitet af SPP1, SPINK1 og STEAP1 promotorer (figur 5B). Desuden virkningerne af CBX7 på disse promotorer var dosisafhængig. Derfor chip og luciferaseanalyse forsøg viser, at CBX7 er i stand til direkte at regulere transkriptionen af ​​de udvalgte CBX7-regulerede gener ved at binde til deres promotorer. Salg

HEK 293-celler blev transient co-transficeret med stigende mængder af CBX7 ekspression vektor og en konstant mængde vektor indeholdende luciferasegenet under kontrol af promotorerne for CBX7-regulerede gener. Stigende mængder af CBX7 håndhæves ekspressionen af ​​reportergenet under kontrol af FOS, fosB og EGR1 promotorregioner (A), hvorimod undertrykt aktiviteten af ​​reportergenet under kontrol af den SPP1, SPINK1 og STEAP1 promotorer (B). den relative aktivitet af ildflue-luciferase-ekspression blev standardiseret til et transfektionskontrol anvendelse β-galactosidase. Skalaen søjler repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3).

Udtrykket af CBX7-regulerede gener korrelerer med CBX7 udtryk også i humane karcinomer

Da tidligere resultater viste, at CBX7 udtryk blev reduceret i skjoldbruskkirtlen, colon og lunge karcinomer [4], [5], [10], med ekspressionsniveauerne næsten helt målbart i mest avancerede skjoldbruskkirtelkræft, vi hypotese, at tabet af CBX7 gen kunne være involveret i fremskredne stadier af skjoldbruskkirtel carcinogenese af den deraf modulering af disse gener. Derfor har vi analyseret CBX7 og de udvalgte CBX7-regulerede gener i menneskelige skjoldbruskkirtlen og lungecarcinomer ved QRT-PCR. Hvad angår de papillære thyroid carcinomer angår, FOS, fosB og EGR1 gener blev nedreguleret, ligesom CBX7, mens SPP1, SPINK1 og STEAP1 opreguleret (figur 6A). Ligeledes ekspressionen analyse af disse gener i lungecarcinomer viste den samme opførsel (figur 6B). Den korrelationsanalyse i PTC og lungecarcinomer (Pearson r) viste sammenhængen mellem CBX7 og dens regulerede gener (PTC: FOS, p = 0,0438; lungecarcinomer: FOS, s 0,0001, fosB, s 0,0001, EGR1, s 0,0021 , Figur S3 og S4).

Vi analyserede ekspressionen af ​​CBX7, FOS, fosB, EGR1, SPP1, SPINK1 og STEAP1 ved QRT-PCR i papillære thyroidcarcinomer (PTC) (A) og human lunge carcinoma prøver (B). Ekspressionen af ​​FOS, fosB og EGR1 er nedreguleres, som det forekommer for CBX7, i de neoplastiske væv i forhold til normale modstykker. Omvendt ekspressionen af ​​SPP1, SPINK1 og STEAP1 blev opreguleret i de neoplastiske prøver i forhold til de normale væv, der viser en modsat tendens sammenlignet med den for CBX7. Resultater udtrykkes som fold-change (for PTC) eller relative ekspression (for lungecarcinomer) i forhold til en pulje af normale prøver, som blev sat lig med 1. Rækken af ​​variabilitet CBX7 og CBX7-reguleret genekspression i normal thyroid og lunge væv var mindre end 10%.

Derfor er disse data tyder på, at tabet af CBX7 genekspression kan bidrage til fremkomsten af ​​en malign fænotype ved at modulere et sæt gener kritisk for progression trinnet carcinogenese.

diskussion

det er tidligere blevet observeret, at den reducerede CBX7 udtryk er forbundet med flere humane carcinomer, og det fuldstændigt tab af dens udtryk korrelerer med de mest fremskredne stadier af maligne lidelser [5] – [10]. Derfor er det rimeligt at hypotesen, at tabet af ekspressionen af ​​CBX7 kan spille en central rolle i udviklingen af ​​kræft. Konsekvent, CBX7 er i stand til at modvirke den nedsat ekspression af E-cadherin gen, hvis tab af ekspression betegner et træk ved den epitel-mesenkymale overgang [11], spille en kritisk rolle i opretholdelsen af ​​normal epitel-cellemorfologi [12], [13] .

for bedre at forstå den rolle tabet af CBX7 genekspression i kræft progression vores arbejde havde til formål at identificere de gener, der reguleres af CBX7. Derefter, ved anvendelse af en Affymetrix cDNA microarray analyserede vi genekspressionsprofilen af ​​skjoldbruskkirtlen carcinomaceller, hvori CBX7 ekspression blev gendannet, og identificeret adskillige gener op- og nedreguleres. Blandt generne opreguleret af CBX7 vi koncentrerede vores opmærksomhed på FOS, fosB og EGR1.

FOS og fosB er medlemmer af AP-1 (aktiverende protein 1) kompleks og er i stand til at interagere med medlemmer af juni familie [23]. FOS har været impliceret hovedsagelig i signaltransduktion, celledifferentiering og proliferation [24]. Mange undersøgelser rapporteret, at FOS modulerede flere vigtige gener for tumorigenese, forårsager nedregulering af tumorsuppressorgener [25] og føre til invasiv vækst af cancerceller [26]. nogle nyere undersøgelser antydet dog, at FOS også kan have tumor-suppressor-aktivitet og kan have en funktion i apoptose [17], [27].

Foruden FOS, fosB har også vist sig at have en funktion i progression af forskellige tumortyper bliver nedreguleret i ringe differentierede brystcarcinomer [18]. Omvendt FOSL-1 og FOSL-2, hvis overekspression fører til øget tumorcellemotilitet og invasion i brystkræft, tarmkræft og lungehindekræft [28], blev ikke reguleret af CBX7 (data ikke vist).