PLoS ONE: klinisk-patologisk Betydningen af ​​MicroRNA-214 i Gastric Cancer og dens effekt på Cell Biologisk Behaviour

Abstrakt

mere tyder, at mange microRNA’er er involveret i tumorigenese og progression af mavekræft, mens den kliniske betydning af microRNA-214 i mavekræft er dårligt forstået, og den nøjagtige rolle microRNA-214 i mavekræft stadig uklar. I den foreliggende undersøgelse blev ekspressionsniveauer af microRNA-214 i 80 gastriske carcinoma væv, 18 nontumourous gastriske væv og 4 typer af gastrisk cancercellelinjer kvantificeret ved revers transkription efterfulgt af real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR), og forholdet mellem microRNA-214 udtryk og cliniopathological karakteristika, herunder prognose blev udforsket. For at undersøge den potentielle rolle for microRNA-214 i mavekræft celle biologisk adfærd, vi udførte celleproliferation, apoptose, migration og invasion analyser i fire gastrisk cancer cellelinjer og en udødeliggjort gastrisk cellelinie

in vitro

. Vores resultater viste, at microRNA-214 dramatisk blev nedreguleret i gastrisk cancer væv og gastriske cancercellelinjer sammenlignet med nontumourous gastriske væv. Trinvis nedregulering af microRNA-214-ekspression blev observeret blandt nontumourous maveslimhinden, nonmetastasis mavekræft væv og metastase mavekræft væv. Ekspressionen af ​​microRNA-214 var signifikant omvendt korreleret med lymfeknudemetastaser og tumorstørrelse men havde ingen korrelation med patientens prognose. Ektopisk udtryk for microRNA-214 kunne hæmme celle migration og invasion evne i SGC7901 og MKN45 gastrisk kræftceller. Og knockdown af microRNA-214 signifikant lettere celleproliferation, migration og invasion i en celle-specifik måde i MKN28, BGC823 og GES-1-celler. Kolonistimulerende faktor 1 (CSF1) blev identificeret som et målgen af ​​microRNA-214. Sammenfattende vores data viste, at microRNA-214 er en lovende ny biomarkør for lymfeknudemetastaser i patienter med gastrisk cancer. Og vi identificeret, at nedregulering af microRNA-214 kan regulere proliferation, invasion og migration af gastriske kræftceller ved direkte målrettet CSF1

Henvisning:. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) klinisk-patologisk Betydningen af ​​MicroRNA-214 i Gastric Cancer og dens effekt på Cell Biologisk Behaviour. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10,1371 /journal.pone.0091307

Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget dateret 25. april 2013; Accepteret: 11 Februar 2014; Udgivet: 10 marts 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.172.351 og 81.372.856). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste dødsårsag kræft på verdensplan [1]. Trods store undersøgelser af tumorigenese og progression af GC, er patogenesen af ​​denne komplekse sygdom dårligt forstået. Det er således af afgørende kliniske værdi at identificere og karakterisere den præcise molekylære mekanisme involveret i udviklingen og progressionen af ​​gastrisk karcinom.

Foruden konventionelle genetisk og epigenetisk forandring af proteinkodende onkogener og tumor-suppressor gener i den carcinogenese af GC, proteinsk-kodende RNA, især microRNA (miRNA), har vist sig som en ny spiller at kaste lys over den mekanisme af GC udvikling [2]. MiRNA er endogene 19-25 nt ikke-kodende RNA, der negativt regulerer proteinekspression ved at fremme mRNA nedbrydning eller undertrykke protein oversættelse, gennem interaktion med 3′-UTR af target mRNA. Et stigende antal miRNA er blevet rapporteret at deltage i carcinogenese og udvikling af humane cancere, herunder GC [2] – [4]. Disse miRNA er normalt dysreguleret og funktion som enten tumor undertrykkere eller onkogener i indledningen og progression af humane carcinomer. For eksempel, Tsukamoto et al. har vist, at MIR-375 nedreguleres i gastrisk carcinom og udøver sin proapoptotiske virkning gennem nedregulering PDK1, en kinase, der phosphorylerer Akt, og til gengæld undertrykker PI3K /Akt pathway [5]. Mens MIR-21 har vist sig at fremme tumorproliferation og invasion i GC ved negativt at regulere vigtige tumorsuppressorer såsom PTEN, PDCD4, og RECK, og derefter give GC-celler med øget invasionsevne og evnen til at undgå anoikis [6] – [8 ]. Tidligere har vi fundet, at MIR-145 blev nedreguleret i mangfoldige humane cancerceller og undertrykt invasionen-metastase kaskade i GC ved at hæmme N-cadherin proteintranslation [9], [10].

På nuværende tidspunkt kliniske betydning af microRNA-214 (mIR-214) i prognosen for patienter med GC er dårligt forstået, og den præcise rolle af mIR-214 i GC fortsat uklar. Her undersøgte vi sammenhængen mellem miR-214 udtryk og cliniopathological parametre samt vurderet effekten af ​​miR-214 på biologiske adfærd, herunder celleproliferation, apoptose, migration og invasion af GC celler.

Materialer og metoder

Vævsprøver

Vævsprøver blev fremstillet på lignende måde som beskrevet tidligere [9]. Kort fortalt 80 prøver (fra 65 hanner, 15 hunner, 58,3 ± 17.49 og 61,5 ± 9,162 år gamle, henholdsvis) af GC væv blev opnået fra patienter, som gennemgik kirurgisk resektion på Qi Lu Hospital i Shandong University fra 2004 til 2006. Nontumourous maveslimhinden mere end 3 cm fra tumorer blev tilfældigt udvalgt fra 18 af disse patienter og anvendt som kontroller. Ingen af ​​patienterne fik præoperativ behandling, såsom strålebehandling eller kemoterapi. Prøver blev indtastet histologisk efter Laurens og World Health Organization (WHO) ‘s klassifikationer (IARC Press, Lyon, 2000), og kategoriseret i henhold til UICC 2002 TNM klassifikation.

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i School of Medicine, Shandong University, Shandong, Kina (godkendelse kode: 201.101.015). Vi opnåede skriftligt informeret samtykke fra alle deltagere, der er involveret i vores undersøgelse.

Cell kultur

Fire typer af humane GC cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (MKN28 og MKN45, Manassas, VA , USA) og Shanghai Cancer Institute (BGC823 og SGC7901, Shanghai, Kina). Den udødeliggjort maveslimhinden epitelial cellelinje GES-1 blev opnået fra Beijing ComWin Biotech Co, Ltd (Beijing, Kina). Cellerne blev holdt i RPMI 1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en befugtet inkubator celle med en atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

miRNA ekstraktion

Brug en miRNeasy FFPE Kit (Bioteke, Beijing, Kina), vi isoleret miRNA fra paraffinindlejrede væv i overensstemmelse med producentens anvisninger. Totalt RNA af cellelinjer blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol-reagens (Takara, Dalian, Kina) ved at følge fabrikantens protokol. Kvaliteten og mængden af ​​de RNA-prøver blev vurderet ved standard spektrofotometriske metoder (BioPhotometer plus; Eppendorf, Hamborg, Tyskland) og fortyndet til 2 ng /pl for RT-qPCR-analyse

revers transkription efterfulgt af real-tid. kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR)

miRNA ekspressionsniveauer blev kvantificeret under anvendelse af et SYBR Primescript miRNA RT PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) ifølge producentens instruktioner med et Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 Fast -tids system. Kort fortalt blev RNA-prøver konverteret til cDNA ved en One-trins Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, Kina), efterfulgt af real-time qPCR og normaliseret ved hjælp U6 lille nukleare RNA (RNU6B) af 2

-ΔCT metode. Primere til MIR-214 og U6 var fra GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Alle reaktioner blev kørt in duplo.

Cell transfektion

Eksponentielt voksende celler (1,5 x 10

5) blev podet i plader med 12 brønde 12 timer før transfektion og blev transficeret med 30 nM mIR-214-precursor (mIR-214), anti-mIR-214-inhibitor (mIR-214 inhibitor), eller den negative kontrol (Ambion, Austin, TX, USA) under anvendelse af X-tremeGENE transfektionsreagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) ifølge producentens anvisninger. Transfektionseffektiviteten blev overvåget ved RT-qPCR ved 24, 48 og 72 timer efter transfektion.

I stabil ekspression af MIR-214, SGC7901 og MKN45 celler blev transficeret med lentivirus MIR-214-udtrykkende vektor LV3-HSA -miR-214 eller en negativ kontrol LV3NC, som har GFP som en markør-protein, ifølge fabrikantens protokol (GenePharma, Shanghai, Kina). Tre dage efter transfektion blev ekspressionen af ​​GFP-protein overvåges under fluorescensmikroskop. De transficerede celler blev screenet med puromycin (1,5 ug /mL) for dem, der stabilt udtrykker MIR-214.

Celleproliferationsassay

Efter transfektion blev cellerne trypsineret, talt og podet på 96 Tja plader ved en densitet på 5 x 10

3 celler /brønd. Og derefter celleproliferation blev målt under anvendelse af edu proliferation assay som tidligere rapporteret [11]. Kort fortalt, 24 timer efter transfektion blev celler dyrket i tre eksemplarer ved 5 × 10

3 celler per brønd i 96-brønds plader dagen før edu inkubation (Ribobio, Guangzhou, Kina). Efter edu mærkning blev cellerne behandlet med 100 pi 1 × Apollo reaktion cocktail, farvet med 100 pi Hoechst 33342 (5 ug /ml) og visualiseret under et fluorescensmikroskop (Olympus, Japan). Procentdelen af ​​edu positive celler blev defineret som proliferationshastigheden. Data blev opnået fra tre uafhængige forsøg og præsenteres som middelværdi ± standardafvigelse (SD).

Cell apoptose assay

Tre dage efter transfektion af MIR-214 precursor eller inhibitor, celler blev opsamlet og farvet under anvendelse af Annexin V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit (BestBio, Shanghai, Kina) som tidligere beskrevet [12]. Kort fortalt blev cellerne trypsiniseret, opsamlet og derefter farvet under anvendelse af Annexin V-FITC /PI Apoptose Detection Kit i overensstemmelse med producentens anvisninger. Efter inkubering med Annexin V-FITC og PI blev de apoptotiske celler straks analyseret ved flowcytometri. Tidlig apoptotiske celler blev defineret som de, der var PI negative og Annexin V-FITC positive, mens sent apoptotiske celler var PI positive og Annexin V-FITC positive. Den samlede apoptotiske blev beregnet som den tidlige apoptotiske plus den sene apoptotiske sats. Annexin V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (Keygen, Nanjing, Kina) blev anvendt til apoptose-assay af lentivirusvektor transficerede celler, svarende til de ovennævnte protokoller. Hvert forsøg blev udført tredobbelt, og data blev præsenteret som middelværdier ± SD.

Cell migration og invasion assays

cellemigration og invasion assays blev udført som tidligere beskrevet [13]. Migration assay blev udført med Transwell skær med 8,0 mm porestørrelse membran (24-brønds format, Corning, New York, USA). For at måle invasion evne GC celler, de tidligere nævnte inserts blev præ-coatet med Matrigel matrix (BD Science, Sparks, MD, USA). Cellerne (1 x 10

5) blev resuspenderet i serum-frit medium og podet til det øvre kammer. De nedre kamre blev fyldt med komplet dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS. Efter inkubation ved 37 ° C i 24 timer blev de migrerede celler til stede på den nedre side af membranen fikseret, farvet og talt. Hvert eksperiment blev udført tre gange.

Luciferase assay

Dual-luciferase assays blev udført som tidligere beskrevet [9]. 3′-UTR fragmenter af CSF1 genet indeholdende MIR-214 bindingssted blev amplificeret ved PCR fra MKN45 celle-RNA under anvendelse af primerne i tabel S1, og indsat i Xba1-stedet i pmirGLO miRNA target ekspressionsvektor (Promega, San Lius Obispo, CA, USA). Den resulterende vektor blev navngivet pmirGLO-CSF1. For luciferase reporter assay blev MKN45 og BGC823 celler podet i en 12-brønds plade dagen inden transfektion. Cellerne blev co-transficeret med 30 nM MIR-214 precursor eller MIR-214-inhibitor, negativ kontrol og 30 ng pmirGLO-CSF1 ved hjælp af X-tremeGENE transfektionsreagens (Roche Applied Science). Efter 48 timer transfektion blev luciferaseaktivitet målt ved anvendelse af dobbelt luciferase assaysystem (Promega) og normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Hvert eksperiment blev udført tre gange.

Western blot-

48 timer efter transfektion med MIR-214 precursor eller inhibitor, blev celler underkastet western blot-analyse som tidligere [19] beskrevne. Kort beskrevet protein blev ekstraheret fra celler eller væv. Lysater blev opløst ved elektroforese, overført til nitrocellulosemembraner og blottet med antistoffer mod CSF1 (1:1000, Epitomics) eller β-actin (1:1000, Santa). Data blev indhentet fra tre uafhængige forsøg.

Statistisk analyse

Analyser blev udført ved hjælp af den statistiske pakke Prism 5 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Forskellene blev analyseret med Students

t

-test mellem to grupper eller med envejs ANOVA blandt tre grupper. Sammenhængen mellem miR-214 udtryk og tumorstørrelse i primær GC blev beregnet ved Spearman korrelation. I overlevelse kurve blev data analyseret af Log-rank test. For at bestemme, i hvilket omfang ekspressionen af ​​MIR-214 kunne effektivt adskille forskellige kliniske Underprogram, receiver operating characteristic (ROC) kurve analyse blev konstrueret og arealet under kurven (AUC) blev beregnet til at vurdere evnen af ​​MIR-214-ekspression til at differentiere mellem kræfttilfælde og nontumourous sager, og til at skelne metastatiske væv og nonnmetastatisk væv.

P

-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

MIR-214 nedreguleres i gastrisk karcinom væv og fire GC cellelinjer, sammenlignet med nontumourous maveslimhinden

i sammenligning med 18 nontumourous maveslimhinden prøver blev miR-214 signifikant nedreguleret (ca. seks gange) i 80 primære gastrisk vævsprøver (figur 1A,

P

= 0,0001). Modtageren opererer karakteristiske (ROC) kurver af miR-214 afspejlede en stærk adskillelse mellem GC væv og nontumourous væv, med et areal under kurven (AUC) af 0,7764 (figur S1A, 95% konfidensinterval (CI), ,6466-,9062). Konsekvent, nedregulering af miR-214 blev valideret i fire gastrisk cellelinjer. Som vist i figur 1C, blev miR-214 ekspressionsniveauet i GC cellelinjer MKN28, BGC823, MKN45, og SGC7901 markant svækkede sammenlignet med 18 nontumourous gastrisk vævsprøver (

P

0,05).

(A) i sammenligning med 18 nontumourous maveslimhinden blev miR-214 signifikant nedreguleret i 80 primære gastrisk væv (

P

= 0,0001). MIR-214-ekspression var e da lavere i primære gastrisk væv med metastase (metastase) end primære gastrisk væv uden metastase (Nonmetastais). (B) primære gastriske væv blev yderligere opdelt i en lav-metastase gruppe og en høj-metastase gruppe i forhold til antallet af lymfeknudemetastase. (Cutoff blev sat som seks, hvilket er en tærskel til at skelne N0~N1 og N2~N3 i TNM fase (UICC, 2002). MIR-214 blev dramatisk reduceret i høj metastase gruppe sammenlignet med lav-metastase gruppe (

P

= 0,0455). (C) mIR-214 nedregulering blev valideret i fire gastrisk cellelinjer. Sammenlignet med godt moderat differentieret cellelinje MKN28, miR-214 blev markant svækket i dårligt differentieret cellelinje MKN45 og BGC823, og moderat dårligt differentieret og meget metastatisk cellelinie SGC7901. Men opdaget vi lavere ekspression af miR-214 i GES-1, et udødeliggjort gastrisk epitelial cellelinje, sammenlignet med fire gastrisk kræftceller (

*

P

.. 0,05) (D) associering mellem miR-214 udtryk og tumorstørrelse i primær GC blev beregnet ved Spearman korrelation Vores data antydede, at miR-214 udtryk omvendt var korreleret med tumorstørrelse (Spearman r = -0,2673,

P

= 0,0083).

Men vi opdaget endnu lavere ekspression af miR-214 i GES-1, et udødeliggjort gastrisk epitelcelle linje, end i fire GC cellelinjer (figur 1C ,

P

0,05). Vi spekulere uoverensstemmelse kan skyldes mindst til dels til forskellen mellem kliniske prøver og cellelinier, fordi en cellelinie, isoleret fra en patient med en bestemt sygdom, repræsenterer miRNA ekspression underskrift kun en klinisk prøve og kan ændringer i løbet celle kultur

In vitro

; med andre ord, vævsprøver er meget mere som den humane sammenhæng end cellelinier. Således har vi kommentere, at miR-214-ekspression i humane GC væv var mere repræsentativt og troværdigt end der findes i cellelinjer.

Nedsat miR-214-ekspression i GC er forbundet med lymfeknude metastaser og tumor størrelse, men har ingen korrelation med patientens prognose

for at bestemme de mulige klinisk-patologiske konsekvenser af ændret miR-214 udtryk, vi kombineret de qPCR resultater og kliniske parametre. Korrelationer mellem MIR-214 ekspressionsniveauet og klinisk-patologiske karakteristika GC er opsummeret i tabel 1. MIR-214-ekspression blev omvendt korreleret med tumorstørrelse (tabel 1,

t

-test,

P

= 0,0265, Figur 1D, Spearman r = -0,2673,

P

= 0,0083) og lymfeknude metastaser (tabel 1, Figure1A,

t

-test,

P

= 0,0164). Men der var ingen signifikant forskel i andre klinisk-patologiske funktioner såsom køn, distal metastase, WHO histologisk klassifikation, og Laurens histologisk type, mellem disse to grupper.

Interessant, fandt vi trinvis nedregulering af miR-214 blandt nontumourous maveslimhinden, nonmetastasis væv og metastase væv (Figur 1A, en-vejs ANOVA,

P

= 0,0006). Til bedømmelse MIR-214-ekspression i GC som ny biomarkør for lymfeknudemetastaser blev ROC optegnes. Vi observerede klare adskillelser mellem patienter med lymfeknudemetastaser og dem uden lymfeknudemetastaser, med et AUC på 0,5880 (fig S1B, 95% CI, 0,4526-0,7166). De primære gastriske væv blev yderligere opdelt i en lav-metastase gruppe og en høj-metastase gruppe i forhold til antallet af lymfeknudemetastase (LNM): lavt metastase blev defineret som sager med mindre end seks LNM, og tilfælde med mere end seks LNM blev anset for høj metastase. Som forventet blev miR-214-ekspression faldet drastisk i high-metastaser gruppen sammenlignet med lav metastase gruppe (figur 1B,

P

= 0,045).

I overensstemmelse med den vævsprøve data, der sammenligner mIR-214-ekspression og LNM, fandt vi, at sammenlignet med den moderat veldifferentieret cellelinie MKN28, mIR-214-ekspression var markant mindre i de ringe differentierede cellelinier MKN45 og BGC823 og især metastatisk cellelinie SGC7901 [14] (

P

0,05)

Men vores data viste ingen signifikant forskel på miR-214-ekspression i 18 primære gastrisk vævsprøver og deres sekundære metastaser loci (figur 1B,. ,

P

= 0,2676). Disse resultater tyder på, at nedregulering af miR-214-ekspression forekom i den tidlige fase af LNM udvikling og forblev stabil uden yderligere dæmpning i sent tidspunkt i metastaser.

For yderligere at undersøge effekten af ​​miR-214 om prognosen for patienter, analyserede vi ekspressionsniveauerne af mIR-214 i tilfælde med forskellige tilbagefald status og betingelser for overlevelse. viste imidlertid, vores data, at der ikke var nogen udpræget forskel mellem tilbagefald gruppen og nonrelapse gruppe eller mellem overlevelse gruppen og død gruppen (figur 2A-B,

t

-test,

P

0,05). Af note, vi inddelt patienterne i høj ekspression og lav ekspression grupper baseret på medianen niveau af MIR-214-ekspression, og Kaplan-Meier-overlevelseskurver viste ingen signifikant korrelation mellem MIR-214-ekspression og tilbagefald overlevelse (figur 2C , hazard ratio (HR) 1,23, 95% konfidensinterval (CI) ,6596-2,285;

P

= 0,5781), eller samlet overlevelse (figur 2D, HR 1,20, 95% CI ,6667-2,151;

P

= 0,5832) hos patienter med GC.

(a) Vævsprøver blev opdelt i en release gruppe og en nonrelease gruppe efter udfaldet af patienterne. Vores data viste ingen signifikant forskel i MIR-214-ekspression mellem disse to grupper (

P

0,05). (B) Som i (A), med undtagelse af de kliniske prøver blev klassificeret som overlevelse gruppe og død gruppe (

P

0,05). (C, D) Vi inddelte patienter i høj-ekspression og lav ekspression grupper baseret på medianen niveau af MIR-214-ekspression. De Kaplan-Meier overlevelseskurver viste ingen signifikant sammenhæng mellem miR-214 udtryk og tilbagefald overlevelse (hazard ratio (HR) 1,23, 95% konfidensinterval (CI) 0,6596, 2,285,

P

= 0,5781), eller samlet overlevelse (HR 1,20, 95% CI 0,6667, 2,151,

P

= 0,5832), selvom der var en tendens til, at høj ekspression af miR-214 var forbundet med kortere tilbagefald overlevelse (median overlevelse: 28.00 måneder versus 74,50 måned, til High udtryk og lav udtryk, henholdsvis), eller samlet overlevelse (median overlevelse:. 40.00 måneder versus 47.50 måned, for High udtryk og Low udtryk, henholdsvis)

Effekt af miR-214 på celle spredning af GC celler

for at overvåge transfektionseffektivitet, vi bestemt miR-214-ekspression ved RT-qPCR ved 24, 48, og 72 timer efter transfektion i miR-214 forløber eller inhibitor transfekterede celler og løbende opdaget miR- 214 ekspression af lentivirus-vektorer behandlede celler i 4 uger. Som forventet, transfektion af miR-214 forløber resulterede effektivt i betydelig overekspression af miR-214 (figur S2A-B,

P

0,05) og miR-214-hæmmer påfaldende reduceret miR-214-ekspression i miR- 214 inhibitor-transficerede celler end de negative grupper (Figur S3E-F, figur S4 A,

P

0,05). Vi fandt også, at celler transficeret med lentivirusvektor LV3-HSA-MIR-214 kunne føre til en 7 til 96 gange skift af MIR-214 ekspression i SGC7901 og MKN45 celler (Figur S3A-D,

P

0,05), med 80% -90% celler, der udtrykker GFP markør protein (figur S3A, B)

for at bestemme om miR-214 kunne påvirke spredningen af ​​GC celler, Edu proliferation assay blev brugt til. detektere cellevækst evne. Vores data viser, at overekspression af MIR-214 med lentiviurs vektorer eller MIR-214 precursor ikke påvirkede cellevækst af SGC7901 (figur 3A-B, fig S2C-D, P 0,05) og MKN45 cellelinjer (figur S2E-F, figur S5A-B, P 0,05). Vi fandt imidlertid, at downregualtion af miR-214 kunne fremme udbredelsen af ​​BGC823 (figur 3C-D,

P

= 0,0010) og GES-1 (figur s4b-C,

P

= 0,0474), men ikke MKN28 cellelinje (Figur S5C-D,

P

= 0,0938), i en celle-specifik måde.

(a, C) Repræsentative billeder efter transfektion med lentivirus miR -214-udtrykkende vektor i SGC7901 celler og mIR-214 inhibitor i BGC823 celler (forstørrelse 100 x). (B, D) Procentdelen af ​​edu positive celler, beregnet af edu-mærkede celle (rød) antal i forhold til den samlede celleantal (Hoechst-farvede, blå), blev defineret som proliferationshastighed. Dataene viste ingen signifikant forskel i spredning på mellem LV3-HSA-miR-214-transficeret gruppe og den negative kontrolgruppe i SGC7901 celler (

P

0,05). Mens vi fandt, at miR-214-hæmmer transfektion kunne resultere i en markant øget spredning evne BGC823 celler (

P

= 0,0010).

rolle miR-214 i celle migration og invasion af GC celler

Som miR-214 udtryk omvendt var forbundet med lymfeknude metastaser, vi var især interesseret i evnen miR-214 til at påvirke celle migration og invasion. Vores resultater viste, at SGC7901 og MKN45 celler transficeret med LV3-HSA-MIR-214 viste en signifikant nedsat migration og invasion kapacitet sammenlignet med LV3NC behandlede celler (figur 4A-B, fig S6A-B,

P

0,05). Og vi observeret, at downregualtion af miR-214 kunne lette migration og invasion af MKN28 (figur 4C-D,

P

= 0,0491 og

P

= 0,0127, henholdsvis). Selv knockdown af miR-214 ikke påvirkede migration af GES-1 celler (Figur S4D-E,

P

= 0,0879), lyddæmpende af miR-214 førte til en stigning i de invasive egenskaber mere end 40% af disse celler (

P

= 0,0046). viste imidlertid, vores data, transfektion af miR-214 forløber ikke havde en robust effekt på celle migration og invasion i SGC7901 (Figur S2G-H,

P

0,05) og MKN45 (Figur S2I-J,

P

. 0,05) celler, sammenlignet med de respektive negative kontroller

(A, C) Repræsentative billeder af migration og invasion analyser i SGC7901 og MKN28 celler (forstørrelse 200 ×) er vist . (B, D) de migrerede celler blev talt ved at vælge fem felter i hvert kammer tilfældigt og beregne det gennemsnitlige antal. Vores resultater viste, at LV3-HSA-miR-214 transfektion markant nedsætte migration og invasion evne SGC7901 (

P

= 0,0143 og 0,0210, henholdsvis). Mens knockdown af miR-214 med miR-214-hæmmer fremmer cellulær migration (

P

= 0,0491) og invasion (

P

= 0,0127) i MKN28 celler.

Indflydelse af miR-214 på celle apoptose af GC celler

for at undersøge effekten af ​​miR-214 på celle apoptose, vi udførte apoptose analyser ved hjælp af Annexin V-FITC /PI farvning metode. Vores resultater viste, at overekspression (MIR-214 precursor og lentivirus vektor) og knockdown af MIR-214 ikke kunne påvirke celleapoptose naturligvis i forhold til negative kontroller i fire GC cellelinier (figur 5, figur S2K-N,

P

0,05) og immortaliseret gastrisk cellelinie GES-1 (data ikke vist). Faktisk fandt vi en tendens til pro-apoptose evne MIR-214 precursor i MKN45 cellelinje (figur S2M-N,

P

= 0,0606), men forskellen var ikke statistisk signifikant.

(A, C, E, G) Celler blev mærket med Annexin V-PE /7-AAD eller Annexin V-FITC /PI og analyseret ved flowcytometri. Alle disse tal er repræsentative for tre uafhængige assays. Quadrant statistik: nekrose eller mekanisk-skadede celler i øverste venstre (UL), sene apoptose celler i øverste højre (UR), levedygtige celler i nederste venstre (LL) og tidlige apoptose celler i nederste højre (LR). (B, D, F, H) Procentdelen af ​​tidlige apoptose celler, sent apoptose celler og totale apoptose celler blev sammenlignet mellem LV3hsa-miR-214 transficeret gruppe og NC-gruppe eller mellem miR-214 inhibitor-transficeret gruppe og inhibitoren NC gruppe. Vores data viste, at LV3-HSA-miR-214 eller miR-214-hæmmer har ingen effekt på celle apoptose i SGC7901, MKN45, MKN28 og BGC823 celler (

P

0,05). Selvom vi observeret en tendens til pro-apoptose evne miR-214 i MKN45 cellelinje dog forskellen var ikke statistisk signifikant (

P

= 0,0950).

MiR- 214 rettet mod direkte og nedregulerer CSF1 i gastriske kræftceller

for at identificere mål af miR-214, vi brugte Targetscan algoritme til at forudsige miR-214 mål i human gastrisk cancer. Blandt de mange mulige kandidater, vi plukket ud dem overudtrykt i kræft og spredningsfølsomme og metastase-associerede gener, herunder NOTCH2, FGFR1, CSF1 (figur 6A), AGAP2, CREB1, til yderligere analyse. Vores resultater viste, at MIR-214 precursor transfektion væsentligt reduceret aktiviteten af ​​et luciferase reportergen fusioneret til CSF1 3′-UTR, med 29,60% og 30,61% reduktion i forhold til de negative kontrolgrupper (figur 6B,

P

= 0,0227 og 0,0093, henholdsvis for MKN45 og BGC823 cellelinjer). Ud fra følgende betragtninger når miR-214-inhibitor blev transficeret, blev luciferaseaktivitet steget med 34,49% og 42,25% i MKN45 og BGC823 celler sammenlignet med kontrollerne (figur 6C,

P

= 0,0115 og 0,0085, henholdsvis).

(A) de komplementære sekvenser af CSF1 mRNA 3′-UTR er vist med mIR-214-sekvens. (B) Luciferaseaktivitet i MKN45 og BGC823 celler transficeret med miR-214 og pmirGLO-CSF1 var signifikant afdøde sammenlignet med de negative kontroller (

P

= 0,0227 og 0,0093, henholdsvis). (C) Efter miR-214-inhibitor blev transficeret, luciferaseaktiviteten blev dramatisk forøget i MKN45 og BGC823 celler sammenlignet med kontrollerne (

P

= 0,0115 og 0,0085, henholdsvis). (D) Virkningen af ​​MIR-214 på CSF1 niveauer blev testet i GC cellelysater ved Western blot. (E). Vores data viser, at den relative CSF1 ekspression blev signifikant reduceret i celler transficeret med MIR-214 precrusor sammenlignet med celler transficeret med negativ kontrol (

P

= 0,0037 og 0,0066, henholdsvis).

Vi yderligere bestemmes ekspressionen af ​​CSF1 protein ved western blot i GC-celler transficeret med mIR-214 precursor eller inhibitor. I overensstemmelse med luciferase resultater, ekspressionen af ​​CSF1 protein blev signifikant reduceret i SGC7901 og MKN45 celler (figur 6D-E,

P

= 0,0037 og 0,0066, henholdsvis) transficeret med MIR-214 precursor og voksede i MKN28 og BGC823 celler (Figur S7A-B,

P

= 0,0049 og 0,0416, henholdsvis) transficeret med miR-214-hæmmer, sammenlignet med de respektive kontroller. Disse data antydede, at miR-214 hæmmer CSF1 oversættelse i gastriske kræftceller.

Diskussion

Emerging beviser har fremhævet den afgørende betydning af miRNA dysregulering på tumorudvikling af humane karcinomer [3], [4] . MiRNA dysregulering fremmer celleproliferation, giver resistens over for apoptose, og forbedrer invasionsevne og metastase, gennem at undertrykke de nedstrøms tumorsuppressorer eller inducere akkumulering af target onkogener, og således er involveret i initiering, progression, og metastase af humane tumorer.

Blandt de mange miRNA, dysregulering af miR-214 blev fundet i masser af menneskelige kræftformer [15] – [22]. Nedregulering af miR-214 i livmoderhalskræft er blevet rapporteret af flere grupper, og miR-214 har vist sig at hæmme væksten, migration og invasion af livmoderhalskræft celler ved målretning onkogener MEK3, JNK1, plexin-B1, og GALNT7 [15 ] – [17]. MIR-214 har også vist sig at være nedsat i brystkræft og bidrage til breast tumorigenese ved at tillade aberrerende forhøjet onkogen EZH2 akkumulering og efterfølgende ukontrolleret celleproliferation og invasion [18]. [28].