PLoS ONE: MRE11-mangel forbundet med forbedret langsigtet sygdom overlevelse og samlet overlevelse I en undergruppe af trin III tyktarmskræft Patienter i randomiseret CALGB 89.803 Trial

abstrakt

Formål

coloncancere deficiente i fejlparringsreparation (MMR) kan udvise formindsket ekspression af DNA-reparation genet,

MRE11

, som følge af kontraktion af en T

11 mononukleotid tarmkanalen. Dette studie undersøgte MRE11 status og dens forbindelse med prognosen, overlevelse og narkotika respons hos patienter med stadium III tyktarmskræft.

Patienter og metoder

Kræft og Leukæmi gruppe B 89.803 (Alliance) randomiseret 1264 patienter med stadium III tyktarmskræft til postoperative ugentlige adjuverende bolus 5-fluorouracil /leucovorin (FU /LV) eller irinotecan + FU /LV (IFL), med 8 år opfølgning. Tumorer fra disse patienter blev analyseret for at bestemme stabiliteten af ​​en T

11 tarmkanalen i

MRE11

gen. Det primære endepunkt var samlet overlevelse (OS), og et sekundært effektmål var sygdomsfri overlevelse (DFS). Ikke-proportionale farer blev behandlet ved hjælp af tidsafhængige kovarianter i Cox-analyser.

Resultater

Af 625 tumor sager undersøgte, 70 (11,2%), udstillet sammentrækning ved T

11 tarmkanalen i den ene eller begge

MRE11

alleler og blev derfor forventes at være mangelfuld i MRE11 (dMRE11). I poolet behandling analyser viste dMRE11 patienter oprindeligt reduceret DFS og OS, men forbedret langsigtet DFS og OS sammenlignet med patienter med en intakt MRE11 T

11 tarmkanalen. I undergruppen med dMRE11 patienter behandlet med IFL, en uforklarlig tidlig stigning i dødeligheden, men bedre langsigtet DFS end IFL-behandlet pMRE11 patienter blev observeret.

Konklusioner

Analyse af dette relativt lille antal af patienter og begivenheder viste, at dMRE11 markør forudsiger bedre prognose uafhængig af behandling på lang sigt. I undergruppe analyser, dMRE11 patienter behandlet med irinotecan udviste uforklarlig dødelighed kort sigt. MRE11 status er let analyseres, og kan derfor vise sig at være en nyttig prognostisk markør, forudsat at resultaterne rapporteret her for et relativt lille antal patienter kan generaliseres i selvstændige analyser af større antal prøver.

Prøve registrering

ClinicalTrials.gov NCT00003835

Henvisning: Pavelitz T, Renfro L, Foster NR, Caracol A, Welsch P, Lao VV, et al. (2014) MRE11-Mangel forbundet med forbedret langsigtet sygdom overlevelse og samlet overlevelse i en undergruppe af trin III tyktarmskræft Patienter i randomiseret CALGB 89.803 Trial. PLoS ONE 9 (10): e108483. doi: 10,1371 /journal.pone.0108483

Redaktør: Pierlorenzo Pallante, Institut for Eksperimentel Endokrinologi og Onkologi G. Salvatore ‘(IEOS), Italien

Modtaget: Marts 26, 2014 Accepteret: August 19, 2014; Udgivet: 13. oktober 2014

Copyright: © 2014 Pavelitz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Forskning rapporterede her blev støttet af National Institutes of Health National Cancer Institute P01 CA077852 (WBG, PSR, RJM, NM); og NIH F31 GM073318 og HHMI MedIntoGrad Scholar Awards (AC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige cancer og den næsthyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald i USA, efter lungecancer [1]. Der vil være en anslået 143.000 nye tilfælde i USA i 2013, og mere end 51.000 dødsfald som følge af denne kræftform. Det er vigtigt at identificere markører der rapporterer om sygdomsprognose.

Ligesom mange andre former for kræft, CRC er kendetegnet ved mangler i DNA-reparationsveje, der kan påvirke udviklingen af ​​tumoren, dens respons på kemoterapi og overlevelse i på kort og lang sigt [2]. Ca. 15% af sporadisk CRC og mest arvelige CRC er kendetegnet ved mangelfuld mismatch repair (MMR-D), som også er almindelig i andre cancere, herunder endometrial og gastriske tumorer [3] – [5]. MMR-D CRC indregnes som en særskilt patologisk og klinisk underklasse, med bedre langsigtet prognose men muligvis begrænset respons på standard adjuverende kemoterapi bestående af 5-fluorouracil (FU) og leucovorin (LV) [2], [6], [ ,,,0],7].

Mangelfuld MMR hæver somatisk mutation sats og destabiliserer simpel sekvens gentager eller mikrosatellitter, som igen kan påvirke gensekvens og genfunktioner [8]. Mangelfulde MMR kan påvirke prognosen direkte eller indirekte, ved at ændre funktionen af ​​et andet gen eller gener. En konsekvens af mangelfuld MMR er sammentrækning af en T

11 tarmkanalen i intron 4 i

MRE11

gen, hvilket er tydeligt i over 60% af MFR-D CRC [9] – [11]. T

11 polypyrimidine tarmkanalen fremmer lasso dannelse i splejsning af exon 4 til exon 5 i MRE11 udskrift. Sammentrækning af denne tarmkanalen svækker splejsning, hvilket resulterer i exon skipping og syntese af et mRNA bærer en out-of-frame stopkodon. Dette mRNA koder for et trunkeret MRE11 polypeptid, med potentielt dominant negativ virkning på funktionen af ​​det normale protein [12]. Status for

MRE11

T

11 tarmkanalen kan let bestemmes af den standard kliniske assay anvendes til at bestemme MMR status baseret på ustabilitet af neutrale mikrosatellitmarkører [13].

MRE11- mangel kan påvirke både klonal evolution inden for en tumor samt terapeutisk respons. MRE11 danner en bestanddel af højt konserveret MRE11 /RAD50 kompleks, som er afgørende for DNA dobbelt-strenget pause reparation medieret af både homolog rekombination og ikke-homolog endesammenbinding, for telomer vedligeholdelse, og til signalering som respons på DNA beskadigelse [14 ] – [18]. MRE11 kan især påvirke respons på topoisomerase 1 giftstoffer, som fungerer ved at fange normalt forbigående covalent binding, som topoisomerase 1 formularer med DNA for at slappe supercoiling. Denne klasse af lægemidler omfatter den naturligt forekommende forbindelse camptothecin og dets derivater irinotecan og topotecan. MRE11 er stærkt bevaret, og genetisk analyse i gæren,

S. cerevisiae

, har vist, at MRE11-mangel forårsager ekstrem følsomhed over for camptothecin [19]. In vitro, oprenset rekombinant MRE11 /RAD50 kan spalte den kovalente tyrosyl-DNA binding dannet af topoisomerase 1 og resektion DNA ende til reparation [20]. Hertil kommer en begrænset undersøgelse af fem CRC cellelinier fandt, at dem, der var MRE11 /RAD50-mangel var mere følsomme over for irinotecan [21], men ikke afgøre, om irinotecan modstand kunne genoprettes ved at supplere MRE11 /RAD50-mangel /.

De observationer sammenfattet ovenfor fører til to hypoteser. For det første kan MRE11-mangel være en nyttig markør for tumor prognose; og for det andet kunne at MRE11-mangel (dMRE11) tumorer reagerer bedre på behandling med topoisomerase 1 giftstoffer end MRE11-dygtige (pMRE11) tumorer. Disse muligheder var af særlig interesse på grund af parathed med hvilken MRE11 status kan analyseres under standard kliniske molekylær profilering [13].

Nytten af ​​irinotecan er blevet vurderet til adjuverende behandling af fase III CRC i en to arm Kræft og leukæmi gruppe B (CALGB) 89.803 klinisk forsøg, der sammenlignede DFS og OS hos patienter behandlet med FU /LV alene eller i kombination med irinotecan. Ingen forskel i OS eller DFS blev rapporteret generelt, men patienter med MMR-D tumorer udviste noget forbedret og udvidet DFS hvis behandlingen omfattede irinotecan [22]. Dette forsøg derfor tilvejebragt informative prøver til at tage spørgsmålet om, hvorvidt MRE11 status korreleret med DFS, OS, eller med respons på irinotecan. For at afgøre, om MRE11 status forudsiger DFS, OS, eller respons på IFL, vi analyserede MRE11 status i 625 tumor prøver fra patienter i det kliniske CALGB 89.803 forsøg, både generelt og ved behandling med FU /LV behandling med eller uden irinotecan, mens tegner sig for potentielle relationer med andre patientkarakteristika herunder MMR

Materialer og metoder

protokollen for dette forsøg og støtte CONSORT tjekliste er tilgængelige som underbyggende oplysninger.; se protokollen S1 og Tjekliste S1.

studiepopulation

Patienterne i denne undersøgelse blev deltagerne i NCI-sponsorerede Kræft og leukæmi gruppe B (CALGB) adjuverende behandling retssag for fase III tyktarmskræft sammenligner terapi med den ugentlige Roswell Park regimen af ​​5-fluorouracil (FU) og leucovorin (FU /LV) med den ugentlige bolus irinotecan-dosis, FU, og leucovorin (CALGB 89.803; [23]). I alt 1264 patienter blev rekrutteret mellem april 1999 og april, 2001. Alle patienter blev komplet kirurgisk resektion og begyndte kemoterapi mellem postoperative dag 21 til 56. Patienterne blev randomiseret ved computeren til to behandlingsgrupper, 629 patienter til FU plus LV og 635 patienter til irinotecan plus FU plus LV (figur 1). Det primære endepunkt var samlet overlevelse (OS). Sygdomsfri overlevelse (DFS) var sekundært endpoint. Opfølgning blev fanget i marts, 2008.

Oversigt over CALGB 89.803 randomiseret forsøg, der genererede de 625 prøver testes.

Etik erklæring

Undersøgelsen var godkendt af Mayo Clinic Institutional Review Board og North Central Kræftbehandling Group (nu en del af Alliance for kliniske forsøg i Oncology). CALGB protokol 89.803 blev gennemgået af den institutionelle gennemgang bestyrelse hver deltagende center. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke før deltagelse.

Trial struktur og organisation

Dette forsøg blev udført af CALGB med deltagelse fra North Central Kræftbehandling Group, National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group, Eastern Cooperative Oncology Group, Southwest Oncology Group, og National Cancer Institute Kræft Trials Support Unit. Protokollen og listen over deltagende websteder er tilgængelige som underbyggende oplysninger. Den CALGB data sikkerhedsovervågning bord revideret sikkerhedsdata to gange om året og effektdata ved protokol-specificerede intervaller i overensstemmelse med CALGB politik. Den CALGB statistiske Center på Duke University i Durham, NC, fastholdt den kliniske og laboratorie-database.

Behandling

Efter central registrering, egnede patienter blev randomiseret (ved computeren, ved hjælp af et randomiseret fast blok design) for at modtage FU /LV eller FU /LV i kombination med irinotecan (IFL). Behandling er tidligere blevet beskrevet detaljeret [24]. Kort fortalt FU /LV gruppe modtog Roswell Park regimen, der består af ugentlige LV 500 mg /m

2 intravenøst ​​over 2 timer, med en bolus af FU 500 mg /m

2 ved intravenøs injektion 1 time efter initiering af LV, i 6 på hinanden følgende uger efterfulgt af 2 ugers hvile, i fire cykler (32 uger). Den IFL gruppe modtog ugentlig irinotecan 125 mg /m

2 over 90 minutter umiddelbart efterfulgt af intravenøse bolus injektioner af LV 20 mg /m

2, så FU 500 mg /m

2, i 4 på hinanden følgende uger efterfulgt af en 2 ugers pause, fem cykler (30 uger).

DNA-ekstraktion

DNA blev ekstraheret fra arkiveret formalinfikseret paraffinindlejret tumorvæv ved at inkubere paraffin-ekstraheret, rehydreret væv i 50 mM Tris-HCI (pH 8,5) med 0,5% Tween 20 og 20 mg /ml proteinase K i 3 timer ved 55 ° C; eller ved inkubering af vævet i Instagene (BioRad, Hercules, CA) og 30 mg /ml proteinase K i 3 timer ved 55 ° C. Efter inkubationen blev prøven derefter inkuberet ved 95 ° C i 9 minutter, vortexbehandlet kort, og derefter underkastet centrifugering for at pelletere enhver ufordøjet materiale eller Instagene hhv. Det ekstraherede DNA blev herefter overført og lagret ved -20 ° C indtil brug for PCR baserede assays.

Bestemmelse af

MRE11

RAD50

længder mononukleotid tract

mononukleotidbyggeblokken tarmkanalen længde blev bestemt ved PCR-amplifikation og DNA-sekventering, under anvendelse af en veletableret fremgangsmåde almindeligt anvendt til at karakterisere heterogeniteten i mononukleotid skrifter karakteristiske af MMR-defekte colorectal, gastriske og endometriske tumorer, og ikke tydeligt i normalt væv eller MMR -proficient tumorprøver (f.eks [9] – [11], [25]). Assayet involverer PCR-amplifikation af området transporterer mononukleotid tarmkanalen, efterfulgt af DNA-sekvensanalyse. Denne samme enkle procedure anvendes til at vurdere mikrosatellit instabilitet diagnostisk for fejlparringsreparationsmangel.

I alt 625 prøver genereret DNA egnet til analyse af regionen

MRE11

intron 4 indeholdende T

11 tarmkanalen, 320 fra FU /LV undersøgelse arm og 305 fra IFL arm (figur 1).

Nested PCR-primere blev anvendt til at amplificere en region, der indeholder mononukleotid tarmkanalen af ​​interesse i MRE11 intron 4. MRE11 amplifikation var med første runde primere, MRE11 × 1F, 5′-GTGGTCATATGCCAATGTAGATTATGC-3 ‘, og MRE11 × 1R, 5′-CCCTGTGGGATCGTCATGATTGCC-3′, producerede et 211 bp produkt; og med anden runde primere, MRE11 × 2F, 5’-GGAGGAGAATCTTAGGGAAAACAGC-3 ‘, og MRE11 × 2R, 5′-GATTGCCATGAATACTAAACACTGG-3’, producerede et 139 bp produkt. MRE11 blev sekventeret i både fremad og tilbage med den anden runde PCR-primere.

RAD50 status blev bestemt for 34 CRC’er med sammentrækninger i

MRE11

. Forstærkning var med første runde primere R50 × 1F, 5′-CTCCCAGTTCATTACTCAGC-3 ‘, og R50 × 1R, 5′-GACAGGGCATACCAGCT-3′, produceret et 326 bp produkt; og med anden runde primere R50 × 2F, 5’-GCTAACAGACGAAAACCAG-3 ‘, og R50 × 2R, 5′-CATACCAGCTCAGAGTCC-3′, producerede en 301 bp produkt. RAD50 blev sekventeret i omvendt orientering med primer 5’-CATACCAGCTCAGAGTCC-3 ‘.

MRE11 status og RAD50 status blev bestemt ved visuel inspektion af kurver fra automatiseret sekventering i både fremad og baglæns retning ved efterforskere blindet til MMR-status , som var blevet bestemt uafhængigt [22], [26]. Resultaterne er vist i tabel 1 og 2.

Bestemmelse af MMR status

MMR status tumorprøver var tidligere blevet bestemt af IHC, suppleret i nogle tilfælde ved analyse af mikrosatellit stabilitet ved hjælp af Bethesda panel markører [22], [26]. MMR status for en delmængde af prøver blev uafhængigt bekræftet i et blindet analyse ved PCR-amplifikation og sekventering 5 mikrosatellitmarkører (Promega, Madison, WI). Prøver blev klassificeret som MFR-D, hvis 3 eller flere markører udstillet ustabilitet.

Statistiske metoder

Målet med denne undersøgelse var at bestemme, om tumor MRE11 status var forbundet med resultat for patienter med stadium III coloncancer behandlet enten med FU /LV alene eller i kombination med irinotecan. De fælles primære endepunkter var OS, målt fra indtræden på det kliniske forsøg, indtil død uanset årsag; og DFS, målt fra studiet, indtil dokumenteret progression af sygdom eller død uanset årsag. OS og DFS distributioner blev anslået samlet og inden for definerede kategorier af MRE11 og behandling, hjælp Kaplan-Meier-metoden. Forskelle i OS og DFS mellem grupper blev testet ved hjælp af log-rank test. Virkningerne af MRE11 på OS og DFS blev analyseret ved hjælp af Cox proportional farer modeller. Hvor Cox proportional hazards antagelse var signifikant krænkes ifølge fremgangsmåden af ​​Grambsch og Therneau [27], tidsvarierende koefficienter blev indført gennem automatiseret udvælgelse af en eller flere beskæringspunkter på tidsaksen, som igen optimalt opfyldte proportional hazards antagelse i en stykkevis måde [28]. Den potentielle prædiktive evne MRE11 blev udforsket gennem to-vejs interaktioner med behandling arm, og gennem delvise interaktioner, når effekten af ​​MRE11 blev modelleret som tidsafhængig. Interaktioner, der var både statistisk signifikant (p 0,01) og tolkes klinisk relevans skulle indgå meningsfuldt prædiktiv evne MRE11. Multivariable Cox modeller blev anvendt til at undersøge MRE11 virkning samtidig med at kontrollere for behandling og clinicopathologic faktorer, herunder alder, køn, tumorplacering, performance status, antallet af positive lymfeknuder, tumor stadium, og tumorklassificering. Potentielle MRE11 interaktioner med og justeringer af MFR, KRAS, og BRAF blev også undersøgt. Med henblik på denne analyse blev opfølgning begrænset til 8 år. Alle statistiske analyser blev udført af Alliancens statistikere.

Resultater

Bestemmelse af MRE11 status

Tumor DNA egnet til PCR-amplifikation blev ekstraheret fra i alt 625 CRC prøver, 320 fra FU /LV-gruppen og 305 fra ILV gruppen (Consort Diagram, figur 1). De 625 eksemplarer udgør 49% af de 1264 patienter indskrevet på CALGB 89.803 [23]. Regionen

MRE11

intron 4 indeholdende T

11 tarmkanalen blev amplificeret og sekventeret (figur 2A), ved anvendelse af en veletableret assay (for eksempel [9] – [11], [25]). Eksempler viser sekvenser af en kontrolprøve med ensartet T

11 skrifter på begge alleler, og af prøver, hvori begge alleller gennemførte 10 nt skrifter, eller skrifter spænder fra 10-11 eller 9-11 nt (figur 2B). Tract længde heterogenitet ikke var en PCR eller sekventering artefakt, som længden heterogenitet ikke var tydelig i DNA fra normale celler, og længder identiske tract blev udledt fra sekventering af et enkelt prøve i begge retninger (ikke vist). Heterogenitet kunne afspejle tilstedeværelsen af ​​flere sub-klonede populationer i tumoren.

(A) Diagram over

MRE11

intron 4 /exon 5 vejkryds, der viser T

11 tarmkanalen i intron 4, flankerende sekvens og primere. Sammentrækning af T

11 tarmkanalen forringer lasso-dannelse trin i mRNA-splejsning og fører til spring i exon 5. Den resulterende mutant mRNA koder for et trunkeret MRE11 polypeptid med potentielt dominant negativ effekt på proteinfunktion [12]. MRE11 er afgørende for cellelevedygtighed, og

MRE11

mutationer, der forekommer i MMR-D CRC er ikke null alleler men reducere udtryk og aktivitet af MRE11 protein. (B) Sekvens spor af regionen

MRE11

intron 4, der bærer T

11 tarmkanalen i fire tumorprøver. Længder af skrifter i nt vist til venstre

Cases blev bedømt på grundlag af antallet af nukleotider tabt ved sammentrækning:. En 11 nt tarmkanalen blev scoret som 0; en 10-11 nt tarmkanalen som 1; skrifter af 9-11 nt som 2; og skrifter af 10 nt (på grund af tab af 1 nt på hver allel) som 2. I alt 555 tilfælde (89%) gennemføres en intakt T

11 tarmkanalen (score 0); mens 70 tilfælde (11%) havde sammentrækninger af 1-6 nt i længde (1 nt, n = 36; 2 nt, n = 26; 3 nt, n = 6; 4 nt, n = 1; og 6 nt, n = 1). Den samlede hyppighed af

MRE11

T

11 sammentrækninger var 11%, sammenlignelig at rapporteret i andre analyser af CRC prøver [9] – [11], [25]. Ca. lige mange tilfælde udviste sammentrækninger af en nt (36 sager, 5,8%) eller 2 eller flere nt (34 tilfælde, 5,8%). På grund af en ubalance af sager uden sammentrækninger versus enhver sammentrækning, og det lille antal tilfælde i hver sammentrækning kategori, definerede vi en dikotomisk

MRE11

T

11 tarmkanalen variabel: ingen sammentrækninger eller MRE11 dygtige (pMRE11 , 555 tilfælde) versus enhver sammentrækning eller MRE11 mangelfuld (dMRE11, 70 tilfælde). Ved hjælp af denne dikotomiseret klassificering,

MRE11

T

11 tarmkanalen sammentrækning status blev fundet at være signifikant associeret med tumor, histologisk klasse, MMR status, og BRAF, KRAS, og P53 mutation status (tabel 2).

Bestemmelse af RAD50 status

i nogle MMR-D CRC, en exon a

9 tarmkanalen i

RAD50

gen destabiliseret, hvilket medfører en rammeskiftmutation og syntese af et trunkeret protein [29]. I en eksplorativ analyse, vi bestemt denne frekvens blandt tumor DNA ekstraheret fra 34 CRC’er med sammentrækninger i

MRE11 Hotel (18 tilfælde med MRE11 score på 1, og 16 med snesevis af 2).

RAD50

A

9 tarmkanalen var ustabil i 11/34 tilfælde (3 med MRE11 snesevis af 1 og 8 med snesevis af 2) eller 32% af CRC’er analyserede, svarende til frekvensen af ​​40% tidligere rapporteret [11].

Bestemmelse af MMR status

MMR status for alle CALGB 89803 prøver var tidligere blevet bestemt ved IHC, genomisk sekventering med Bethesda panel markører eller begge [26]. Denne analyse er klassificeret MMR som intakt (MMR-I) i 86% af prøverne, og mangelfuld (MMR-D) i 14% (Tabel 1). Ustabilitet af

MRE11

T

11 tarmkanalen blev stærkt forbundet med MMR-mangel således bestemte: 79% af dMRE11 CRC’er var MMR-D, og ​​21% MMR-I (chi-squared test, p 0,0001 ;. tabel 2)

i en eksplorativ analyse blev MMR status separat bestemt ved PCR og sekventering ved University of Washington (UW) klinisk diagnostisk facilitet, udelukkende ved hjælp af kommercielle primere (Promega), der afhøre forskellige neutral og ikke -polymorphic markører end Bethesda panel markører. blev analyseret i alt 83 CRC’er, herunder 63 af de 70 dMRE11 prøverne. Af disse blev 50 CRC klassificeret som MFR-D af CALGB og 56 af UW (chi-squared test, p 0,0001).

Ustabilitet på

MRE11

T

11 tarmkanalen og

RAD50

A

9 tarmkanalen forventes at korrelere med MMR-D. For at få en fornemmelse af, om de forskellige analyser, der bruges af CALGB og UW måske over-count eller under-tæller MMR-D tumorer, vi spurgte, om de 9 CRC klassificeret som MFR-I ved CALGB analyser, men som MFR-D af UW assayet var dMRE11 eller pMRE11. Alle disse var dMRE11, og to af dem var også dRAD50. Dette rejser muligheden for, at

MRE11

T

11 tarmkanalen kan med fordel blandt markører til bestemmelse af MMR-status.

Tumor MRE11 status er betydeligt prognostisk for DFS og OS

forholdet mellem MRE11 status og DFS og OS blev bestemt ved hjælp af data fanget i marts 10, 2008, svarende til en median opfølgning på 6,0 år. Univariate analyser af OS og DFS udelukkende er baseret på MRE11 status for de 625 CRC’er analyseret uafhængigt af kemoterapeutiske regime, viste, at dMRE11 patienter udviste ingen signifikant forbedring i OS (HR 0,98; 95% CI, 0,64-1,51) eller DFS (HR 0,80; 95% CI, 0,52-1,21) i forhold til pMRE11 patienter. Men Kaplan-Meier-kurver over OS og DFS ved MRE11 status (figur 3) afslørede en mulig overtrædelse af proportionale farer antagelse, med de to kurver krydser under opfølgningsperioden for hvert endepunkt. Ikke-proportionalitet blev statistisk bekræftet, med nulhypotesen af ​​proportionale farer afvist både DFS (p = 0,0038) og OS (p = 0,0005)

(A) sygdomsfri overlevelse for dMRE11 (n = 70.; begivenheder = 24); 5-års rate: 67% (95% CI: 56-79%) vs. pMRE11 (n = 555; hændelser = 240); 5-års rate: 59% (95% CI: 55-63%). (B) Samlet overlevelse for dMRE11 (n = = 70; arrangementer = 23); 5-års rate: 68% (95% CI: 58-80%) vs. pMRE11 (n = 555; hændelser = 194); 5-års rate: 71% (95% CI: 67-75%).

For at løse dette overtrædelse af Cox modelantagelser, en stykkevis proportional hazard model blev konstrueret for hver effektparameter (DFS og OS), hvilket resulterer i tidsafhængige koefficienter (timer) for MRE11 status, som følger. Første, en elektronisk søgning algoritme over et gitter af tidspunkter {T

1 = 0,1 år, t

2 = 0,2 år, …, t

79 = 7,9 år} blev anvendt til at identificere beskæringspunkts t * for hvilket den forholdsmæssige farer antagelse var optimalt tilfreds på begge sider af beskæringspunkts; specifikt er t * defineret som værdien af ​​t giver den største maksimeret log delvis sandsynlighed blandt Cox modeller indeholdende separate MRE11 effekter (timer) for de to tidsintervaller defineret af t. Stykkevis proportionalitet blev derefter testet og bekræftet i de endelige modeller for OS og DFS, der producerer den endelige (univariate) modeller for MRE11. De samme beskæringspunkter og tidsafhængige koefficienter blev brugt i den efterfølgende interaktion og multivariable Cox modellerne.

Det optimale cut-point identificeret til OS var 3,4 år. Før 3,4 år, dMRE11 patienter oplever markant dårligere OS i forhold til pMRE11 patienter (HR = 10,95, 95% CI: 6,83 til 17,55, p 0,0001), mens dMRE11 efter 3,4 år er forbundet med forbedret OS (HR = 0,09, 95% CI: 0,02-0,37, p = 0,0008), uafhængig af behandling arm. Cut-point identificeret for DFS var 3,3 år. Før 3,3 år, blev dMRE11 forbundet med dårligere resultater (HR = 7,02, 95% CI: 4,49 til 10,99, p 0,0001), mens DFS efter 3,3 år er forbedret i forhold til pMRE11 patienter (HR = 0,07, 95% CI: 0,02 til 0,30, p = 0,0002). MRE11 status forblev betydelig samlet når der korrigeres for klinisk /tumor variable (alder, køn, antal positive lymfeknuder, tumor stadie, kvalitet og stedet for primær tumor).

I forhold til andre patientgrupper biomarkører, MRE11 hæfter signifikant i multivariable modeller med KRAS (OS og DFS), BRAF (OS og DFS), og P53 mutation status (OS). Desuden MRE11 fortsat en betydelig prædiktor for både OS (p 0,0001) og DFS (p 0,0001) efter justering for MFR, mens MFR er ikke signifikant i disse modeller (DFS p = 0,799; OS p = 0,647). Ingen signifikante interaktioner mellem MRE11 og biomarkører blev observeret.

univariate analyser for RAD50 status viste ingen signifikant sammenhæng med OS eller DFS. Kovariat justeret modeller for RAD50 blev ikke udført på grund af den begrænsede stikprøvestørrelse (n = 34) og lille antal hændelser.

Vurdering af tumor MRE11 status som prædiktiv gavn fra IFL og FU /LV

MRE11 status blev vurderet som en potentiel prædiktor fordel fra IFL gennem delvise interaktioner med behandling i stykkevis Cox (ikke-proportionale farer) modeller for DFS og OS. Kaplan-Meier plot for MRE11 effekt præsenteres ved behandling arm i figur 4A, mens grunde til det tilsvarende behandlingseffekt præsenteres af MRE11 status i figur 4B. Mens nogle forskelle i behandlingseffekt ved MRE11 status er umiddelbart synlige, behandling-for-MRE11 interaktion var ikke signifikant for hverken endepunkt. Blandt irinotecan-behandlede patienter (figur 4A, højre), dog dMRE11 patienter udviste værre DFS end pMRE11 patienter i det første år af follow-up (baseret på en delmængde valgt cut-point; p 0,0001), men forbedrede resultater derefter (p = 0,004). Tilsvarende dMRE11 patienter var en øget risiko for død for de første 3,5 år af follow-up i forhold til pMRE11 patienter (p 0,0001), og derefter nedsat risiko (p = 0,011). Disse relationer fortsat betydelig, når der korrigeres for alder, køn, nodal status, tumor stadie, grad, og stedet for primær tumor, men bør betragtes denne undergruppe analyse blandt IFL-behandlede patienter som forsøgsfiskeri betragtning af den lille prøvestørrelse og ikke-betydning behandling-af-MRE11 interaktion

(A) Top:. sygdomsfri overlevelse for dMRE11 vs. pMRE11 behandlet med FU /LV [n = 320; dMRE11 n = 31; begivenheder = 11; 5-års rate: 67% (95% CI: 52-86%); pMRE11 n = 289; begivenheder = 122; 5-års rate: 61% (95% CI: 56-67%)] eller med IFL [n = 305; dMRE11 n = 39; begivenheder = 13; 5-års rate: 67% (95% CI: 53-83%); pMRE11 n = 266; begivenheder = 118; 5-års rate: 57% (95% CI: 51-63%)]. Nederst: Samlet overlevelse for dMRE11 vs. pMRE11, behandlet med FU /LV [n = 320; dMRE11 n = 31; begivenheder = 10; 5-års rate: 70% (95% CI: 55-89%); pMRE11 n = 289; begivenheder = 98); 5-års rate: 73% (95% CI: 68-79%)] eller med IFL [n = 305; dMRE11 n = 39; begivenheder = 13; 5-års rate: 67% (95% CI: 53-83%); pMRE11 n = 266; begivenheder = 96; 5-års rate: 69% (95% CI: 63-75%)]. (B) Top: sygdomsfri overlevelse for IFL vs. FU /LV behandlet dMRE11 [n = 70; IFL n = 39; begivenheder = 13; 5-års rate: 67% (95% CI: 53-83%); FU /LV n = 31; begivenheder = 11; 5-års rate: 67% (95% CI: 52-86%)] eller pMRE11 (n = 555; IFL n = 266; hændelser = 118, 5-års rate: 57% (95% CI: 51-63% ; FU /LV n = 289; arrangementer = 122, 5-års rate: 61% (95% CI: 56-67%)] Nederst:. Samlet overlevelse for IFL vs. FU /LV-behandlede dMRE11 [n = 70; IFL n = 39; arrangementer = 13, 5-års rate: 67% (95% CI: 53-83%); FU /LV n = 31; arrangementer = 10, 5-års rate: 70% (95% CI: 55-89%) eller pMRE11 [(n = 555; IFL n = 266; arrangementer = 96, 5-års rate: 69% (95% CI: 63-75%); FU /LV n = 289; arrangementer = 98 ; 5-års rate:. 73% (95% CI: 68-79%)]

diskussion

Denne analyse af behandlede udfald i en kohorte af fase III CRC behandlede patienter med FU /LV eller IFL viste, at efter kontrol for uventede ikke-proportionale farer, MRE11 status er betydeligt prognostisk for både DFS og OS, og forbliver signifikant, når der korrigeres for clinicopathologic variabler og offentliggjort betydelige markører såsom MMR, KRAS, BRAF, og p53. Desuden efter justering for MMR, MRE11 fortsat en betydelig prognostisk markør, mens det omvendte er ikke tilfældet. I en eksplorativ undergruppe analyse blev MRE11 status forbundet med forskelle i OS og DFS blandt patienter behandlet med IFL. Sidstnævnte fund er klinisk interessant, men baseret på en relativt lille antal patienter, og kunne yderligere undersøgt i indskrive større antal patienter. Effekten på respons bedst kan vurderes i en undersøgelse af fase IV patienter med målbar metastatisk sygdom, selv om det har vist sig ved mange lejligheder, at virkningerne af anti-tumor behandlinger adskiller mellem fase III og fase IV sygdom.

MMR status havde tidligere vist sig at være både en prognostisk markør [2], [6], [7] og forudsigelse af respons på IFL forhold til FU /LV [22]. I lyset af den tætte sammenhæng mellem dMRE11 og MMR-D status her bemærkes, er det ikke overraskende, at de prognostiske og prædiktive mønstre for de to markører parallelle hinanden. Men i multivariable prognostiske modeller til DFS eller OS indeholder begge mærker, MRE11 men ikke MMR status forblev stærkt statistisk signifikant under både tidlige og sene perioder. Således ikke betydning MRE11 status afspejler ikke sin afhængighed af MFR-status.

Det skal bemærkes, at dMRE11 patienter behandlet med IFL udstillet bedre langsigtet DFS end pMRE11 patienter i den samme behandling arm, selv om dMRE11 patienter havde en uforklaret øget mortalitet i de første 2 år efter behandling. Der var ingen sammenhæng mellem dårlig første reaktion og kliniske faktorer som alder, køn eller nodal status. Behandling med irinotecan strækker sig over kun 30 uger mens forskellen i respons ikke bliver tydelige før senere (figur 4), så tidlig behandling-associeret toksicitet alene er usandsynligt at forklare denne forskel.

Analysen af ​​MRE11 funktion i svaret på irinotecan blev foretaget på grundlag af resultaterne af grundlæggende mekanistiske undersøgelser viser, at MRE11 /RAD50 bidrager til reparation af DNA-skader fremkaldt af topoisomerase 1 giftstoffer [19], [20]. Topoisomerase 1 giftstoffer (som irinotecan) og topoisomerase 2 giftstoffer (som etoposid) begge fremmer dannelsen af ​​protein-DNA addukter, som er cytotoksiske, hvis ikke repareret. Nogle indsigt i den betydelige kortsigtede dødelighed blandt dMRE11 patienter behandlet med irinotecan kan tilvejebringes ved undersøgelser af mus mangelfuld enzymet TDP2, som reparerer skader fremkaldt af topoisomerase 2 giftstoffer [30].