PLoS ONE: Den rolle BMP signalering Antagonist Noggin i udviklingen af ​​prostatakræft Osteolytiske Bone Metastasis

Abstrakt

Medlemmer af protein familier BMP og Wnt spille en relevant rolle i fysiologisk og patologisk knogleomsætning. Ekstracellulære antagonister er afgørende for graduering af deres aktivitet. Manglende ekspression af BMP-antagonisten noggin af osteoinduktive, carcinom-afledte cellelinjer er en determinant for osteoblast respons induceret af deres knoglemetastaser. I modsætning hertil osteolytiske, carcinoma-afledte cellelinjer udtrykker noggin konstitutivt. Vi antager, at cancercelle-afledte noggin kan bidrage til patogenesen af ​​osteolytiske knoglemetastaser af faste cancere ved at undertrykke knogledannelse. Intraossøse xenografter af PC-3 prostatacancerceller induceret osteolytiske læsioner karakteriseret ikke blot ved forøget osteoklastisk medieret knogleresorption, men også ved nedsat osteoblast-medieret knogledannelse. Derfor i denne model, afkobling af knoglen remodeling proces bidrager til osteolyse. Knogledannelse bevaret i osteolytiske læsioner induceret af noggin-lyddæmpet PC-3-celler, hvilket antyder, at cancer celleafledt noggin forstyrrer fysiologisk knogle kobling. Endvidere blev væksten af ​​noggin-lyddæmpet PC-3-celler intraossøse tumor begrænset, sandsynligvis som følge af den vedvarende osteoblastaktiviteten. Denne undersøgelse giver nye beviser for en model af osteolytiske knoglemetastaser hvor konstitutiv sekretion af noggin af cancerceller medierer inhibering af knogledannelse og forhindrer derved reparation af osteolytiske læsioner frembragt af et overskud af osteoklast-medieret knogleresorption. Derfor kan noggin undertrykkelse være en roman strategi til behandling af osteolytiske knoglemetastaser

Henvisning:. Secondini C, Wetterwald A, Schwaninger R, Thalmann GN, Cecchini MG (2011) Den rolle BMP Signaling Antagonist Noggin i udviklingen af ​​prostatakræft osteolytiske knoglemetastaser. PLoS ONE 6 (1): e16078. doi: 10,1371 /journal.pone.0016078

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: September 13, 2010; Accepteret: December 6, 2010; Udgivet: 13 januar 2011

Copyright: © 2011 Secondini et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Europa-Kommissionen (CANCURE-2006 til 020.970 og PRIMA-504.587) og fra den schweiziske National Foundation (3200-068.409,02). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Skeletal metastaser er en almindelig klinisk manifestation i patienter fremskreden fase, der lider af prostatakræft (CaP) [1], [2] og brystkræft (CAM) [3]. Knoglemetastaser er den vigtigste årsag til sygelighed hos disse patienter med smerter og komplikationer, herunder patologiske frakturer, rygmarv og nerve kompression kræver analgesi, bestråling og ortopædkirurgi, alle forbundet med betydelige omkostninger [4].

på metastatisk site, tumorceller forstyrrer fysiologiske knoglehomøostase styres af osteoblaster og osteoklaster. CaM knoglemetastaser tendens til at fremkalde et osteolytiske respons, hvorimod CaP-metastaser prevalently er forbundet med en osteosclerotic reaktion [5], [6]. Begge typer af læsioner kompromittere skelet integritet og i sidste ende føre til patologiske frakturer.

De nøjagtige mekanismer, der bestemmer osteolytiske og osteosclerotic læsioner i knoglemetastaser er ikke klart defineret endnu. Den fremherskende koncept viser, at kræftceller udskiller et overskud af parakrine faktorer stimulerer direkte eller indirekte osteoclast eller osteoblast rekruttering, hvilket fører til ubalanceret overskud af knogleresorption eller dannelse henholdsvis [7], [8].

Det er bredt accepteret, at den osteolytiske reaktion i knoglemetastaser resultater fra et overskud af osteoklastisk medieret knogleresorption. Cancerceller frigiver paradigmatiske “osteolytiske” cytokiner, såsom parathyroidhormon-beslægtet protein (PTHrP), receptoraktivator af NF-B-ligand (RANKL), interleukin-8 (IL-8) og kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1) direkte eller indirekte ansvarlig for stigningen i osteoklast rekruttering, aktivitet og overlevelse. Efterfølgende frigivelse af vækstfaktorer fra knoglen matrix brændstoffer kræft cellevækst, hvilket igen yderligere stimulerer knogleresorption, og dermed fastholde processen og etablere en “ond cirkel” [5], [9]. Denne hypotese giver rationalet for hæmning af knogleresorption som terapeutisk indgreb i vækst progression i osteolytiske knoglemetastaser. Men farmakologiske hæmning af knogleresorption har kun en minimal eller ingen positiv effekt på heling af osteolytiske læsioner [10]. Dette tyder stærkt på, at ud over en forøgelse af osteoclast-medieret knogleresorption, anden mekanisme (r) bidrager til osteolyse.

osteolytisk læsion i myelomatose (MM) er ikke kun resultatet af en osteoklast-medieret stigning i knogleresorption [11], men også af en afkobling af knogleremodellering proces bestemmes af et fald i osteoblast-medieret knogledannelse [12], [13]. Adskillige antagonister af Vingeløse (Wnt) signalvejen, såsom Dickkopf-1 (Dkk-1), secerneret Frizzled-relateret protein (SFRP) -1 og -2, er overudtrykt af MM-celler og kan bidrage til inhibering af Wnt-medieret osteoblast rekruttering og derfor at undertrykkelse af knogledannelse [11], [14], [15]. Dette synspunkt er yderligere bekræftes af eksperimentel dokumentation for, at blokering af Dkk-1-aktivitet redder knogledannelse i dyremodeller af MM [16].

Tidligere vi har rapporteret, at osteoinduktive og osteolytiske potentiale

in vivo

af CaP og Cam cellelinjer kan defineres

in vitro

ved deres differential udtryk ikke blot osteolytiske cytokiner, men også af BMP antagonisten noggin. Osteoinduktive cancer cellelinjer mangler Noggin udtryk, og den funktionelle relevans af dette fund blev understreget ved at vise, at noggin tvunget udtryk i en osteoinduktivt CaP cellelinje afskaffer osteoblast reaktion fremkaldt af dens knoglemetastaser

in vivo

. Omvendt konstitutive noggin udtryk

in vitro

synes at være kendetegnende for osteolytiske hætte og CaM cellelinjer [17]. Vi argumenterede derefter, analogt med hvad der er blevet fundet for Dkk-1 i MM, kan konstitutiv noggin frigivelse ved osteolytiske cancerceller bidrager via inhibering af knogledannelse, at den osteolytisk læsion i knoglemetastaser af faste cancere.

for at teste denne hypotese, vi først udforsket, om inhibering af knogledannelse er en bestanddel af osteolytiske læsioner, der induceres i knogler xenotransplanterede med den humane CaP cellelinie PC-3. Vi undersøgte derefter, om kort hårnål RNA (shRNA) -medieret noggin undertrykkelse i PC-3 celler, konstitutivt udskiller dette protein [17], kunne bevare knogledannelse i osteolytiske læsioner.

De osteolytiske læsioner i knoglerne xenotransplanterede med PC-3-celler viste morfologiske og histomorfometriske parametre for øget osteoklast-medieret knogleresorption og nedsat osteoblast-medieret knogledannelse. I modsætning hertil blev der knogler xenotransplanterede med noggin-lyddæmpet PC-3 celler præget af strukturelle og histologiske ændringer indikerer knogledannelse /reparation aktivitet. Derfor noggin undertrykkelse i osteolytisk cellelinien PC-3 synes at bevare knogledannelse, der normalt følger knogleresorption, som en effekt af “kobling fænomen”. Omvendt kræftcelle-udskilt noggin forhindrer reparation af osteolytiske læsioner ved frakobling knogledannelse fra osteoklastisk medieret knogleresorption, der er stimuleret af kræft celle-afledt osteolytiske cytokiner.

Resultater

Silencing af noggin mRNA og protein-ekspression i PC-3 /F

luc

Cell klon af shRNA

den menneskelige osteolytisk CaP cellelinie PC-3, konstitutivt udtrykker BMP antagonisten noggin [17], blev først transfekteret med en luciferase-kodende vektor for at generere

luc Salg -positive kloner. En celle-klon, PC-3 /F

luc

, blev valgt baseret på et stabilt

luc

udtryk og på genekspression profil

in vitro

, tumor tage og knogle reaktion efter intraossøst podning

in vivo

svarer til dem af forældrenes PC-3 celler (figur S1).

PC-3 /F

luc

klon blev efterfølgende transficeret med en kombination af tre forskellige noggin-specifikke shRNA eller med en ikke-målrettet shRNA at udlede noggin knock-down (Nog-KD) og negativ kontrol (mock) kloner, henholdsvis. To Nog KD kloner (Nog-KD 14 og Nog-KD 17) blev udvalgt på grundlag af den betydelige reduktion af noggin-mRNA-ekspression, sammenlignet med PC-3 /F

luc

celler (figur 1A). Immunoblotanalyse af noggin proteinsekretion i kultursupernatanten fra Nog-KD-kloner 14 og 17 viste en reduktion på 93% og 98%, henholdsvis (figur 1B). Mock 5 klon viste en stigning i noggin mRNA-ekspression. Imidlertid blev noggin proteinekspression i denne klon og i mock 4 ikke påvirket.

A. Noggin-mRNA-ekspression i PC-3 /F

luc

celler, non målretning-vektor-transficerede kloner (mock 4 og 5) og Noggin-KD-kloner (Nog-KD 14 og 17). MRNA ekspressionsniveauer (+/- SD) er kvantificeret ved real-time RT-PCR og normaliserede til p-actin som endogen kontrol; mRNA niveau i PC-3 /F

luc

celler er sat som 100%; middelværdien af ​​2 til 3 uafhængige eksperimenter er vist. ***

P

0,001, Nog-KD-kloner

versus

PC-3 /F

luc

og mock-kloner. B. Noggin protein, der udskilles i konditioneret medium (CM) fra PC-3 /F

luc

, mock og Nog-KD-kloner. Ækvivalente mængder af proteiner fra koncentreret CM blev immunoblottet med anti-noggin antistof. Ækvivalent protein lastning blev bekræftet ved farvning med Coomassie blå det samlede proteinindhold i CM.

Cell spredning og udtryk for osteotropic faktorer i Noggin-lyddæmpet PC-3 /F

luc

celler

in vitro

Cell spredning

in vitro

af de mock og Nog-KD-kloner blev ikke påvirket, i forhold til forældrenes PC-3 /F

luc

(figur 2A).

A.

In vitro

spredning af mock og Nog-KD-kloner blev målt ved BrdU inkorporering i 4 dage og sammenlignet med PC-3 /F

luc

celler. Gennemsnitlige værdier af 3 uafhængige forsøg udført i firdobbelte brønde (+/- SD). B. Ekspression af Dkk-1, PTHrP, RANKL, CSF-1 og IL-8 mRNA. mRNA ekspressionsniveauer (+/- SD) er kvantificeret ved real-time RT-PCR og normaliserede til p-actin som endogen kontrol. MRNA-ekspression niveauet i PC-3 /F

luc

celler er sat som 100%; middelværdien af ​​2 til 3 uafhængige eksperimenter er vist. *** P 0,001, mock og Nog-KD 17 kloner

versus

PC-3 /F

luc

og Nog-KD 14 kloner

. for at efterprøve om noggin lyddæmpning ville påvirke mRNA-ekspression af relevante osteotropic faktorer, udtryk for Dkk-1, PTHrP, RANKL, CSF-1 og IL-8 blev også undersøgt (figur 2B). Udtrykket på Dkk-1 og PTHrP blev ikke ændret i alle transfekterede kloner, sammenlignet med PC-3 /F

luc

. Konsekvent med tidligere undersøgelser i forældrenes PC-3 celler [17], RANKL udtryk var ikke målbart i PC-3 /F

luc

, mock og Nog-KD-kloner. CSF-1 var moderat opreguleret i alle mock og Nog-KD-kloner, selvom højden ikke nåede signifikans. IL-8-ekspression var betydeligt højere i de falske kloner og især i Nog-KD 17.

Det er blevet vist i osteoblaster

in vitro

at ekspression af noggin BMP-afhængig, hvilket indikerer, at en sandsynlig feedback-mekanisme er nødvendig for at opretholde en BMP /noggin balance, hvilket begrænser BMP handling på disse celler [23]. En lignende tilbagemeldinger er også blevet rapporteret i nogle prostata cancer-afledte cellelinjer [17], [24]. MRNA ekspression af BMP-2, -3, -6 og -7 var ikke påvirket hos begge Nog-KD-kloner sammenlignet med parentale PC-3, mens BMP-4-mRNA var ikke påviselig i både parentale og Nog-KD-celler (ikke vist). Derfor noggin silencing i PC-3 celler ændrer ikke hverken niveauet eller spektret af deres BMP udtryk.

Effekt på knogle

in vivo

af Noggin-lyddæmpet PC-3 /F

luc

celler

et første eksperiment blev afsluttet på dag 25 efter injektion for alle grupper af dyr, mens der i en følgende forsøg observationsperioden for Nog-KD-kloner blev forlænget til 33 dage. I begge forsøg blev radiografiske analyse detekteret indtræden af ​​en tilsvarende osteolytisk reaktion i alle grupper af cancercellelinier bærende knogler så tidligt som dag 14 efter tumorcelle xenografting (ikke vist). På dag 21 alle xenotransplanteret tibia stadig viste et tilsvarende antal og udvidelse af osteolytiske læsioner, og en forstørrelse af knoglen akslen, sammenlignet med sham-opererede skinneben. Men i tibia xenotransplanteret med Nog-KD-kloner den resterende knogle indskudt mellem områder af osteolyse viste nogle tegn på en mere radio-tætte aspekt (fig S2). I det første forsøg, både røntgen og μ-CT rekonstruktion udført ved afslutningen af ​​forsøget (dag 25) viste videreudvikling af overvejende osteolytiske læsioner hos PC-3 /F

luc-

mock clone- forsynet skinneben (figur 3A og B). I modsætning hertil i skinnebenene xenotransplanteret med Nog-KD-kloner en tydelig stigning i radiodensiteten af ​​den resterende knogle og desuden udvikling af knogle spiculae rager uden for cortex blev uvægerligt observeret (figur 3A og B). I det andet forsøg observationsperioden blev forlænget med henblik på at muliggøre progression af knoglen respons. Dyrene podet med PC-3 /F

luc

klon havde brug for at blive ofret på dag 23 på grund af alvorlig osteolyse af de xenotransplanterede knogler og hævelse af benet, og på tegn på smerte og lidelse. I modsætning hertil knogler xenotransplanterede med Nog-KD-kloner viste en mere konserveret strukturel integritet og en mindre udtalt hævelse af lemmer, uden nogen tegn på smerte og lidelse. Derfor dyrene xenotransplanteret med Nog-KD 17 og Nog-KD 14 kloner blev holdt i en periode på 30 og 33 dage. Konsekvent med udviklingen af ​​knoglen respons observeret i det første forsøg, viste skinneben xenotransplanteret med Nog-KD-kloner forbedret radiodensiteten af ​​den resterende knogle og udtalt knogle spiculae rager uden for cortex (figur S3A og B).

A . Repræsentative billeder af radiografi og B. 3-D rekonstruktion (μ-CT) af tibiae (øverst) og af 1 mm tykke tværsnit (nederst) af sham-opererede og cancercelle-xenotransplanteret tibia på dag 25 efter intraossøse inokulering.

Ændring af knogle strukturelle parametre induceret

in vivo

af Noggin-lyddæmpet PC-3 /F

luc

celler

Kvantitativ μ-CT analyse bekræftede, at skinnebenene xenotransplanteret med PC-3 /F

luc

og falske kloner havde signifikant lavere BV /TV-forhold end de sham-opererede dem. Tværtimod skinnebenene inokuleret med Nog-KD-kloner havde højere BV /TV ratio end med PC-3 /F

luc

og falske kloner og var ikke forskellig fra de sham-opererede dem (figur 4A) .

A. Forholdet mellem knogle volumen over totalvolumen (BV /TV, +/- SD) blev bestemt ved μ-CT på dag 25 efter tumorceller inokulering;

n

= 6-7 dyr i hver forsøgsgruppe. ***

P

0,001, mock 5

versus

Nog-KD-kloner og humbug; **

P

0,01, Nog-KD 14

versus

PC-3 /F

luc

og mock 4; *

P

0,05, humbug og Nog-KD 17

versus

PC-3 /F

luc mock 4. B. Totalt knoglemineralindhold

(TBMC; mg /mm +/- SD) blev målt ved pQCT på dag 25 efter tumorceller inokulering;

n

= 6-7 dyr i hver forsøgsgruppe. ***

P

0,001, mock 5

versus

Nog-KD 14; *

P

0,05, humbug og Nog-KD 17

versus

mock 5, og Nog-KD 14

versus

mock 4.

Totalt knoglemineralindhold målt ved pQCT var lavere i skinnebenene xenotransplanteret med PC-3 /F

luc

og falske kloner, sammenlignet med de skinopererede dem, men signifikans blev nået kun for mock 5 -xenografted knogler. I modsætning samlede knoglemineralindhold i Nog-KD-kloner-xenotransplanteret skinneben var højere end i PC-3 /F

luc

og falske kloner-xenotransplanterede dem, men nåede kun betydning sammenlignet med de falske kloner (figur 4B).

Histomorfometri

i skinnebenene xenotransplanteret med PC-3 /F

luc

og mock-kloner der var en betydelig stigning i osteoklast antallet og procentdelen af ​​overfladen er dækket af osteoklaster, sammenlignet med sham-opererede tibia (figur 5A og C). Dette blev ledsaget af et signifikant fald i osteoblast antallet og procentdelen af ​​overfladen er dækket af aktive osteoblaster (figur 5B og D).

A. Antal osteoklaster (N.Oc /BS; /mm, +/- SD) på endosteale overflade i trabekulære og kortikale knogle af sham-opererede skinneben eller på anden knogle ved siden af ​​kræftceller af tibia xenotransplanteret med PC-3 /F

luc

, mock og Nog-KD-kloner.

n

= 6-7 dyr i hver forsøgsgruppe. ***

P

0,001, PC-3 /F

luc

og falske kloner

versus

humbug, og mock kloner

versus

Nog- KD 17; **

P

0,01, Nog-KD 17

versus

PC-3 /F

luc,

Nog-KD 14

versus

PC -3 /F

luc

og mock-kloner. B. Antal osteoblaster (N.Ob /BS; /mm, +/- SD) på endosteale overflade i trabekulære og kortikale knogle af sham-opererede skinneben eller på anden knogle ved siden af ​​kræftceller af tibia xenotransplanteret med PC-3 /F

luc

, mock og Nog-KD-kloner.

n

= 6-7 dyr i hver forsøgsgruppe. ***

P

0,001, PC-3 /F

luc

og falske kloner

versus

Nog-KD-kloner, og mock 4

versus

humbug; **

P

0,01, fingeret

versus

PC-3 /F

luc

mock 5; *

P

0,05, Nog-KD 14

versus

humbug. C. Andel af endosteale overflade i kortikal og trabekulær knogle besat af osteoklaster (Oc.S /BS,%, +/- SD) i sham-opererede og kræft celle-xenotransplanteret tibia.

n

= 6-7 dyr i hver forsøgsgruppe. ***

P

0,001, mock kloner

versus

humbug og Nog-KD-kloner, og PC-3 /F

luc versus

humbug og Nog-KD 17 ; **

P

0,01, Nog-KD 14

versus

PC-3 /F

luc

. D. Andel af endosteale overflade i kortikal og trabekulær knogle besat af osteoblaster (Ob.S /BS,%, +/- SD) i sham-opererede og kræft celle-xenotransplanteret tibia.

n

= 6-7 dyr i hver forsøgsgruppe. ***

P

. 0,001, PC-3 /F

luc

og falske kloner

versus

fingeret og Nog-KD-kloner

skinnebenene xenotransplanteret med Nog-KD-kloner viste signifikant lavere antal osteoklaster og procentdel af overfladen dækket af osteoklaster end dem xenotransplanteret med PC-3 /F

luc

og falske kloner (figur 5A og C). Omvendt viste de en betydeligt højere antal aktive osteoblaster og procentdel af overfladen er dækket af osteoblaster end dem podet med PC-3 /F

luc

og mock-kloner. I Nog-KD-kloner-xenotransplanterede skinneben var antallet af osteoblaster højere end i sham-opererede tibia, men denne forøgelse var væsentlig kun for Nog-KD 14 (figur 5B og D). Trods det faktum, at mRNA-ekspressionen af ​​IL-8, vides at stimulere osteoklast rekruttering, var signifikant opreguleret

in vitro

i Nog-KD 17 klon, sammenlignet med Nog-KD 14 klon, der var ingen tydelig forskel i osteoklast tal mellem knoglerne xenotransplanterede med de to Nog-KD-kloner. Dette tyder på, at forskellen i IL-8 mRNA-ekspressionen var funktionelt irrelevant.

Vækst egenskaber

in vivo

af Noggin-lyddæmpet PC-3 /F

luc

celler

Tumor tage var 100% for alle xenotransplanterede kloner. Ugentlig overvågning og kvantificering af intraossøst tumorvækst ved BLI viste, at i begge forsøg, noggin undertrykkelse i kræftceller havde en moderat indflydelse på deres spredning

in vivo

. I første omgang, de Nog-KD-kloner voksede på samme måde som PC-3 /F

luc

mock kloner. Men deres vækst gradvist bremset og de kunne ikke nå samme tumor byrde for PC-3 /F

luc

og mock-kloner (figur 6). I det andet forsøg, hvor tumorvækst blev overvåget i længere perioder, blev en vækststandsning endda observeret (fig S3C).

Bioluminescent signal (fotoner +/- SD), der afgives fra cancercellen-xenotransplanteret skinneben blev kvantificeret på dag 7, 14, 21 og 25 efter intraossøse inokulation af tumorceller;

n

= 6-7 dyr i hver forsøgsgruppe. ***

P

0,001, Nog-KD-kloner

versus

PC-3 /F

luc dele på dag 25; *

P

0,05, Nog-KD 14

versus

PC-3 /F

luc dele på dag 21.

metastatisk potentiale af noggin-lyddæmpet PC-3 /F

luc

celler

for at undersøge, om noggin lyddæmpning påvirker metastatisk evne PC-3 celler blev systemiske metastaser induceret ved injektion i venstre hjerte- ventrikel.

kinetik udvikling, og antallet af knoglemetastaser pr mus 28 dage efter intra-hjerte-injektion af Nog-KD 17 celler adskilte sig ikke fra at induceret af PC-3 /F

luc

og falske kloner (ikke vist). Efter intra-hjerte-injektion af PC-3 /F

luc

celler udvikler systemiske knoglemetastaser asynkront med variabel knogle sites, hvilket gør vanskelig en direkte sammenligning af radiografiske aspekt og vækst progression af metastatiske læsioner på samme knogle sted blandt forskellige dyr. Endvidere PC-3 /F

luc

celler, ligesom den parentale PC-3, næsten uvægerligt metastaserer til kæben, hvilket hæmmer den ernæringsmæssige status af dyrene og dermed begrænse længden af ​​den eksperimentelle observation. Disse ulemper forhindrede os at kontrollere, om i denne model knoglen respons og tumorvækst induceret af Nog-KD-klon fremskridt lige til dem, der observeres i intraossøse model.

Diskussion

Her vi viser for første gang, at i PC-3 xenograft model af osteolytiske knoglemetastaser stigningen i antal osteoklaster er associeret med forringelse osteoblast antal og aktivitet. Dette indikerer, at osteolytisk læsion er ikke blot et resultat af forøget knogleresorption, men også af en yderligere inhibering af knogledannelse. Vi viser også, at shRNA-medieret suppression af den konstitutive ekspression af BMP-antagonisten Noggin i PC-3-celler, uden at forstyrre værten mikromiljø-afledte noggin, genskaber osteoblast nummer og knogledannelse in knoglelæsioner induceret af disse celler. Følgelig er knoglereaktion konverteret fra et rent osteolytiske til en blandet osteoblastiske /osteolytisk én. Kollektivt giver disse resultater hidtil ukendte beviser hvilket kraftigt antyder, at noggin sekretion af CaP-celler medierer inhiberingen af ​​osteoblast rekruttering /aktivitet. Den resulterende inhibering af knogledannelse forhindrer reparation af osteolytiske læsion genereret af cytokin-stimuleret, osteoclast-medieret knogleresorption. Konsekvent med dette begreb, kan noggin udgør en potentiel terapeutisk mål i osteolytiske CaP knoglemetastaser.

De molekylære mekanismer, der styrer osteoblastiske og osteolytiske respons i knoglemetastaser ved solide kræftformer er genstand for intensiv efterforskning. I osteolytiske svar, har opmærksomheden været overvejende fokuseret på ekstracellulære faktorer og signalveje, der medierer krydstale mellem tumorceller og knoglen mikromiljø, der fører til den onde cirkel af tumor spredning og knogleresorption [25]. Denne hypotese postulerer, at faktorer som PTHrP [26], RANKL [27] og IL-8 [28] udskilles af kræftceller og stimulere osteoklast rekruttering og aktivitet. Den deraf følgende stigning i knogleresorption frigiver matrix-indlejrede vækstfaktorer, såsom insulin-lignende vækstfaktor (IGF) og transformerende vækstfaktor beta (TGF-β), som på sin side fremme yderligere vækst kræftcelle.

indflydelsen af ​​kræftceller på osteoblast rekruttering og aktivitet er blevet undersøgt næsten udelukkende i MM. Paradigmatiske molekyler inducerer direkte osteoblast rekruttering og dermed knogledannelse, er medlemmer af proteinfamilier BMP og Wnt. Ekstracellulære antagonister er afgørende for modulering af deres aktiviteter [29]. I en skelsættende undersøgelse er det blevet påvist, at i MM sekretion af Wnt-antagonisten Dkk-1 af de neoplastiske celler inhiberer osteoblast rekruttering og aktivitet. Følgelig osteolytisk læsion i MM er ikke blot et resultat af forøget knogleresorption, men også af undertrykte knogledannelse [30]. Endvidere nedregulering af Dkk-1-ekspression synes at mediere det osteoinduktive aktivitet af endothelin-1 (ET-1) [31]. En anden ekstracellulære antagonist af Wnt-vejen, SFRP-2, kan også bidrage til denne mekanisme af hæmning af knogledannelse [32].

modulation af osteoblast rekruttering /aktivitet og den mulige bidrag hæmning af knogledannelse i osteolytiske knoglemetastaser ved solide kræftformer har fået lidt opmærksomhed. Et begrænset antal kvantitative histomorfometriske studier i osteolytiske metastaser ved en række epiteliale cancere har vist, at ud over forøgelsen af ​​knogleresorption, er der også svækkelse i knogledannelse, især i fremskredne læsioner [33], [34], [35] . Det er blevet foreslået, at knogleresorption i disse læsioner kobles fra efterfølgende knogledannelse fase, som normalt følger i normal knogle remodellering [36]. Dette fænomen kan medieres af en direkte, negativ påvirkning af kræftceller på osteoblast rekruttering, overlevelse og aktivitet, som vist

in vitro

for osteolytisk CAM og Cap cellelinjer [37], [38], [39] . Nærværende undersøgelse, der viser, at indekser af knogledannelse er svækket i tibia xenotransplanteret med PC-3 celler, støtter yderligere de kliniske fund over og foreslår, at en mekanisme for afkobling knogledannelse fra resorption også opererer i denne model kraftigt. Men identiteten af ​​molekylerne medierende denne hæmmende virkning på osteoblaster er endnu ukendt.

Antagonisme af BMP-aktivitet ved noggin er kritisk for embryonisk chondro-osteogenese og fælles dannelse [40]. Osteoblast-målrettet over-ekspression af noggin resulterer i osteopeni som følge af forringet osteoblast rekruttering [41], [42], hvilket indikerer, at det ekstracellulære modulering af BMP koncentration er også vigtigt i voksenlivet til bekæmpelse af knogledannelse under knogleremodellering . BMP og noggin gensidigt fremkalde deres udtryk i osteoblaster [23], hvilket indikerer, at en positiv feedback er nødvendig for at opretholde en optimal balance mellem BMP og noggin koncentrationer i knoglen mikromiljø. Bone metastatiske cancerceller kan forstyrre denne balance ved at udskille et overskud af enten BMP’er eller noggin. Det er blevet rapporteret, at BMP-6-ekspression positivt korrelerer med CaP progression [43], [44], og at BMP-6 er RD hovedansvarlig for at inducere et osteoblast respons i musemodeller for CaP knoglemetastaser [17], [45] . i et af disse rapporter, vi demonstreret imidlertid, at der ud, osteoinduktive cancerceller mangler sekretion af BMP-inhibitoren noggin og at noggin tvunget ekspression i disse celler ophæver deres osteoinducerende aktivitet

in vivo

. Derfor er en enstemmigt effekt af et overskud af BMP-6 lokalt frigivet af kræftceller er også en faktor for osteoblast respons både i CaP og CaM knoglemetastaser [17]. Ligeledes lav ekspression af Wnt-antagonisten Dkk-1 synes at favorisere Wnt-inducerede osteoblast respons i CaP knoglemetastaser [46]. Disse to undersøgelser påvises for første gang, at i osteoblastisk knoglemetastaser den fysiologiske, stramme balance mellem osteoinducerende BMP-6 og /eller Wnt proteiner og deres antagonister er vippet mod den første og således favoriserer en unormal osteoblast respons. I modsætning hertil osteolytiske CaM cellelinjer udtrykker BMP-2 og -4, mens osteolytisk CaP-cellelinien PC-3 udtrykker BMP-3 [17], [47]. Men begge hætte og CaM osteolytiske cellelinjer udtrykker lav eller ingen BMP-6 [17], [45] og BMP-7 [48], [49] og, vigtigst af alt, udskiller konstitutivt relative store mængder af noggin [17]. Således i osteolytisk knoglemetastaser balancen mellem BMP’er og noggin synes at ændres i en retning modsat den af ​​osteoblastiske knoglemetastaser. Den foreliggende undersøgelse viser, at denne noggin-vippet balance er ansvarlig for undertrykkelse af knogledannelse og dermed forhindrer reparation af osteolytisk læsion. Desuden påvisning af, at specifikke målretning af kræftcellen-afledte noggin bevarer knogledannelse /reparation tyder stærkt noggin som en vigtig “un-kobling faktor” i osteolytiske knoglemetastaser og yderligere understreger relevansen af ​​BMP antagonisme i patologisk knogle remodellering.

Her viser vi tydeligt, at noggin tavshed i osteolytiske PC-3 celler, men ikke korrigere knoglen arkitektur, gendanner knoglemassen af ​​xenotransplanteret skinneben, som vurderet ved røntgenfotografering, μ-CT og pQCT. Denne virkning på knoglemassen er resultatet af normalisering eller endda forøgelse af knogledannelse, som angivet ved histomorfometriske parametre for osteoblast antal og aktivitet. Noggin lyddæmpning i PC-3 celler ændrer ikke hverken niveauet eller spektret af deres BMP udtryk. Som følge heraf kunne den fysiologiske BMP /noggin balance i knogler blive skævt til fordel for først ved et overskud af cancercelle-afledte BMP’er, hvilket kan forklare tendensen i retning af stigningen i knogledannelse observeret i knogle xenotransplanteret med Nog-KD PC-3 celler.

knoglen reparation er tydelig i avancerede knoglelæsioner, hvilket tyder på, at et tidsinterval er nødvendig for at genoprette knogledannelse, konsekvent med den tidsmæssige organisering af den fysiologiske knogle remodellering (knogler kobling). En lignende mekanisme for genoprettelse af knogle kobling er blevet foreslået for at forklare den reparative knogledannelse in knoglemetastaser ved faste cancere som en effekt af anti-cancerbehandling [33], [36], [50].

positiv effekt af noggin lyddæmpning på knogledannelse understøtter vores oprindelige hypotese og foreslår noggin som en af ​​de væsentlige cancer celle-afledte hæmmere af osteoblast rekruttering /aktivitet bidrager til osteolytiske læsioner i Cap knoglemetastaser. Vi har valgt en CaP model af osteolytiske knoglemetastaser at være i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse viser, at omvendt, manglende noggin har en relevant rolle i den osteoblastiske reaktion i Cap knoglemetastaser [17]. Imidlertid er en overvejende osteolytiske fænotype kun observeret i en lille procentdel af Cap knoglemetastaser, mens det repræsenterer størstedelen af ​​kammen metastaser [5], [6].