PLoS ONE: Pifithrin-μ, en inhibitor af Heat-Shock Protein 70, kan øge antitumor Effekter af Hypertermi mod human prostatakræft Cells

Abstrakt

Hypertermi (HT) forbedrer effektiviteten af ​​anti-cancer strålebehandling og kemoterapi. Men HT også uundgåeligt fremkalder stress reaktioner og øger ekspression af varmechokproteiner (HSP’er) i cancerceller. Blandt HSP’er, er HSP70 kendt som en pro-overlevelse protein. I denne undersøgelse undersøgte vi sensibiliserende effekt af pifithrin (PFT) -μ, et lille molekyle inhibitor for HSP70, når tre humane prostatacancer-cellelinier (LNCaP, PC-3 og DU-145) blev behandlet med HT (43 ° C i 2 timer). Alle cellelinier konstitutivt udtrykt HSP70, og HT steg yderligere til udtryk i LNCaP og DU-145. Knockdown af HSP70 med RNA-interferens faldt levedygtighed og koloni-dannende evne af cancerceller. PFT-μ reducerede levedygtigheder for alle cellelinjer på en tiendedel af dosen af ​​Quercetin, en velkendt HSP hæmmer. Kombinationsbehandlingen med suboptimale doser af PFT-μ og HT faldt levedygtighed cancerceller mest effektivt, når PFT-μ blev straks tilsat før HT, og denne kombination virkning blev ophævet ved præ-knockdown af HSP70, hvilket antyder, at virkningen var medieret via HSP70 inhibition. Kombinationsterapien inducerede celledød, delvist caspase-afhængig, og faldt prolifererende cancerceller, med nedsat ekspression af c-Myc og cyclin D1 og forøget ekspression af p21

WAF1 /Cip, hvilket indikerer standsning af cellevækst. Derudover kombinationsterapien formindskede signifikant kolonidannende evne af cancerceller sammenlignet med behandling med enten alene. Endvidere i et xenotransplantat musemodel, kombinationsterapien inhiberede PC-3 tumorvækst betydeligt. Disse resultater antyder, at PFT-μ effektivt kan forbedre HT-induceret antitumorvirkninger via HSP70 inhibition ved at inducere celledød og standsning af cellevækst, og at PFT-μ er et lovende middel til anvendelse i kombination med HT til behandling af prostatacancer.

Henvisning: Sekihara K, Harashima N, Tongu M, Tamaki Y, Uchida N, inomata T, et al. (2013) Pifithrin-μ, en inhibitor af Heat-Shock Protein 70, kan øge antitumor Virkninger af Hypertermi mod human Prostata Cancer Cells. PLoS ONE 8 (11): e78772. doi: 10,1371 /journal.pone.0078772

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: 10 juni, 2013; Accepteret: September 16, 2013; Udgivet: November 14, 2013 |

Copyright: © 2013 Sekihara et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af tilskud-in-støtte til videnskabelig forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan (nr. 18.591.449 til M. Harada og ingen. 23.701.074 til N. Harashima), og fra Shimane University “S-Takumi Medical Nanoteknologi” Projekt (til M. Harada). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er den mest almindelige cancer og den tredje mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald hos mænd i USA [1]. Selvom tidlige fase prostatacancer kan godt styres af operation eller strålebehandling, er patienter med fremskreden prostatacancer behandlet med hormonbehandling [2]. Men efter en kortvarig remission, overlevende kræftceller ofte vender tilbage med øget malignitet [3]. Derfor, for at forbedre overlevelsen hos mænd med prostatacancer, skal der udvikles nye terapeutiske strategier.

hypertermi (HT) er en effektiv terapi, der har lav toksicitet, milde bivirkninger, og har vist sig at være synergistisk med andre typer af anti-cancer behandlinger. Talrige

in vitro

in vivo

undersøgelser har afsløret, at HT effektivt forbedrer effekten af ​​strålebehandling og kemoterapi mod forskellige typer af kræft [4] – [6]. Derudover har mange kliniske forsøg vist, at tilsætning af HT til radioterapi eller kemoterapi kan give en mere fuldstændig respons [7] – [11]. Dog er HT uundgåeligt forbundet med varmechok-proteiner (HSP’er) [12], [13]. HSP’er er molekylære chaperoner, der fungerer som den primære cellulære forsvar mod skader på proteom, initiering refoldning af denaturerede proteiner og regulere nedbrydning efter alvorlig protein skader [14]. HSP’er beskytte celler både ved at begrænse virkningerne af protein-ødelæggende midler gennem protein chaperoning og refoldning og ved direkte at blokere celledødsveje [15] – [18]. Blandt de HSP’er, HSP70 er et stress-inducerbart HSP, der er blevet rapporteret at spille en rolle i terapi-resistens [19]. I modsætning til sin meget lavt niveau i tryksvage normale celler, HSP70 udtryk stiger hurtigt som reaktion på forskellige belastninger [20], [21]. Vigtigere, har forøget ekspression af HSP70 i cancerceller blevet rapporteret at være associeret med maligne egenskaber og dårligere prognose af kræftpatienter [22]. Dette tyder på, at HSP70 er et lovende mål i kræftbehandlingen. Reduktion HSP70 niveauer i nogle dyrkede tumorceller er blevet rapporteret at inducere celledød, og /eller til at bevidstgøre dem til cytostatika, og samtidig have ingen synlige skadelige virkninger på ikke-tumorceller [23] -. [28]

Pifithrin (PFT) -μ (2-phenylethynesulfonamide) blev oprindeligt identificeret som en lille-molekyle inhibitor for binding af p53 til mitochondrier [29]. Derefter blev dette molekyle fundet til selektivt at interagere med HSP70 og at inhibere dets funktioner [30]. Disse oplysninger førte os til at teste den hypotese, at PFT-μ kunne forbedre HT-induceret antitumorvirkninger mod humane prostatacancerceller. I den aktuelle undersøgelse, efter at have bekræftet, at HSP70 konstitutivt udtrykkes og /eller forstærket af HT og spiller en pro-overlevelse rolle i humane prostatacancerceller, demonstrerede vi, at kombinationen af ​​suboptimale doser af PFT-μ effektivt kan forbedre HT-induceret antitumor virkninger mod human prostatacancer

in vitro

, og at kombinationsterapien kan inhibere tumorvækst i en xenotransplantat musemodel.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og reagenser

Tre humane prostatacancer-cellelinier (LNCaP, PC-3 og DU-145) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) og blev opretholdt i RPMI 1640-medium (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) og 20 ug /ml gentamicin (Sigma-Aldrich) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. PFT-μ og Quercetin blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (SCB: Santa Cruz, CA, USA). Og Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA), henholdsvis

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af 2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2, 4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium-mononatriumsalt (WST-8) assay (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Kort fortalt blev cellerne udsået i fladbundede plader med 96 brønde. To dage senere, WST-8 blev tilsat til hver brønd, og pladerne blev aflæst ved en bølgelængde på 450 nm efter 3 timer.

Kombinationsbehandling med HT og PFT-μ

For at inducere HT, cancerceller, som blev podet 1 dag før, blev inkuberet ved 43 ° C i 2 timer. Cancerceller blev altid dyrket i nærvær af PFT-μ i 2 dage. I nogle forsøg blev HT udført på dag 1, 2 eller 3 efter start kultur af cancerceller.

Transfektion af lille interfererende RNA (siRNA)

Transfektion af siRNA blev udført under anvendelse af Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. HSP70 siRNA (sc-29352) blev købt fra SCB. Kontrol siRNA (# 6568) blev købt fra Cell Signaling Technology (CST), Danvers, MA, USA. Tre dage efter siRNA transfektion blev kræftcellerne anvendes til forsøgene.

Kolonidannende assay

Celler blev podet i fladbundede seks-brønds plader. En dag senere, PFT-μ blev tilsat og behandlet med eller uden HT. To dage efter tilsætningen af ​​PFT-μ blev mediet udskiftet med nyt medium uden PFT-μ, og dyrkningen blev fortsat i yderligere 10-12 dage. Derefter blev kolonier fikseret med methanol og farvet med 0,05% krystalviolet, derefter talt

Immunblot

Celler blev lyseret med en pattedyrprotein ekstraktion reagens (M-Per;. Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Nacalai Tesque). Lige store mængder protein blev opløst på 4-12% gradient eller 12% SDS-PAGE geler og derefter overført til polyvinylidenfluorid membraner. Efter blokering af membranerne, blev blottene inkuberet med de følgende primære antistoffer: anti-HSP70 (Hsp72, R 0,05 (Students

t

-test) (D) PC-3 og DU-145, som var blevet præ-transficeret med HSP70 siRNA eller kontrollere siRNA 2 dage før, blev dyrket i kolonien-formation assay for 12 dage. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tre brønde. *

P

0,05 (Students

t

-test) (E) LNCaP, som var blevet præ-transficeret med HSP70 siRNA eller kontrollere siRNA 2 dage før, blev dyrket i 12 dage, og cellelevedygtighed (%) blev bestemt under anvendelse af WST-8 assay. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tre brønde. *

P

0,05 (Students

t

-test)

antitumorvirkninger på humane prostata kræftceller induceret af kombinationsbehandling med HT og PFT-. μ

ovenstående data antyder, at hæmning af HSP70 kunne gøre det lettere behandling af prostatacancer ved hjælp HT. Derfor Derefter undersøgte vi virkningen af ​​den nye HSP70 inhibitor PFT-μ på HT-induceret antitumoraktivitet. Før evaluering af antitumorvirkning induceret af kombinationen af ​​HT og PFT-μ, sammenlignede vi antitumorvirkningen af ​​PFT-μ med den for Quercetin, en varme-shock faktor (HSF) -1 inhibitor, som inhiberer opreguleringen af ​​alle varme-shock-inducerede gener, herunder

HSP70

gen [31] (fig. 2A). Både Quercetin og PFT-μ faldt levedygtighed tre prostata cancercellelinier på en dosis-afhængig måde, men PFT-μ udøvede sin antitumorvirkning på næsten en tiendedel dosis af quercetin. Vi bekræftede også, at knockdown af HSP70 undladt at påvirke ekspressionen af ​​HSP90, en anden nøgle HSP af stress respons pathway (fig. 2B). PFT-μ havde ingen virkning på den HSP70-proteinekspression, som tidligere rapporteret [30].

(A) Tre cellelinier blev dyrket med de angivne doser af Quercetin eller PFT-μ. Efter 48 timer blev cellelevedygtighed (%) bestemt under anvendelse af WST-8 assay. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tre brønde. (B) To dage efter transfektion af HSP70 siRNA eller kontrol siRNA, ekspressionen af ​​HSP90 og HSP70 blev vurderet ved immunoblot. Ekspressionen af ​​disse HSP’er blev også undersøgt efter behandlingen med PFT-μ (5 uM). β-Actin blev anvendt som en kontrol.

Derefter vurderede vi de antitumor effekt induceret af kombinationen af ​​HT og PFT-μ. Vi først udforsket for de optimale protokoller for at maksimere antitumor effekt induceret af denne kombination. Som vist i fig. 3A blev tre human prostatacancer-cellelinier behandlet med tre forskellige protokoller; i protokol-1 (P-1), blev HT udført 24 timer før tilsætningen af ​​PFT-μ; i protokol-2 (P-2), blev PFT-μ umiddelbart tilføjes før HT; og i protokol-3 (P-3), blev HT udført 24 timer efter tilsætning af PFT-μ. Den mest fremtrædende virkning blev observeret ved anvendelse af P-2 protokol (fig. 3B). Udvalgte, repræsentative data er vist i fig. 3C. Levedygtighed kræftceller faldt betydeligt, når HT blev kombineret med en suboptimal dosis (5 uM) af PFT-μ. Vi yderligere besluttet, om kombinationen virkning kunne observeres i kræftceller, der blev præ-transficeret med HSP70 siRNA (Fig 3D.); præ-knockdown af HSP70 afskaffet kombinationen virkning mod PC-3 og DU-145. Disse resultater indikerer, suboptimale doser af PFT-μ kan forbedre HT-induceret antitumorvirkninger på prostatacancerceller via HSP70 inhibition, og at de mest fremtrædende virkning opnås, når PFT-μ tilsættes umiddelbart før HT.

( A) Tre forskellige protokoller er vist. (B) tre cellelinjer blev dyrket med de angivne doser af PFT-μ baseret på tre forskellige protokoller med HT (skraveret søjle) eller uden HT (sort søjle). HT blev udført ved 43 ° C i 2 timer. Efter 48 timer blev cellelevedygtighed (%) bestemt under anvendelse af WST-8 assay. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tre brønde. (C) Udvalgte resultater er vist. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tre brønde. *

P

0,05 (Students

t

-test) (D) PC-3 og DU-145, som var blevet præ-transficeret med HSP70 siRNA eller kontrollere siRNA 2 dage tidligere, blev culured med PFT-μ (5 uM) med /uden HT (43 ° C i 2 timer). Efter 48 timer blev cellelevedygtighed (%) bestemt under anvendelse af WST-8 assay. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tre brønde. *

P

0,05 (Students

t

-test) NS, ikke signifikant

Kræft celledød efter kombinationsbehandling af HT og PFT-μ.

I undersøgelserne er beskrevet ovenfor, vi evalueret hovedsagelig antitumor virkninger på prostata kræftceller ved at måle levedygtigheden 2 dage efter behandling med HT og PFT-μ. sådanne virkninger på levedygtighed, kan imidlertid afspejle ændringer i celledød og /eller vækst. Derfor vi næste vurderede underliggende virkningsmekanisme. Som vist i fig. 4A, HT alene undladt at øge andelen af ​​Annexin-V

+ celler, hvorimod behandling med PFT-μ steg det lidt. Kombinationen behandling drastisk forøget procentdelen af ​​Annexin V

+ -celler, både tidlige apoptotiske Annexin-V

+ /PI

– og sene apoptotiske og /eller nekrotisk Annexin-V

+ /PI

+, især i LNCaP-celler. Stigningen i andelen af ​​Annexin V

+ celler syntes at være kun additiv i PC-3 og DU-145. Derudover tilsætning af 20 uM z-VAD, en pan-caspaseinhibitor, delvist reduceret procentdelen af ​​Annexin V

+ -celler i LNCaP efter kombinationsbehandling af HT og PFT-μ (fig. 4B). Den z-VAD-induceret nyttiggørelse fra Annexin V

+ celler blev påvist i Annexin V

+ /PI

– (tidlig apoptotisk) delmængde. Denne dosis af z-VAD var tilstrækkelig til at inhibere TRAIL-induceret celledød af dødsfald receptor-udtrykkende humane pankreatiske cancerceller [32]. Disse resultater indikerer, at selvom effekten varierer blandt cancercellelinjer, kombinationsterapi med HT og PFT-μ kan forbedre død prostatacancerceller, og at kombinationsterapien-induceret celledød af LNCaP er delvis caspase-afhængig.

(A) Tre cellelinier blev behandlet med HT (43 ° C i 2 timer) og /eller PFT-μ. Efter 48 timer, flowcytometri blev udført efter farvning med FITC-konjugeret Annexin V og PI. Et repræsentativt resultat er vist. Tallene repræsenterer procentsatser for hver delmængde. (B) LNCaP-celler blev behandlet med både HT og PFT-μ (5 uM) i nærvær af z-VAD (20 uM) eller kontrol DMSO. Efter 48 timer, flowcytometri blev udført efter farvning med APC-konjugeret Annexin V og PI. Tallene repræsenterer procentsatser for hver delmængde.

Kombinationsbehandling med HT og PFT-μ kan arrestere væksten af ​​prostata kræftceller

Vi yderligere undersøgt, om cellevækst anholdelse var involveret i antitumoreffekten induceret af kombinationsterapi med HT og PFT-μ. Som vist i fig. 5A, vurderede vi spredning og cellecyklus af kræftceller ved at vurdere BrdU optagelse og 7AAD farvning. Vi fandt, at kombinationsterapi med HT og PFT-μ faldt procentdelen af ​​BrdU

+ S-fase cancerceller og forøget den for G2 /M-fase kræftceller i de tre cellelinjer. Vi vurderede også ekspressionen af ​​cellecyklus-relaterede molekyler og fundet at kombinationsterapi resulterede i nedsat ekspression af c-myc i LNCaP og nedsat ekspression af cyclin D1 i PC-3 og DU-145. Derudover er ekspressionen af ​​p21

WAF1 /Cip blev forøget i de tre cancercellelinier. Disse data antyder, at celle vækststandsning bidrager til antitumorvirkninger induceret af kombinationsterapi med HT og PFT-μ.

(A) Tre cellelinier blev behandlet med eller uden HT (43 ° C i 2 timer), og PFT-μ (5 uM) i 2 dage. Under den sidste 5 h for LNCaP, 90 min til PC-3, og 3 timer for DU-145 blev celler dyrket med BrdU (10 uM). Derefter blev høstede celler farvet med FITC-konjugeret anti-BrdU antistof og 7AAD, og ​​flowcytometri blev udført. Tal repræsenterer procentsatser for hver delmængde. (B) Tre cellelinier blev behandlet med enten eller begge af HT og PFT-μ (5 uM) i 2 dage, og ekspressionsniveauerne af c-Myc, cyclin D1, og p21

WAF1 /Cip-protein blev bestemt ved immunoblot. β-actin og α-tubulin blev anvendt som kontroller.

Kombinationsbehandling med HT og PFT-μ kan nedsætte kolonidannende evne af kræftceller

Vi næste undersøgte effekten af kombinationsbehandling med HT og PFT-μ på kolonidannende evne prostatacancerceller. Kombinationsbehandlingen formindskede signifikant kolonidannende evne PC-3 og DU-145-celler (fig. 6A) og faldt levedygtighed LNCaP-celler på lang sigt (12 dage) kultur (fig. 6B). Disse resultater indikerer, at kombinationsterapi med HT og PFT-μ kan nedsætte kolonidannende evne og levedygtighed, i en langtidsdyrkning af prostatacancerceller.

(A) PC-3 og DU-145 cellerne blev dyrket i 14 dage, og deres koloni-dannelse kapacitet blev bestemt. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tre brønde. *

P

0,05 (Students

t

-test) (B) LNCaP-celler blev dyrket i 12 dage, og levedygtighed (%) blev bestemt under anvendelse af WST-8 assay. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tre brønde. *

P

0,05 (

t

-test Students)

In vivo

antitumor effekt af HT og PFT-μ kombination. terapi i en xenotransplantat musemodel

Endelig har vi vurderet om kombinationsterapi med HT og PFT-μ udøvede en antitumorvirkning på etableret human prostatacancer hos et xenotransplantat musemodel (fig. 7). Trædepuderne af nøgne mus blev inokuleret med PC-3-celler og musene blev behandlet med PFT-μ og /eller HT. Givet anatomi trædepuden, blev tumorvæksten vurderet ved måling ikke kun et produkt af to vinkelrette diametre, men også trædepudetykkelse. Som et resultat, skønt den lokale indgivelse af PFT-μ havde nogen antitumorvirkning, men snarere fremmet tumorvækst og HT faldt tumorvæksten smule, men ikke signifikant, at kombinationsterapi med HT og PFT-μ undertrykte tumorvækst betydeligt sammenlignet med kontrolgruppen.

BALB

nu /nu

hanmus inokuleredes i højre trædepude med 1 × 10

6 PC-3-celler med Matrigel. På dag 15 blev musene slået sammen og delt i fire grupper. Hver gruppe indeholdt seks mus. På dag 0 og 4 efter gruppering blev PC-3-bærende mus lokalt injiceret med PFT-μ (100 ug i 50 pi) og /eller behandlet med HT (43 ° C i 30 minutter). Pile repræsenterer behandlingsdagen. Som et køretøj kontrol blev 50 pi DMSO injiceret. HT blev udført 1 time efter den lokale injektion af PFT-μ. Derefter blev tumorstørrelsen, produktet af to vinkelrette diametre (A, B), og den trædepudetykkelse (C, D) målt to gange ugentligt. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af seks mus. *

P

0,05 **

P

. 0,01 (Dunnett test) NS, ikke signifikant

Diskussion

Blandt en forskellige kræftformer, HT gælder især for prostatacancer [33]. Men som omtalt i indledningen, HT uundgåeligt fremkalder stressreaktioner i kræftceller. HSP70 er en potent varme-inducerbar pro-overlevelse protein som bibringer cytoprotektion mod forskellige død-fremkaldende stimuli og øger tumorigenicitet [25], [27], [34]. Derfor HSP70 er blevet foreslået som et lovende mål for kræftbehandling [19]. I den aktuelle undersøgelse påviste vi, at tre prostata cancer cellelinier er konstitutivt positive for HSP70, og at HT kan øge dets ekspression i LNCaP og DU-145-cellelinjer. Uventet ekspressionen af ​​HSP70 i PC-3 var faldet lidt 8 timer efter HT; vi er i stand til at forklare denne observation på nuværende tidspunkt. Det er dog bemærkelsesværdigt, at selektiv knockdown af HSP70 i cancerceller væsentligt reduceret deres levedygtighed og koloni-dannende evne. Vores resultater antyder, at HSP70 er en pro-overlevelse protein i prostatacancerceller, i overensstemmelse med tidligere rapporter [23] – [28]. Disse fund førte os til at teste virkningen af ​​kombinationen af ​​HT med PFT-μ, en nylig identificeret HSP70 inhibitor [30], på human prostatacancer celler.

Kombinationsbehandling med HT og PFT-μ faldt signifikant levedygtighed tre prostata cancercellelinjer sammenlignet med behandling med enten behandling alene. Hvad angår den underliggende mekanisme, testede vi to muligheder;

dvs..

, Celledød og cellevækst anholdelse. Annexin V /PI-farvning afslørede, at kombinationsbehandlingen steg procentdelen af ​​annexin V

+ -celler (fig. 4A). Selvom kombinationen effekten var svag i PC-3 og DU-145 celler, en drastisk og synergistisk stigning i procentdelen af ​​Annexin V

+ celler blev observeret i LNCaP celler. HT alene påvirkede ikke procentdelen af ​​Annexin V

+ celler, og effekten af ​​PFT-μ alene var også marginal. Annexin V

+ /PI

+ positivitet angiver ikke apoptotiske celler, fordi sene-nekrotisk celler er også positive for både Annexin V og PI. Med hensyn til celle vækststandsning, kombinationsterapien faldt fraktion S-fasen og forøget fraktion G2 /M-fase i tre cancercellelinier (fig. 5A). Disse resultater er i overensstemmelse med dem fra en nylig rapport viser, at PFT-μ kan fremkalde G2 /M anholdelse i cancerceller [35]. Derudover kombinationsbehandlingen faldt ekspressionen af ​​c-myc i LNCaP og cyclin D1 i PC-3 og DU-145, og forøget ekspression af p21

WAF1 /Cip i tre cellelinier. Disse ændringer i cellecyklus-relaterede molekyler kan delvist forklare den anholdelsen af ​​væksten af ​​prostata cancer celler som reaktion på kombinationsbehandlingen.

HSP90 og HSP70 påvirker hinanden [36]. Da HSP90 inhibering er forbundet med opreguleringen af ​​HSP70 [37], multiple grupper har rapporteret, at samtidig inhibering af HSP70 markant øger cytotoksiciteten af ​​HSP90-inhibitorer i flere forskellige tumortyper [38]. Omvendt HSP70 er en kritisk co-chaperon for HSP90 og er involveret i leveringen af ​​kundens proteiner til HSP90 [39], og HSP70 inhibition kan inducere tumorspecifik apoptose via HSP90 funktion [28]. Disse linjer information antyder, at knockdown af HSP70 og PFT-μ forstærkede virkningen af ​​HT via inhibering af HSP90. Derfor undersøgte vi virkningen af ​​knockdown af HSP70 eller PFT-μ på ekspressionen af ​​HSP90 i cancerceller, mens der ikke blev observeret nogen ændring i HSP90-ekspression (fig. 2B). Dog kan dette resultat ikke udelukke, at hæmning af HSP70 eller PFT-μ påvirket beslaglæggelse af HSP90 klient proteiner, herunder epidermal vækstfaktor receptor, HER2 /ErbB2 og AKT, ind i en uopløselig fraktion og fremmet deres aggregering og inaktivering, som rapporteret [ ,,,0],40].

Vi afgøres, om kombinationsbehandlingen celledød af LNCaP celler var afhængig af caspase (fig. 4B). Tilsætningen af ​​den pan-caspaseinhibitor z-VAD faldt procentdelen af ​​Annexin V

+ /PI

– tidligt apoptotiske LNCaP-celler, hvilket antyder, at caspase-afhængig apoptose var delvist ansvarlig for kombinationsterapien-induceret celledød af LNCaP. Eftersom HT alene inducerede ikke celledød, denne effekt synes hovedsagelig at afspejle virkningen af ​​PFT-μ. Vi rapporteret for nylig, at PFT-μ forårsager caspase-afhængig og -uafhængig celledød af humane pancreatiske cancerceller [32]. Vedrørende caspase-uafhængig celledød, er HSP70 blevet rapporteret at binde til apoptoseinducerende faktor (AIF), som inducerer caspase-uafhængig apoptose ved translokation ind i kernen [41]. Imidlertid RNA-interferens af AIF havde ingen virkning på PFT-μ-induceret celledød af prostatacancerceller (data ikke vist). Således AIF sandsynligvis ikke deltager i kombinationsterapien-induceret død LNCaP-celler. Alternativt har HSP70 blevet rapporteret at lokalisere til membraner lysosomer, fremme levedygtigheden cancercelle, og inhiberer TNF-induceret celledød ved inhibering lysosomal membranpermeabilitet [42]. Således HSP70 forbedrer overlevelsen ved at stabilisere lysosomerne i cancerceller. Da PFT-μ binder HSP70, er det muligt, at PFT-μ inhiberer HSP70-induceret stabilisering af lysosomale membran permeabilitet, hvilket resulterer i øget celledød. Imidlertid er yderligere undersøgelse er nødvendig for at belyse den præcise mekanisme for celledød efter kombinationsbehandling med HT og PFT-μ.

Når HT kombineres med anti-cancer medicin, timingen af ​​administration af lægemidlet er kritisk [ ,,,0],13]. Derfor i denne undersøgelse, sammenlignede vi antitumorvirkninger induceret af tre forskellige protokoller, og fandt at denne HT umiddelbart efter tilsætningen af ​​PFT-μ gav de største antitumorvirkninger (fig. 3). Dette tyder indirekte at HSP70 spiller en beskyttende rolle umiddelbart efter varmepåvirkning.

Vi evaluerede antitumorvirkninger af kombinationsbehandlingen ved koloni-dannelse assay. Dette assay blev udført i 12 dage, og resultatet kan afspejle virkningen af ​​både celledød og celle vækststandsning. Kombinationen med HT og PFT-μ formindskede signifikant kolonidannende evne PC-3 og DU-145-celler. I tilfældet med LNCaP, kombinationsterapien forårsagede en antitumorvirkning på LNCaP i en langsigtet (12 dage) celleviabilitetstest. I disse assays blev PFT-μ fjernet efter den indledende 2-dages kultur fordi den kontinuerlige tilstedeværelse af PFT-μ, selv på relativt lave dosis, der anvendes til kortvarig celleviabilitetstest, var for høj til at tillade kolonier til at danne. Vi antager, at kolonien-formation assay og på lang sigt (12 dage) celleviabilitetstest er nyttige til at teste de langvarige effekter på cancerceller efter forbigående anti-cancer terapi.

Selvom Quercetin er en velkendte HSP inhibitor [31], har dette stof ikke blevet anvendt klinisk, fordi relativt høje doser er nødvendige for at fremkalde antitumorvirkninger

in vivo

. Vi sammenlignede antitumorvirkninger af Quercetin og PFT-μ og fandt, at PFT-μ kan inducere antitumorvirkning selv ved en tiendedel dosis af quercetin (fig. 2A).