PLoS ONE: High-Performance Size-Based Microdevice til påvisning af cirkulerende tumorceller fra perifert blod i endetarmskræft Patients

Abstrakt

Da individuel terapi bliver mere og mere vigtigt i behandlingen af ​​endetarmskræft, en der bør etableres præcis og effektiv tilgang i de kliniske omgivelser til at hjælpe læger til at træffe deres beslutninger. Cirkulerende tumorceller (CTCs), stammede fra enten primær eller metastatisk cancer, kan give vigtige oplysninger til diagnose og overvågning af kræft. implikationen og udvikling af CTCs, er imidlertid begrænset på grund af den ekstreme sjældenhed af disse tumorceller. I denne undersøgelse fabrikeret vi en enkel og højtydende mikrovæskeanordning, som udnyttes talrige filtrerede mikrokanaler i det at berige de store størrelse måltumorceller fra fuldblod. En meget høj CTC indfangningseffektivitet (gennemsnitlig nyttiggørelsesprocent: 94%) blev opnået i denne enhed ved den optimale strømningshastighed på 0,5 ml /time og kanal højde på 5 um. Derudover anvendte vi denne indretning til detektering CTCs i 60 patienter med rektal cancer. CTC tællinger af rektal kræftpatienter var væsentligt højere end hos raske forsøgspersoner. Endvidere CTC tællinger påvises ved denne anordning var signifikant højere end dem af EpCAM bead-baserede metode til rektal cancerpatienter med forskellige trin. Især for lokaliserede rektal kræftpatienter, de positive satser for prøver med mere end 3 CTCs pr 5 ml blod ved brug af microdevice vs. EpCAM-baserede dem var 100% vs. 47%, hhv. Denne enhed giver således et nyt og effektivt værktøj til præcis identifikation og måling af CTCs hos patienter med endetarmskræft, og har bredt potentiale i klinisk praksis

Henvisning:. Sun W, Jia C, Huang T, Sheng W , Li G, Zhang H, et al. (2013) High-Performance Size-Based Microdevice til påvisning af cirkulerende tumorceller fra perifert blod i endetarmskræft Patienter. PLoS ONE 8 (9): e75865. doi: 10,1371 /journal.pone.0075865

Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Spanien

Modtaget: April 23, 2013; Accepteret: August 16, 2013; Udgivet: 16 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Sun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af nogle videnskabelige forskningsmidler som følger: 1. National Basic Research Program Kina (973 Program nr 2012CB933303) 2. nøglen Clinical Project af Sundhedsministeriet (2010-2012) 3. Fudan University Radiation Medicine Research 3. fase “985 projekt” (Grant No. 985III-YPT06) 4. National Natural Science Foundation of China (nr 81.101.645, 61.271.162) 5. Shanghai Municipal Kommissionen for Videnskab og Teknologi (No.12nm0503702, 11JC1414400). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de senere år er forekomsten af ​​rektal cancer dramatisk stigende over hele verden [1]. Trods de seneste fremskridt inden for diagnostiske og behandlingsmæssige teknikker, resultatet efter behandling forbliver fattige hovedsagelig på grund af forekomsten af ​​de fjerne metastaser [2] -. [4]

Cirkulerende tumorceller (CTCs), kaste fra enten primær eller metastatisk cancer, er blevet identificeret i det perifere blod af patienter og er ofte forbundet med kræft tilbagefald og metastase [5] – [6]. Derfor ville påvisning af CTCs forventes at give et effektivt værktøj til kræft prognose, diagnose af minimal residual sygdom, vurdering af tumor følsomhed over for anti-cancer medicin, og anvendelse af individualiseret behandling [7].

Men har forsøg på at studere CTCs er begrænset af deres sjældenhed, med koncentrationer så lave som en CTC pr milliard cirkulerende hæmatologiske celler [8]. CTCs skal således beriget, isoleret og korrekt identificeret for at være klinisk nyttigt. I øjeblikket er en af ​​de mest almindeligt anvendte metoder til CTC påvisning baseret på anvendelsen af ​​magnetiske perler konjugeret antistoffer mod epiteltumor relateret overfladeantigener såsom epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) [9] – [10]. Den CellSearch (Veridex, NJ, USA) system er et typisk eksempel ved hjælp af anti-EpCAM magnetisk perle-baserede metode til at påvise CTCs, og det er det eneste system, der er godkendt af det amerikanske FDA til klinisk anvendelse i metastatisk bryst-, tyktarms- og prostatakræft indtil nu [ ,,,0],11]. Alligevel foreslog nogle data, at epitelialantigenet kan gå tabt på CTCs grund af epitel-mesenkymale overgang (EMT), hvilket blev anset for at være en afgørende begivenhed i metastatiske proces [12] – [13]. Dette kan være det største problem, som begrænser den brede anvendelse af EpCAM-baserede metode i klinisk praksis.

På den anden side, en anden almindeligt anvendt fremgangsmåde til at adskille CTCs fra blodprøver er baseret på forskelle i cellestørrelse og deformerbarhed mellem CTCs og hæmatologiske celler. Generelt størrelserne af CTCs spænder fra 15 til 25 um i diameter, større end hæmatologiske celler (. Gennemsnitlige størrelser af erythrocytter og perifere blodlymfocytter er 8 um og 7-10 um i diameter, henholdsvis) [14] – [ ,,,0],15]. ISET (Les Ulis, Frankrig), der opregner CTCs ved blod filtrering gennem polycarbonat Track-Etch-type membraner med 8 um cylindriske porer, er et repræsentativt en med forholdsvis høj capture effektivitet [16]. Imidlertid porer polycarbonatfiltre, der er fremstillet ved spor ætsning, er tilfældigt placeret med uensartet tæthed [17] – [18]. For nylig er udviklingen af ​​mikrofabrikation teknik tillod indførelse af mikrofluide tilgange til at indfange disse sjældne celler, som kan gøre op svaghed ISET [19] – [20]. Ved hjælp af en lag parylen-C membran mikrofiltre, Zheng S et al. [21] genvundet 89,5% ± 9,5% humane prostata kræftceller, der blev tilsat til fuldblod raske donorer. Desuden Tan og Lim et al. [14] udviklet en mikrofluidanordning med flere arrays af halvmåneformede brønde og opnåede udnytte effektiviteten højere end 80% for bryst- og coloncancer-cellelinjer. Endvidere Bhagat et al. [22] udnyttet en rektangulær mikro-kanaler mønstrede med en sammentrækning-udvidelse array og erhvervede inddrivelse højere end 90% for humane brystkræftceller af MCF-7. Ikke desto mindre er disse metoder kun fundet prøverne med kræft cellelinjer tilsat til sund blod, men mangler kontrol af CTCs i blodet hos kræftpatienter samt yderligere analyse af deres kliniske anvendelse.

Nye terapeutiske strategier forbedre effekten mod metastatisk sygdom og præcise biomarkører for opfølgningen af ​​rektal kræftpatienter er de førende udfordringer, sammen med tidlig opsporing og screening i højrisiko-populationer. I denne undersøgelse, vi designet og fabrikeret en mikrofluid filtrering enhed til at fange disse sjældne CTCs baseret på forskelle i størrelse mellem tumorceller og blodkomponenter. I vores enhed, blodgennemstrømning passerer gennem en mikro-kanal-baseret system muliggør størrelse-selektiv isolering af sjældne tumorceller, med meget høj fangsteffektivitet og fuldt repeterbarhed. Efter immunfluorescensfarvning, kan CTCs derefter identificeret og talt direkte under fluorescensmikroskop. Vores enhed er et yderst effektivt redskab til fangst af sjældne CTCs uden krav om store og dyre apparater. Med henblik på denne undersøgelse var som følger: For det første, vi målt og optimeret parametrene for vores mikrofluidanordning ved at tilsætte kolorektal kræft i blodprøver. For det andet, vi optalt og analyseret CTC capture effektivitet både i spidse celler model og i blodprøver fra patienter med endetarmskræft. Endelig sammenlignede vi vores enhed med anti-EpCAM antistoffer konjugeret immunobead-baserede metode.

Materialer og metoder

Device Design og Fabrication

Som vist i figur 1, den mikro anordning består af 80 kanaler og 81 sidekanaler, som er arrangeret i en interdigital måde at minimere chip fodaftryk. En gruppe af smalle parallelt arrangeret filter kanaler er designet til at forbinde hvert par af hovedkanalen og tilstødende sidekanal. Både vigtigste kanaler og side-kanaler har de tværsnit af 50 um i bredden og 50 um i højden, mens de af filter-kanaler har bredder på 20 pm og højder, der varierede fra 2 um til 8 um. For hver hovedkanal, er den højre side direkte forbundet med prøven indløb, og den venstre side er forbundet via et filter kanal til et spild kammer, med en vifte af mikro-indlæg, der er designet til at forhindre kammer sammenbrud. For hver sidekanal, højre side er blinde og venstre en er forbundet direkte med affald kammer. Efter blodprøven er indlæst ved indløbet, er et negativt tryk, der påføres stikkontakt, der suger blodprøven ind i de vigtigste kanaler. I mellemtiden, på grund af trykforskellen mellem hovedkanalen og sidekanalen, de fleste af de små hæmatologiske celler i fuldblod såsom erythrocytter og leukocytter kan filtreres i deres nabosidedele kanaler via filterkanaler og derefter slået fra kammeret affald. De store og mellemstore celler såsom tumorceller kan ikke passere gennem de smalle filter kanaler og derefter forblive i de vigtigste kanaler. Dette er teorien om isolering af CTCs for denne enhed

A) Den skematiske af mikrofluidapparatet.; B) Den skematiske opsætning arbejdsstation til CTC isolation; C) Strukturen af ​​indretningen under mikroskopet; D) Den skematiske viser teorien for indretningen i lodret visning; E) Den skematiske viser teorien om enheden i profil visning.

Vores enhed blev fremstillet ved limning en hybrid polydimethylsiloxan (PDMS) slab indeholder tredimensionelle mikro-kanaler med en glasplade. Den mikrofluidapparat blev fremstillet gennem veletablerede flere lag blødt litografi proces [23]. Kort fortalt blev en to-niveau master fremstillet ud fra en negativ fotoresist, SU-8 (MicroChem, USA). Efterfølgende afgasset PDMS (blandet i et 10:01 forhold mellem PDMS base med hærder, Sylgard 184, Dow Corning Inc., USA) blev kastet over master formen og bages ved 90 ° C i 1 time i en ovn. Efter hærdning blev PDMS slab omhyggeligt skrællet fra master mug. Et indløb og et udløb blev udstanset gennem PDMS anvendelse af en nål med en flad spids. PDMS plade blev derefter bundet med et objektglas efter oxygenplasmabehandling, og processen blev beskrevet som følger: Oxygen plasma binding blev udført ved anvendelse dedikeret plasma renere (PDC-32G-2, Harrick Plasma Corp., USA). Glasset slide og PDMS plade blev placeret i kammeret af plasma renere i 50 sekunder. Derefter blev PDMS plade og glas slide taget ud af kammeret, og PDMS blev placeret og presset på glasset med det samme.

Cell Kultur og Cell Spiking

Den humane kolorektal cellelinie HT 29, der blev opnået fra cellebank af American Type Culture Collection blev dyrket i McCoys 5A-medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco, Carlsbad, CA, USA). Celledyrkning blev udført i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO

2. Vækstmediet blev opsuget, og cellerne blev efterfølgende høstet anvendelse af 0,25% trypsin. Umiddelbart før eksperimenter blev celler skyllet med PBS-buffer og resuspenderet. Ved at følge producentens instruktioner, blev cellerne behandlet med Vybrant DII celle-mærkning opløsninger (Carlsbad, Invitrogen, CA) i 5 minutter ved 37 ° C, derefter skyllet med PBS-buffer og resuspenderes. Koncentrationen af ​​celler blev bestemt ved tælling med et hæmacytometer. Den ønskede koncentration af celler blev fremstillet ved at fortynde cellesuspensioner i PBS-buffer. Mærkede celler med kendte numre blev tilsat i blodprøver for yderligere målinger.

Blood Prøvetagning og Processing

Blodprøverne fra 60 patienter med endetarmskræft blev opnået fra marts til december 2012. Alle patienter blev bekræftet patologisk som rektal carcinom ved biopsi eller kirurgi. Af disse blev 30, 10 og 20 patienter bekræftet som nydiagnosticeret fase II-III, lokalt recidiv og fjernmetastaser hhv. Af alle disse 60 patienter blev 10 ml blodprøver opnået for CTC påvisning, herunder 5 ml af mikrofluidanordning og 5 ml af EpCAM-baserede metode.

Som en kontrolgruppe, blodprøver blev også trukket fra 30 raske frivillige, der ikke havde nogen kendt sygdom eller feber på tidspunktet for lodtrækningen og ingen historie ondartet sygdom.

Alle prøver blev trukket ind i evakuerede blodopsamlingsrør EDTA-holdige, opbevaret ved 4 ° C og behandles inden 72 timer. Efter centrifugering af perifert blod ved 1500 rpm i 10 min, blev plasmaprøverne forsigtigt fjernet fra den øvre del af supernatanten. Røde blodlegemer lysepuffer (0,139 M NH

4CL, 0,02 M Tris, pH 7,2) blev tilsat til de resterende blodprøver og blandet i 45 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering ved 1500 rpm i 10 min blev supernatanten fjernet, og den resterende perifere mononukleære blodceller (PBMC) blev resuspenderet i PBS-buffer.

Instrumentopsætning

Før behandlingen af ​​detektorer, koncentrationerne af PBMC prøver fra patienter med rektal cancer (eller prøver fra raske donorer med spidse HT-29 celler) blev målt ved et hæmacytometer og fortyndet i PBS-buffer som 5 × 10

7 celler /ml. Derefter fortyndes de 0,5-0,6 ml PBMC prøver blev indført i enheden ved at pumpe. En sprøjtepumpe (PHD 22/2000, HAVARD apparat, Massachusetts, USA) med en 5 ml sprøjte til opsamling af affald blev forbundet med udløbet af indretningen. Indløbet af anordningen er forbundet til blodprøverne via polymer slange. Sprøjtepumpen blev tændt og trykket justeres efter den ønskede strømningshastighed. Blodprøverne blev pumpet fra indløbet ind i mikrofluidanordning for CTC opsamling og de filtrerede hæmatologiske bestanddele såsom leukocytter blev opsamlet i kammeret affald.

identifikation og tælling af CTCs ved fluorescensmikroskopi

efter processen med CTC capture blev tumorceller identificeret og adskilt fra leukocytter baseret på morfologi og differentieret antigen udtryk. Tumor celler er epitelial (cytokeratin + /CD45- /DAPI +), mens leukocytter er nonepithelial (cytokeratin- /CD45 + /DAPI +). Fluorescerende reagenser blev pumpet ind i indretningen og immunofluorescens reaktionen blev udført direkte i kanalerne i indretningen. Først blev antistoffer mod CD45 konjugeret til FITC (BD Biosciences, USA) indføres i indretningen, efterfulgt af inkubation i 30 minutter ved 0 ° C. Efterfølgende blev en opløsning af 0,2% Triton X-100 og antistoffer mod cytokeratin konjugeret til phycoerythrin (C-11, Abcam, UK) blev pumpet ind i indretningen og inkuberes i 10 minutter og 1 time hhv. Derefter blev indfangede celler blandet med DAPI-opløsning i 20 minutter. Endelig blev indfangede celler fikseret af en opløsning af 1% paraformaldehyd i 20 min. Efter disse reaktioner, blev indretningen skyllet med 1 ml PBS for at fjerne overskydende reagenser. Indfangede celler blev identificeret og talt under anvendelse af fluorescensmikroskopi (Olympus America). CTCs blev identificeret ifølge den farvede farve og morfologiske karakteristika såsom cellestørrelse, form og nuklear størrelse. De celler, der farvede cytokeratin + /CD45- /DAPI + og mødte de fænotypiske morfologiske karakteristika blev scoret som CTCs. En erfaren patolog, der var blind for de kliniske resultater omfattende evalueret hver blodprøve for CTC identifikation.

CTCs Detection af EpCAM-baserede metode

capture effektivitet CTCs blev også målt ved EpCAM-baserede metode. Detaljeret fremgangsmåde blev beskrevet som følger: Adskillelsen af ​​CTCs blev udført ved brug af immunomagnetiske perler overtrukket med epiteliale cellespecifikke EpCAM antistoffer (magnetisk perle: 4,5 um diameter, Dynal, Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. PBMC blev resuspenderet i PBS-buffer og blandet med immunomagnetiske perler. Celle-perler blandingen blev inkuberet i 40 minutter ved 2-8 ° C under forsigtig vipning og rotation. Blandingen blev anbragt i et magnetisk i 5 minutter, og supernatanten blev forsigtigt fjernet. Efterfølgende antistoffer mod CD45 konjugeret til FITC (BD Biosciences, USA) blev tilsat og blandet med indfangne ​​celler i 30 minutter ved 0 ° C. Derefter blev cellerne vasket med en opløsning af 0,2% Triton X-100 i 10 minutter og blandes med antistoffer mod cytokeratin konjugeret til phycoerythrin (C-11, ABCAM, UK) i 1 time. Efter dette, indfangede celler blev blandet med DAPI-opløsning i 20 minutter. Endelig blev cellerne fikseret ved en opløsning af 1% paraformaldehyd i 20 min. Efter hvert procestrin, blev indfangede celler vasket af PBS-buffer for at fjerne overskydende reagenser i et magnetisk. Fremgangsmåden til at identificere og optælle CTCs var sammenlignelig med den for mikrovæskeanordning, ifølge den farvede farve og morfologiske karakteristika såsom cellestørrelse, form og nuklear størrelse. De celler, der farvede cytokeratin + /CD45- /DAPI + og mødte de fænotypiske morfologiske karakteristika blev scoret som CTCs. En erfaren patolog, der var blind for de kliniske resultater omfattende evalueret hver blodprøve for CTC identifikation.

Etik Statement

Alle procedurer for indskrivning blev udført i overensstemmelse med relevante love og institutionelle retningslinjer og relevante institutionelle udvalg (etiske komité for Fudan University Shanghai Cancer center) godkendt vores forskning. Alle patienter og raske frivillige underskrevet skriftligt informeret samtykke forud for indskrivning.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (version 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Alle resultater blev udtrykt som middelværdier ± standardafvigelser (SD). Capture blev beregnet ved at dividere antallet af tilfangetagne målceller med antallet af totale målceller indført i indretningen. Renheden af ​​celler tilfangetagne blev bestemt ved at dividere antallet af tilfangetagne målceller med antallet af de samlede opfangede celler. Regressionsanalyse blev udført for at vurdere nøjagtigheden af ​​påvisning tumorceller. En Mann-Whitney U-test og Kruskal-Wallis H testen blev anvendt i tilfælde af 2 uafhængige prøver og mere end 2 prøver henholdsvis hvorimod sammenligninger af beslægtede målinger blev udført ved anvendelse af en Wilcoxon-test. Spearman rang korrelation blev brugt til at analysere sammenhængen for indfangning på mellem mikrofluidanordning og EpCAM-baserede metode. Alle tests var to-sidet og blev udført på et 5% signifikansniveau.

Resultater og Diskussion

Effekten af ​​Channel Højde og Flow Rate på CTC Capture Efficiency

for at optimere de eksperimentelle parametre for denne enhed, vi spiked HT-29-celler med kendte numre i blodprøver fra raske donorer til måling fangsteffektivitet og celle renhed.

Først undersøgte vi virkningerne af filterkanal højde på fangsteffektivitet og celle renhed. Som vist i figur 2a, indfangning effektivitet CTCs med 8 um kanal højde var naturligvis lavere end med 2 um og 5 um højde, mens der kunne observeres tilsvarende højere indfangningseffektivitet af 98% for 2 um og 5 um. Desuden cellen renhed gradvis forbedret med stigningen af ​​kanalen højde, som vist i figur 2b. Således på grundlag af dataene i figur 2a og 2b, valgte vi en højde på 5 um som den bedste afvejning mellem den fangsteffektivitet og celle renhed. Disse resultater viste, at der var en tæt sammenhæng mellem størrelsen af ​​filteret hulrum og capture effektivitet CTCs, og nogle andre undersøgelser også gjort lignende konklusioner: Hosokawa M. et al. [24] udnyttet en størrelsesselektiv microcavity array til at isolere CTCs og dens fange effektivitet præsenteret en nedadgående tendens med stigningen i microcavity størrelse. Sheng W. et al. [25] fabrikeret en aptamer-aktiveret microdevice og også anført, at indfangning effektivitet CTCs ville ned gradvist, men renheden havde en opadgående tendens, når kanalen dybde øges.

A) Forholdet mellem kanal højde og fange effektivitet : indfangning blev beregnet ved at dividere antallet af målcellerne fanget af antallet af målcellerne indført i indretningen. B) Forholdet mellem kanal højde og celle renhed: Renheden af ​​celler tilfangetagne blev bestemt ved at dividere antallet af målcellerne fanget af antallet af de totale celler fanget. Strømningshastigheden var 0,5 ml /h for A) og B). C) Forholdet mellem strømningshastighed og indfangningseffektivitet: The capture blev beregnet ved at dividere antallet af målcellerne fanget af antallet af målcellerne indført i indretningen. Kanalhøjden var 0,5 um. Fejlsøjlerne repræsenterede en standardafvigelse af 4 gentagne eksperimenter. D) Inddrivelse af kendte antal spidse HT-29 celler fra fuldblod. Regressionsanalyse af observerede tumorceller nummer versus forventede antal tumorceller produceret en hældning på 0,986 og en korrelationskoefficient (R

2) af 1.

På den anden side har vi også undersøgt forholdet mellem flow og CTC capture effektivitet. Som vist i figur 2c, ved strømningshastigheden i området fra 0,2 og 0,5 ml /time, har indfangningseffektiviteten ikke ændre naturligvis. Men fra den kurs over 0,5 ml /t, capture effektivitet faldt dramatisk. Indfangningseffektiviteten reduceret med stigningen af ​​strømningshastigheden formentlig på grund af et større tryk ved en højere strømningshastighed. Nogle andre undersøgelser [24] – [26] også påpeget, at celle indfangningseffektivitet var omvendt proportional med strømningshastigheden af ​​blod. Derfor overvejer behandlingstiden for prøver pumpes ind i enheden og indfangningseffektiviteten, valgte vi 0,5 ml /time som den bedste parameter til påvisning, hvor strømningshastigheden er tilstrækkelig kapacitet kunne observeres.

Derfor brugte vi den optimale kanal højde på 5 m og flow på 0,5 ml /h for CTC påvisning, og disse eksperimentelle betingelser blev anvendt til alle efterfølgende eksperimenter.

Inddrivelse af Tumor Cell Detection

for at bestemme følsomhed tumorcelle påvisning, HT-29-celler ved forskellige kendte numre, blev tilsat til 5 ml blodprøver fra hvert rask donor. Antallet af spiked celler var 5, 9, 51, 102, 500 og 998 henholdsvis. Figur 2d viste det forventede antal HT-29-celler tilsat til den sunde donor prøver plottet mod det faktiske antal HT-29 celler fundet i prøverne. Regressionsanalyse af observerede tumorceller nummer versus forventede antal tumorceller produceret en hældning på 0,986 og en korrelationskoefficient (R

2) af 1. Den gennemsnitlige procentdel af HT-29 genvundet var 94%, og genvindingskvoterne ved forskellige cellekoncentrationer alle var over 80% (tabel 1, tabel S1). Vi valideret også genvindingskvoterne af tre lunge kræft cellelinjer, herunder A549, SK-MES-1 og H446, som alle var højere end 90% (data ikke vist).

CTC Påvisning af Rektal kræft patienter med forskellige stadier

CTC tællinger af 60 rektal kræftpatienter med forskellige stadier og 30 raske forsøgspersoner blev påvist og analyseret i hver 5 ml fuldblod. Figur 3 viste erobrede CTCs af en typisk patient med endetarmskræft i mikrofluidapparat

A /B: CTCs farvning;. C /D: normale blodceller farvning. A) positiv CK farvning i CTCs; B) positiv DAPI farvning i CTCs; C) positiv CD45 farvning i normale blodceller; D) positiv DAPI farvning i normale blodceller.

Som vist i figur 4, kan positive celler observeres i 3 ud af 30 raske mennesker, men ingen af ​​dem havde mere end 3 positive celler pr prøve . Disse resultater svarede til dem i tidligere undersøgelser indikerer, at op til tre CTCs blev påvist i en lille population af raske donorer eller ikke-maligne patienter [27] – [28]. Årsagen til sådanne “falske positive” resultater er ukendt endnu, men formentlig på grund af flere grunde som følger: (a) forurening af epitelceller i blodprøver på grund af nogle ukorrekt behandling såsom upassende blodprøvetagning; (B) unøjagtig dom identifikation af CTCs fra forskere; (C) tilstedeværelse af afvigende hæmatologiske celler, som udtrykker epitelantigen i blodprøver; (D) potentielle kræftpatienter, der ikke kan tidligt diagnosticeret ved rutinemæssige kliniske teknikker.

Boksen plot viser medianen, nedre og øvre kvartil (25., 75. percentiler). Datapunkter, der uden den 10. og 90. percentiler vises som outliers.

Selvom tumormarkører såsom serum CEA almindeligt anvendt til diagnosticering og opfølgning af patienter med gastrointestinale kræftformer, deres mangel på følsomhed forbliver uløst. Konventionelle billeddiagnostiske metoder og tumormarkører er til tider unøjagtige for kræft diagnose og overvågning af terapi reaktioner, hvilket resulterer i en forsinkelse i at dømme sygdomsprogression tidligt. I denne undersøgelse kunne påvises CTCs på alle 60 patienter rektal cancer, hvis CTC tællinger var alle over 3 celler pr prøve. CTC tællinger af rektal kræftpatienter var væsentligt højere end hos raske forsøgspersoner (167,33 ± 212.76 vs. 0,17 ± 0,59, P 0,05). Derudover patienter med fjernmetastaser havde signifikant højere CTC niveauer end patienter med fase II-III eller dem med lokalt recidiv (385,30 ± 245,86 vs. 39,40 ± 19,23 vs. 115,20 ± 69,15, P 0,05). Desuden CTC tællinger af lokale tilbagevendende patienter var også væsentligt højere end dem med fase II-III (P 0,05). Disse resultater viste, at CTC mængde korrelerede rimeligt godt med tumorbyrden og alvorligheden af ​​patienterne med forskellige stadier. Derfor CTC kunne være en lovende biomarkør for at gøre op utilstrækkelige konventionelle modaliteter kliniske afsløring. Sastre et al. [29] viste en tæt sammenhæng mellem CTC tæller og forskellige kliniske faser for kolorektal kræftpatienter, som var magen til vores resultater. Cohen et al. [30] viste, at CTC tæller før behandling og ved efterfølgende tidspunkter var uafhængige prognostiske faktorer for progressionsfri overlevelse og samlet overlevelse. Allen-Mersh et al. [31] viste, at CTC tæller inden 24 timer efter primær kolorektal cancer resektion var en stærk prædiktor for kolorektal cancer tilbagefald. Påvisningen af ​​CTCs kan også anvendes i målrettet genterapi. Yen et al. [32] fandt, at påvisning af Kras mutationsstatus i CTCs havde potentiale til klinisk anvendelse i udvælgelsen metastatisk kolorektal cancer patienter med størst sandsynlighed vil få gavn af behandlingen med cetuximab. Således kan påvisning af CTCs har en bred vifte anvendelse i kliniske omgivelser såsom diagnosticering af kræftsygdomme, overvågning af behandlingsreaktioner, prognose evaluering og selv beslutningstagning individualiseret terapi. Yderligere analyser herunder rolle CTCs på forudsigelse og evaluering af kræftpatienters overlevelse på lang sigt ved hjælp af vores mikrovæskeanordning vil blive gennemført i den nærmeste fremtid.

Sammenligning mikrofluidanordning vs. EpCAM-baserede metode

Anti-EpCAM magnetisk perle-baserede metode er i øjeblikket en af ​​de mest anvendte teknologier til CTC detektion [9] – [10]. Derfor sammenlignede vi udførelsen af ​​vores microdevice til tælling af tumorceller mod EpCAM-baserede berigelse metode. Først blev HT-29-celler med kendte numre tilsat til blodprøver fra raske donorer, og derefter hver prøve blev delt i to dubletter, en for vores enhed og en anden til EpCAM-baserede metode. De genvindingskvoterne af disse to metoder blev sammenlignet og analyseret. Som vist i tabel 1, genvindingskvoterne af tumorceller ved hjælp af denne microdevice alle var over 80% ved hver koncentration af tumorceller, mens genvindingskvoterne ved EpCAM-baserede metode var forholdsvis lavere, der spænder fra 36% til 81% (P 0,05). Desuden kunne vi ikke finde signifikant sammenhæng mellem genfindingsprocenten for mikrofluid enheden, og at af EpCAM-baserede metode (Correlation effektiv var 0,07, P . 0,05). Efterfølgende sammenlignede vi også udførelsen af ​​disse to fremgangsmåder, der anvender patienternes blodprøver og resultaterne blev demonstreret i tabel 2. Vi indsamlet og behandlet blodprøverne fra 60 patienter med rektal cancer, og hver prøve blev delt i to stykker for tumorceller påvisning ved hjælp af disse to metoder (tabel S2). For rektal kræftpatienter med forskellige stadier, de CTC tællinger detekteret af microdevice var alle signifikant højere end ved EpCAM-baserede metode (P 0,05). Antallet af isolerede CTCs varierede fra 0 til 100 sammenlignet med 0 til 12 (microdevice vs. EpCAM-baserede) per prøve for patienter med fase II-III (gennemsnit ± SD, 39 ± 19 vs. 4 ± 3), 4-210 vs . 3-31 for tilbagevendende patienter (115 ± 69 vs 12 ± 9) og 47-980 vs. fra 5 til 55 for metastatiske patienter (385 ± 246 vs 24 ± 15). For EpCAM-baserede metode, CTC tæller 38 (63%) patienter varierede fra 0 til 10, mens der i kun én patient (2%) var mere end 50. I modsætning til microdevice de CTC tællinger af 3 (5 %) patienter lå mellem 0 10, mens dem i 34 (57%) patienter var mere end 50. forskellen mellem disse to metoder var især tydeligt i 30 endetarmen kræftpatienter med fase II-III: De positive satser for prøver med mere end 3 CTCs pr 5 ml blod ved brug af microdevice var 100% (30/30), mens kun 47% (14/30) positive prøver kunne observeres ved EpCAM-baserede metode.

EpCAM- magnetisk perle metode er i øjeblikket en af ​​de mest udbredte metoder til isolering af CTCs. Men denne metode er afhængig af EpCAM-ekspression på måltumorcellerne. Selvom EpCAM-antigen kan findes i de fleste epiteliale tumorer, svag eller negativ EpCAM ekspression er blevet indikeret, hvilket formentlig er forbundet med fænomenet EMT [33] – [34]. Mange faktorer såsom kemoterapi kan sikkert fremkalde EMT, som kan påvirke fange effektiviteten af ​​tumorceller. I vores undersøgelse, for at mindske virkningen af ​​EMT, vi udnyttet en størrelse-baserede metode til påvisning CTCs stedet for EpCAM-afhængig én. Derfor teoretisk, flere tumorceller, herunder både EpCAM-udtryk positive og negative kunne opfanges af vores størrelse-baserede microdevice. Denne hypotese er i overensstemmelse med vores resultater over: Ikke kun i prøver med tumorceller tilsat til sund blod, blev flere CTCs isoleret ved vores microdevice, men lignende resultater blev valideret i prøver af rektal kræftpatienter så godt. Andre tidligere undersøgelser [35] -. [36], som sammenlignet størrelse-baserede og EpCAM-baserede metode, rapporterede lignende fund og viste, at en andel af celler isoleret efter størrelse tilgang manglede epitel egenskaber

På