PLoS ONE: Cell-til-Cell Signaling Påvirker skæbne prostatakræft Stamceller og deres potentiale for at generere mere aggressive tumorer

Abstrakt

Et stigende antal maligniteter har vist sig at blive påbegyndt og som drives af små subpopulationer af kræft stamceller (CSC). Men om tumor aggressivitet er drevet af CSC og omfang denne egenskab kan være relevant inden tumormassen er stadig urolig. For at løse dette problem, isolerede vi en sjælden tumor celle population på grundlag af sin CD44

+ CD24

– fænotype fra det menneskelige androgen-uafhængige prostata carcinom cellelinie DU145 og etablerede sine CSC egenskaber. Opførslen af ​​udvalgte CSC blev undersøgt med hensyn til bulk DU145 celler. Injektionen af ​​CSC i nøgne mus genererede stærkt vaskulariserede tumorer infiltrerer de tilstødende væv, der viser høj tæthed af neuroendokrine celler og udtrykker lave niveauer af E-cadherin og β-catenin samt høje niveauer af vimentin. Tværtimod når et sammenligneligt antal usorterede DU145 celler blev injiceret de resulterende tumorer var mindre aggressiv. For at undersøge de forskellige funktioner i tumorer

in vivo

blev indflydelsen af ​​differentierede tumorceller på CSC undersøgt

in vitro

ved at dyrke CSC i fravær eller tilstedeværelse af konditioneret medium fra DU145 celler. CSC dyrket i tolerante betingelser differentieret i cellepopulationer med funktioner svarende til celler holdes i aggressive tumorer genereret fra CSC injektion. Forskelligt, at konditioneret medium induceret CSC differentiere til en cellefænotype kan sammenlignes med celler af næppe aggressive tumorer stammede fra bulk-DU145 celle injektion. Disse resultater viser for første gang, at CSC er i stand til at generere differentierede celler, der udtrykker enten stærkt eller næsten aggressiv fænotype, idet de påvirker prostatakræft progression. Skæbne CSC blev bestemt ved hjælp af signaler, der frigives fra tumor miljø. Desuden bruger microarray analyse vi udvalgt nogle molekyler, som kan være involveret i denne celle-til-celle signalering, hypoteser deres potentielle værdi for prognostiske eller terapeutiske anvendelser

Henvisning:. Salvatori L, Caporuscio F, Verdina A, Starace G, Crispi S, Nicotra MR, et al. (2012) Cell-til-Cell Signaling Påvirker skæbne prostatakræft Stamceller og deres potentiale for at generere mere aggressive tumorer. PLoS ONE 7 (2): e31467. doi: 10,1371 /journal.pone.0031467

Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italien

Modtaget: Juni 8, 2011; Accepteret: 9. januar 2012; Publiceret: 6 februar 2012

Copyright: © 2012 Salvatori et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af det italienske sundhedsministerium (PRIN 2006062242). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prostata adenocarcinom (PCA) er en førende. dødsårsag blandt mænd i USA og Vesteuropa [1]. På grund af sin androgen-afhængige vækst, hormon ablation stadig den vigtigste behandling af metastatisk sygdom. Mens det i begyndelsen effektiv, er denne behandling følges i et par år ved tumor tilbagefald [2], hvori en androgen-uafhængig neuroendokrine (NE) delpopulation af celler menes at spille en vigtig rolle [3], [4]. NE celler er hvilende, terminalt differentierede celler er kendetegnet ved dendritceller-lignende processer strækker sig mellem tilstødende celler og ved ekspressionen af ​​neuronale-lignende proteiner, såsom CD56 og chromogranin A (CGA), der findes i tætte cytoplasmatiske granula [5]. Gennem udskillelsen af ​​neuropeptider NE celler modulere aktiviteten af ​​normale prostata epitel men er også i stand til at påvirke tilstødende transformerede epitelceller via parakrine signaler og derved stimulere tumorvækst og metastatisk kapacitet [5] – [7]. Faktisk er en øget NE cellepopulation i PCa menes at være forbundet med en mere aggressiv sygdom, hvorimod et lavt antal NE celler i tumorvæv har ingen specifik prognostisk betydning [6], [8], [9]. Interessant, både NE og sekretorisk epitel afstamning er afledt fra en fælles pluripotent prostatastamcellekultur [10].

En yderligere grundlæggende mekanisme er involveret i progressionen af ​​PCA nedsat ekspression af E-cadherin, den vigtigste transmembrane adhæsionsmolekyle ansvarlig for celle-til-celle-interaktioner og væv organisation i epitelceller [11], [12]. Gennem det cytoplasmatiske domæne, binder β-catenin, hvilket påvirker cytoskelet arrangement [13]. Som følge heraf er tab af E-cadherin funktion eller udtryk betragtes som en afgørende begivenhed i afbrydelse af celle-celle-adhæsion og cytoskeletale arkitektur og i købet af en invasiv fænotype i tumorceller [14]. Især i PCa, blev lavere ekspression af E-cadherin forbundet med mere avanceret tumor stadie og kvalitet [15], [16]. Dårligt differentieret prostatatumorer udviste også højere ekspression af vimentin, et cytoskelet komponent ansvarlig for at vedligeholde celle integritet, og høje niveauer af vimentin korreleret med den invasive kapacitet af prostatacancer-cellelinier, herunder DU145 [17].

Traditionelt tumorer er blevet anset for at være sammensat af heterogene celler med sammenlignelig ubegrænset proliferativ og tumorigent potentiale. Men er det for nylig blevet hypotese, at kun sjældne celler i tumor, navngivet cancer stamceller (CSC), er i stand til at formere sig i vid udstrækning og er tumorigen, mens hovedparten af ​​celler i tumormassen vise en variabel grad af differentiering og gennemgå en begrænset antal divisioner. Deres bidrag til tumorvækst og metastatization anses for at være ret begrænset. Vigtigere er det, denne model indebærer behov for en ny terapeutisk fremgangsmåde specifikt rettet mod CSC i forsøget på at endeligt udrydde tumoren [18]. Men om tumor aggressivitet er drevet af CSC og omfang denne egenskab kan være biologisk relevant inden for det naturligt forekommende tumor masse er stadig urolig.

Som tilstedeværelsen af ​​CSC i PCa [19] og prostatakræft-cellelinier [20] blev for nylig demonstreret på baggrund af overfladen antigene profil CD44

+ /α

2β

1

hi /CD133

+ og CD44

+ CD24

– henholdsvis i den foreliggende undersøgelse, vi havde til formål at vurdere bidraget af CSC til tumorudvikling. Vi isolerede CD44

+ CD24

– stamceller-lignende cancerceller fra androgenuafhængig prostatacancer-cellelinie DU145 afledt af en hjerne metastase af human PCa, viste deres CSC egenskaber, og undersøgte deres fænotype og adfærd i forhold til bulk DU145 celler. Vigtigt er, i denne model af prostatacancer observerede vi, at CSC kunne generere meget aggressive tumorer i NOD /SCID-mus, og at dette potentiale var begrænset af tilstedeværelsen af ​​differentierede DU145 celler med deraf følgende vækst af mindre aggressive tumorer. Konsekvent, ved at dyrke CSC i konditioneret medium fra DU145 celler

in vitro

, vi afslørede, at diffunderbare faktorer frigivet fra differentierede tumorceller var i stand til at begrænse CSC fra differentiere ind cellepopulationer viser en aggressiv fænotype og med funktioner svarende til dem, af celler holdt i tumorer frembragt i mus fra injektion af CSC. Endelig funktionel analyse af gener fundet differentielt udtrykt i CSC og DU145 celler ved mikroarray-analyse bekræftede den væsentlige rolle, som celle-til-celle signaleringsmolekyler at bestemme funktionen af ​​CSC. Yderligere undersøgelser udført også i andre modeller af prostatakræft kan tildele prognostisk eller terapeutisk værdi for denne signatur.

Resultater

Isolering og karakterisering af CSC fra DU145 prostatacancerceller

DU145 celler blev beriget ved hjælp af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) for befolkningen udtrykker CD44

+ CD24

– [20], som udgjorde omkring 10% af bulk DU145 celler (figur 1A). Vi testede stamceller-lignende egenskaber af udvalgte celler til ubestrideligt beskrive dem som prostata CSC. En meget lille procentdel af CD44

+ CD24

– isolerede celler var i stand til at generere ikke-adhærente sfæriske klynger, der betegnes sfæroider eller prostaspheres, i serumfrit medium suppleret med EGF, bFGF og insulin (Serum Replacement Medium, SRM ). Sfæroider voksede meget langsomt, idet størrelsen af ​​omkring 300 um inden for 6-8 uger (figur 1b). Som forventet blev spheroids beriget for CD44

+ CD24

– celler, som bestemt af både immunofluorescens (IF) farvning (data ikke vist) og kvantitativ real-time PCR (Q-PCR) analyse, med sammenlignelige resultater. Faktisk i sfæroider CD44 mRNA blev udtrykt på niveauer svarende til DU145 celler, hvorimod ekspressionen af ​​CD24 var signifikant lavere (figur 1C).

(A) FACS-analyse af CD44 og CD24 ekspression i DU145-celler. (B) Kultur af isolerede CD44

+ CD24

– celler, der vokser i SRM som adhærerende prostaspheres (5 × mål). (C) Q-PCR af CD44 og CD24-ekspression i sfæroid og DU145 celler. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM fra 3 eksperimenter. *,

s

0,05

vs

DU145 celler. (D) Self-fornyelse kapacitet sfæroider. Serum tilskud og tilbagetrækning af vækstfaktorer inducerer væksten af ​​sfæroide celler som adhærente celler med morfologien (E), proliferationshastighed (F) og ekspression af vimentin (G) sammenlignes med DU145 celler. Fotografier af kugleformede celler blev taget under et fasekontrastmikroskop efter 10 og 20 dages vækst i FBS-medium (20 ×). De repræsentative western blots viser ekspression af vimentin og β-actin i kugleformede celler dyrket i FBS-suppleret medium, hvad kontrol sfæroider og DU145 celler. Histogrammet viser den densitometrisk kvantificering af vimentin normaliseret til p-actin niveauer. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SEM fra 3 uafhængige eksperimenter. (H) Tumor incidens og latenstid efter injektion af en sfæroide, 5000 eller 3 × 10

6 DU145 celler i NOD /SCID-mus.

Spheroids indeholdt langsigtede selvfornyende celler, som demonstreret ved evnen af ​​en fraktion af celler fra dissocierede sfæroider at generere nye prostaspheres varede over 5 passager (figur 1D).

Vi observerede, kugleformede celler udviste differentiering kapacitet. Faktisk, når fjernet af vækstfaktorer og udsat for 10% FBS-holdigt medium, en betydelig del af kugleformede celler blev adhærerende, voksede som en flad monolag og viste en heterogen morfologi meget lig DU145-celler efter 20 dage (figur 1E). I de tidlige dage af vækst i disse tolerante betingelser udviste sfæroide celler en fordoblingstid på omkring 50 timer, der gradvist skal reduceres op til proliferationshastigheden af ​​DU145 celler, nemlig 30 timer, startende fra 15 dages dyrkning (figur 1F). Endvidere at bekræfte forekomsten af ​​fænotypen af ​​DU145 differentierede cancerceller analyserede vi ekspressionen af ​​det mellemliggende filament protein vimentin. Faktisk har vimentin ekspression blevet rapporteret at være moduleret under cellemodning ifølge cellelinje [21] og blev fundet stærkt udtrykt i DU145-cellelinje [17]. Faktisk, efter 20 dage i FBS-suppleret medium, vimentin-negative celler fra sfæroider udtrykte vimentin på niveauer kan sammenlignes med DU145 celler (Figur 1G).

Endelig har vi bestemt tumor-producerende evne kugleformede celler med hensyn til usorterede DU145 celler i immunsvækkede mus. Injektion af 1 sfæroid på 300 um i diameter, med ca. 5.000 celler, resulterede i tumorer i 80% af musene, mens injektion af 5.000 bulk-DU145-celler genereret tumorer i 40% af dyrene (fig 1H). Desuden tumor latens var også kortere i de sfæroide-injicerede mus end i mus injiceret med usorterede celler (37 og 54 dage, henholdsvis). Injektionen af ​​3 × 10

6 DU145 celler, som blev brugt som kontrol, genereret tumorer med det laveste latency i alle mus. I overensstemmelse med en tidligere rapport [20], alle sammen vores resultater viser, at CD44

+ CD24

– kugleformede celler til stede vigtige biologiske egenskaber af CSC, da de viste evne til selv-fornyelse, var i stand til at differentiere til forældrenes DU145 celler og var mere tumorigene end bulk-DU145 celler, når det samme antal celler blev injiceret i mus.

uensartede sammensætning af sfæroider Salg

sfæroider op til 300-400 um i diameter viste en kompakt arkitektur (figur 2A) på grund af tilstedeværelsen af ​​meget stramme celle-til-celle kontakter, som set på Transmission Electron Microscopy (TEM). High-power forstørrelse viste multiple forbindelsesepitoper komplekser dannet af desmosomer og adhærente junctions (figur 2B). Sfæroid celler præsenterede også nukleare pore komplekser organiseret i annulate lamellerne (Figur 2C), som anses for forstadier i samlingen af ​​nukleare indhylle. De er typisk til stede i embryonale og umodne celler og forsvinder under differentiering [22]. Men sfæroider også holde differentierede celler, der under disse dyrkningsbetingelser er selektive for stamceller, viste flere niveauer af celle nedbrydning. Navnlig karakteristiske cytoplasmiske bleb’er var tydelige (figur 2D), hvilket indikerer, at den nedbrydende fase nærmede celle nekrose (figur 2F), mens kerner optrådte meste intakt (figur 2E). Disse skader tyder terminalen skæbne differentierede celler.

(A) Fase kontrast evaluering af klumpformet struktur (10 ×). (B) TEM-analyse, der viser desmosomer og adhærente junctions (top og bund, henholdsvis) samt den annulate lameller (C) i kugleformede celler. (D) Fasekontrast (20 ×) af et fragment af sfæroid omgivet af celler karakteriseret ved fremspringende bleb’erne tom cytoplasma, som udgør intakte kerner som vist ved DAPI-farvning (40 ×, E). (F) Farvning med trypan blå viser tilstedeværelse af døde celler i sfæroider (10 ×). Immunofluorescens-farvning af en del af sfæroider og DU145 celler (oprindelig forstørrelse x 200), der viser ekspression af E-cadherin (G), β-catenin (H) og vimentin (I).

Sfæroider og DU145 celler blev også bedømt for ekspression af markører for stamceller (E-cadherin og β-catenin [23] – [25]) og differentierede celler (vimentin). Immunofluorescens-farvning identificeret E-cadherin og β-catenin-ekspression i begge cellepopulationer, men ved højere niveauer i sfæroider (fig 2G og 2H, henholdsvis). Især i kugleformede celler E-cadherin og β-catenin-farvning blev lokaliseret på plasmamembranen, mens det i DU145-celler var hovedsageligt cytoplasmisk, hvilket indikerer, at differentierede tumorceller var helt uafhængig af celle-til-celle-interaktioner. Den modne fænotype af DU145-celler blev ledsaget af en høj ekspression af vimentin, der tværtimod blev kun udtrykt af sjældne celler i sfæroider (Figur 2i). Derfor kan vi konkludere, at sfæroiderne er beriget til CSC, men også afholdt nogle beskadigede differentierede celler bestemt til nekrose.

Analyse af tumorer dyrket i mus

Sammenligning tumorer genereret i NOD /SCID mus efter injektion af 1 sfæroid (indeholdende cirka 5.000 totale celler, i betragtning både CSC og beskadigede differentierede celler) eller 5.000 usorterede DU145 celler (som indeholder hovedsageligt differentierede celler og en meget lille procentdel af CSC), flere makroskopiske forskelle var tydelige på tidspunktet for tumorexcision. Tumorer fra sfæroider voksede dybt ved injektionsstedet, invaderede tilstødende væv og viste markant vaskularisering. Forskelligt, tumorer med oprindelse fra DU145 celleinjektion voksede overfladisk og syntes godt afgrænset og mobil i forhold til de omgivende væv. Synlige fartøjer var sjældne eller fraværende (data ikke vist).

Disse forskelle blev bekræftet ved histologisk analyse. Sfæroid-afledte tumorer blev sammensat af monomorfiske celler med et højt kerne /cytoplasma ratio og præsenteret en markant infiltrativ vækst præget af bands invaderer de omkringliggende muskler og fedtvæv (figur 3A, venstre panel). Tværtimod blev tumorer genereret fra usorterede DU145 celler sammensat af morfologisk heterogene subpopulationer af celler og viste en ekspansiv vækst, komprimere stedet infiltrere de tilstødende værtsvæv (figur 3A, højre panel). Interessant nok viste meget invasive tumorer lavere ekspression af E-cadherin og β-catenin og højere ekspression af vimentin sammenlignet med næppe invasive tumorer (figur 3B). Især i hver tumor mønstret for ekspression af disse 3 markører var modsat den af ​​cellerne, som stammede tumoren selv, nemlig CSC eller DU145 celler (figur 2G-2H).

(A) Histologisk farvning med H 0,05 i forhold til tumorer genereret fra klumpformet. (E) IHC med anti-CD56-antistof viser højere tæthed af NE-celler i tumorer dannet fra sfæroid end fra DU145 celler (20 x). (F) Q-PCR viser CGA mRNA-niveau i tumorer. Resultater udtrykkes som forhold mellem målgenet og den endogene kontrol GAPDH og repræsenterer middelværdi ± SEM fra 3 uafhængige eksperimenter. *,

s

0,05 i forhold til tumorer genereret fra klumpformet. (G) Et repræsentativt FACS-analyse viser tilstedeværelse af CD44

+ CD24

– celler i tumorer genereret fra injektion af 1 sfæroide i mus. Tumorer, der hidrører fra indsprøjtningen af ​​5.000 DU145 celler viste en sammenlignelig CD44

+ CD24

– cellepopulation (data ikke vist)

tumorer genereret fra sfæroider viste også en signifikant højere antal. blodkar (

s Restaurant 0,0001), som overvåget ved farvning med den endotelcelle markør CD31 (figur 3C, venstre), sammenlignet med tumorer stammede fra DU145 celler (figur 3C, højre). Disse resultater blev bekræftet ved analysen af ​​CD31 mRNA-ekspression niveau (figur 3D) og angiver aktiv neoangiogenese i tumorer genereret fra sfæroider. Desuden viste immunhistokemiske (IHC) analyse et højere antal celler er positive for CD56, en markør for NE celler, mere invasive tumorer end i mindre invasive tumorer (Figur 3E). Denne observation blev bekræftet ved real-time PCR-analyse af CGA, en yderligere markør for NE-celler (figur 3F). Endvidere FACS-analyse af tumorer udskåret og fordøjet afslørede, at begge typer af neoplasi indeholdt en sammenlignelig CD44

+ CD24

– cellepopulationen (figur 3G). Disse iagttagelser giver bevis for, at CSC var i stand til at generere meget invasive tumorer i nøgne mus. Imidlertid injektion af CSC med DU145 differentierede tumorceller (dvs. injektion af usorterede DU145 celler) resulterede i væksten af ​​tumorer med lav grad af aggressivitet.

Virkning af konditioneret medium fra DU145 celler på differentiering af CSC

på baggrund af ovenstående resultater, vi undersøgte indflydelsen af ​​DU145 differentierede celler på udvalgte CD44

+ CD24

– prostata CSC

in vitro

. Dissekerede sfæroider blev dyrket i DMEM suppleret med FBS (for at simulere injektion af sfæroider i mus) eller i DMEM suppleret med FBS hvori DU145 celler tidligere var dyrket i 3 dage (konditioneret medium (CM), for at simulere injektion af bulk-DU145-celler hos mus). I begge dyrkningsbetingelser, CSC indeholdt i sfæroider voksede i monolag, men deres proliferation blev signifikant reduceret, når de blev dyrket i 20 dage i CM (-47%; Figur 4A). Inhiberingen af ​​sfæroide proliferation blev yderligere forbedret ved at øge koncentrationen af ​​CM (data ikke vist). Desuden viste det sig meget klart, at celler dyrket i FBS-holdigt medium var helt uafhængig af celle-til-celle-interaktioner som de voksede hovedsagelig enkeltvis eller i små grupper med uregelmæssig form, og deres morfologi og vækstmønster svarede til dem af DU145 celler (figur 4B, venstre panel). Tværtimod celler i CM var stram hinanden og voksede hovedsagelig som afrundede øer (figur 4B, højre panel). Interessant, efter 20 dage og kun i pladerne indeholdende FBS-suppleret medium, observerede vi udseendet af celler, der udviser den dendrit-lignende morfologi er typisk for NE-celler (figur 4B, venstre panel og figur 4C). Identiteten af ​​disse celler blev bekræftet ved evaluering af CD56-ekspression i de cytoplasmatiske granula af NE-celler (figur 4C, højre panel). Analysen af ​​ekspressionen af ​​markører for stamceller og differentierede celler fremhævet, at efter 20 dage i FBS-holdigt medium, celler udviste niveauer af E-cadherin, β-catenin og vimentin sammenlignelige med dem vist ved DU145 celler (figur 4D). Tværtimod celler dyrket i 20 dage i CM udviste ekspressionsniveauer mellemliggende mellem dem vist ved kontrol CSC og DU145 celler, men tættere på niveauerne af CSC. Især en reduktion i ekspressionen af ​​E-cadherin og β-catenin og en svag stigning i niveauet af vimentin, hvad kontrol sfæroider var tydelig (figur 4D). Det er interessant at bemærke, at både den høje ekspression af adhæsionsmolekyler og den lave ekspression af vimentin angivne stærke celle-til-celle-interaktioner og reduceret cellemotilitet henholdsvis som aftalt godt med den ejendommelige cellevækst som øer. Disse resultater indikerer, at CSC dyrket i tolerante betingelser var i stand til at generere terminalt differentierede celler, nemlig DU145 og NE-celler. Imidlertid diffunderbare faktorer frigivet fra DU145 celler forhindrede differentieringen af ​​CSC.

(A) Spredningen af ​​CSC indeholdt i sfæroider dyrket i FBS-holdigt medium eller i CM fra DU145-celler blev evalueret på forskellige tidspunkter af kultur. Data er vist som middelværdi ± SEM fra 3 eksperimenter. Stjerner angiver en signifikant inhiberende virkning af CM med hensyn til FBS-medium (*,

s Restaurant 0,05). (B) Fasekontrast (10 ×) af celler efter 20 dage i FBS-holdigt medium eller i cm, der viser forskellige mønstre af cellevækst. I venstre panel, rektanglet fremhæver tilstedeværelsen af ​​NE celler. (C) Fase kontrast (venstre, 20 ×) og IF farvning (højre, 40 ×) af forgrenede NE celler genereret fra CSC dyrket i FBS-medium. Især det højre panel viser ekspressionen af ​​CD56 i cytoplasmaet og i de lange celleprocesser. (D) Repræsentative western blots, der viser ændringer i ekspressionen af ​​E-cadherin, β-catenin, og vimentin i sfæroid CSC dyrket i de forskellige dyrkningsbetingelser, hvad kontrol sfæroider og DU145 celler. Ekspressionsniveauerne for de 3 proteiner blev bestemt ved densitometrisk analyse af de respektive bånd og normaliseret til p-actin niveauer. Værdier rapporteret i histogrammerne er gennemsnit ± SEM fra 3 uafhængige forsøg.

Gen-ekspression profil CSC og DU145 celler

For at undersøge det cellulære respons involveret i tumorigenese både på niveau med genekspression og ved præ-mRNA splejsning niveau, udførte vi en hel-genom, splejsning-sensitive microarray analyse af DU145 celler og deres valgte CSC. RNA-prøver fremstillet ud fra hver cellepopulation blev hybridiseret til human Exon 1.0 ST Arrays, som tillader definitionen af ​​begge transskription mønstre (gen-niveau analyse) og alternative præ-mRNA modning begivenheder (exon-niveau analyse). Gene-niveau ekspression profilering blev påvist ved lineær model statistikker under anvendelse af en empirisk Bayes metode til at moderere standardafvigelser. At evaluere transkriptionelle ændringer, vi analyserede genekspression ændringer i klumpformet CSC

vs

DU145 celler. For at identificere differentielt udtrykte gener, anvendt vi en absolut log

2-gange ændring ≥ +/- 1 og en P-value≤0.05 som cutoffs. Kompleksiteten af ​​datasættet blev reduceret ved at fjerne de ikke-signifikante probesæt (dem som ikke udtrykkes, og dem, der ikke ændrer sig). På denne måde, mere end 400 gener, hvis niveauer var signifikant forskellige i CSC og DU145 celler blev selekteret. En komplet liste over de differentielt udtrykte gener findes i tabel S1.

Analyse af udvalgte gener

De differentielt udtrykte gener blev analyseret for deres molekylære og cellulære funktioner og tilhørende veje ved hjælp opfindsomhed Pathways Analyse software (IPA 7,0, Ingenuity Systems). IPA-analyse identificeret over 70 funktionelle grupper, og blandt dem, vi valgte de 8 mest konsekvente klasser fundet beriget i sæt af differentielt udtrykte gener (dvs. cancer, cellulær bevægelse, cellulær vækst og proliferation, cellemorfologi, celledød, cellulære udvikling, cellecyklus, celle-til-cellesignalering og interaktion, figur 5A), der var velegnede til karakterisere CSC og DU145 celler. Vi kombinerede generne fra de 8 udvalgte funktionelle grupper, afsløre 22 almindelige gener stadig viser funktionelle links. Disse blev derefter adskilt efter deres cellulære lokalisering. Interessant, yderligere analyse af sub-udvalgte gener viste, at 17 ud af 22 genprodukter blev lokaliseret på plasmamembranen eller blev udskilt i det ekstracellulære rum (figur 5B), styrke vores ovenstående konklusioner, som viser betydningen af ​​samspillet mellem CSC og mikromiljø. Selvom de udvalgte gener kodede proteiner med en lang række funktioner, kunne 4 hovedgrupper identificeres: 1) Pro-angiogene faktorer angiopoietin 2 (ANGPT2), vaskulær endotelvækstfaktor C (VEGFC) og cystein-rige angiogen inducer 61 (Cyr61) blev fundet nedreguleret i CSC med hensyn til DU145 celler; 2) Gener, der koder for adhæsionsmolekyler E-cadherin (CDH1), integrin beta 6 (ITGB6) og krydset plakoglobin (JUP) blev udtrykt mere i CSC efter aftale med parallelle nedregulering af caveolae protein (CAV1); 3) tumorsuppressorgener lipocalin 2 (LCN2), dipeptidylpeptidase-4 (DPP4), insulin-lignende vækstfaktor-bindende protein 3 (IGFBP3), thioredoxin interagerende protein (TXNIP) og Kruppel-lignende faktor 4 (KLF4) blev opreguleret i CSC; 4) diffunderbare faktorer af relevans i opretholdelsen af ​​stamceller niche såsom epidermal vækstfaktor (EGF), knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP4) og transformerende vækstfaktor beta 2 (TGFB2) blev også forskelligt udtrykt i CSC og DU145 celler. Bemærkelsesværdige, 19 af 22 gener, som vi identificeret var ikke tidligere beskrevet at være unormalt udtrykt i prostata CSC. Disse data bekræfter, at interaktioner med mikromiljøet spiller en afgørende rolle i kontrollen af ​​fænotypen af ​​CSC og foreslå et begrænset antal gener, hvis relevans i CSC signalering skal undersøges. Desuden er de fleste af de 22 udvalgte gener kan være nye markører for prostata CSC.

(A) Udvalgt 8 top biologiske funktioner findes beriget i sæt af udskrifter moduleret i CSC med hensyn til det samlede DU145 celler ved microarray analyse. (B) De 22 deregulerede gener, som bestemt af IPA, er placeret i subcellulære layouts, og relationer er markeret med pile: fyldt og stiplede pile markerer direkte og indirekte vekselvirkninger, hhv. Gener i rød viste øget udtryk i CSC, mens gener i grøn blev nedreguleret. (C) Forskelle i genekspression bestemt ved microarray analyse blev bekræftet ved Q-PCR, vælger 7 repræsentative gener blandt udvalgte 22. Resultaterne udtrykkes som forholdet mellem hver målgenet og den endogene kontrol GAPDH. Expression i CSC blev sammenlignet med, hvad der blev observeret i DU145 celler, som en værdi svarende til 1 blev vilkårligt tildelt. Værdier er middelværdi ± SEM fra 3 eksperimenter. *,

s

0,05 i forhold til DU145 celler

Validering af genekspression

For at bekræfte forskelle i genekspression fundet af microarray analyse, Q. PCR blev udført i 7 differentielt udtrykte gener (CDH1, Cyr61, DPP4, IGFBP3, ITGB6, LCN2, TGFB2). I alle tilfælde blev de forskelle i mRNA-niveauer bekræftet (figur 5C).

rolle pathway af E-cadherin i differentieringen af ​​CSC

Q-PCR-analyse viste, at mRNA-ekspression af lipocalin 2 og E-cadherin fulgte en sammenlignelig tendens i CSC, DU145 celler og i CSC dyrket i 20 dage i FBS-holdigt medium eller i CM. Især mRNA-niveauer af begge gener var meget høj i CSC indeholdt i sfæroider, blev reduceret i CSC dyrket i CM og var signifikant lavere og sammenlignelige i CSC dyrket i FBS-medium og i DU145-celler (figur 6). Denne tendens var efter aftale med modulering af β-catenin udtryk tidligere observeret i de samme dyrkningsbetingelser (figur 4D). Tilsammen indikerer disse resultater, at vejen af ​​E-cadherin blev moduleret under CSC differentiering.

Q-PCR viser ændringer i mRNA-niveauer for lipocalin-2 og E-cadherin i DU145-celler, CSC indeholdt i kontrol sfæroider, og CSC dyrket i 20 dage i FBS-medium eller CM fra DU145 celler. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra 3 individuelle eksperimenter. Stjerner angiver en signifikant forskel (*,

s

0,05).

Diskussion

tumorfremkaldende i prostata CSC

CD44

+ CD24

– celler isoleret fra DU145 prostata carcinom cellelinie ved anvendelse celleoverflademarkører kunne vokse som ikke-adhærente sfæroider i serumfrit medium suppleret med specifikke vækstfaktorer. Som følge af asymmetriske stamceller celledeling sfæroider blev beriget i cancer stamceller (CSC), men også havde en procentdel af differentierede celler nærmer nekrose. Det skal bemærkes, at CSC var i stand til at undergå asymmetrisk deling også

in vivo

fordi efter injektion i mus, de begge producerede differentierede celler, der udgjorde størstedelen af ​​tumoren og selvstændige fornyet sig selv som demonstreret ved tilstedeværelsen af CD44

+ CD24

– celler i alle udskårne tumorer

En slående forskel i tumorigen kapacitet blev vist ved de forskellige forekomst og latens af tumorer med oprindelse fra klumpformet CSC eller DU145 celler injektion, med førstnævnte. cellepopulationen er mere tumorigene. Vi foreslår, at den forsinkede tumordannelse efter injektionen af ​​5.000 DU145 celler kunne tilskrives det ubetydelige antal CSC afholdt i DU145-celler injiceret i forhold til den berigede mængde CSC indeholdt i hver sfæroide. Disse resultater og dette forslag blev yderligere bekræftet ved injektion af 3 × 10

6 DU145 celler, som holdt en større mængde af CSC end en klumpformet og genererede tumorer i bare en uge.

Det er vigtigt, at yderligere