PLoS ONE: Slug-afhængig opregulering af L1CAM er ansvarlig for den Øget Invasion potentiale bugspytkirtelkræftceller efter langsigtede 5-FU Treatment

Abstrakt

Baggrund

Bugspytkirtelkræft adenocarcinom er en dødelig sygdom med 5-års overlevelse på mindre end 5%. 5-fluorouracil (5-FU) er en hovedstol første-linje-behandling, men behandlingen kun forlænger overlevelsen beskedent og er sjældent helbredende. Drug modstand og recidiv er typisk, og der er et presserende behov for at overvinde dette. For at undersøge erhvervet 5-FU modstand i pancreas adenocarcinom, vi etableret kemoterapi monoklonale cellelinjer fra Panc 03,27 cellelinie ved langvarig udsættelse for stigende doser af 5-FU.

Resultater

5 -FU-resistente cellelinier udviste forøget ekspression af markører associeret med multiresistens forklarer deres reducerede følsomhed over for 5-FU. Desuden viste 5-FU-resistente cellelinier ændringer er typiske for en epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), herunder opregulering af mesenchymale markører og øget invasionsevne. Microarray analyse afslørede L1CAM vej som en af ​​de mest opregulerede veje i kemoresistent kloner, og en betydelig opregulering af L1CAM blev set på RNA- og proteinniveau. I kræft i bugspytkirtlen, er udtryk for L1CAM forbundet med en kemoterapi og vandrende fænotype. Brug af esiRNA målretning L1CAM, eller ved at blokere den ekstracellulære del af L1CAM med antistoffer, viser vi, at den øgede invasionsevne observeret i de kemoresistent celler funktionelt afhænger L1CAM. Brug af esiRNA målretning β-catenin og /eller Slug, viser vi, at i de kemoresistent cellelinier, L1CAM ekspression afhænger Slug snarere end p-catenin.

Konklusion

Vores resultater etablere Slug-induceret L1CAM udtryk som en formidler af en kemoterapi og vandrende fænotype i pancreas adenocarcinom celler

Henvisning:. Lund K, Dembinski JL, Solberg N, Urbanucci a, Mills IG, Krauss S (2015) Slug-afhængig opregulering af L1CAM er ansvarlig for den Øget invasion potentiale bugspytkirtelkræftceller efter langsigtede 5-FU behandling. PLoS ONE 10 (4): e0123684. doi: 10,1371 /journal.pone.0123684

Academic Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES

Modtaget 2 oktober, 2014 Accepteret: 2 februar 2015; Udgivet: April 10, 2015

Copyright: © 2015 Lund et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medium, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

data Tilgængelighed: Microarray Data kan findes i GEOarchive, tiltrædelse nummer GSE58386. Alle andre relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. KL er grundlagt af Norges Forskningsråd, give nr. 205.783, og Affitech Research AS. Affitech Research AS delvis støttet KL under en industriel PhD sammen med Norges Forskningsråd, give nr. 205783. AU blev finansieret af Molecular Life Sciences (Oslo Universitet) og Helse Sør-Ost. NS blev finansieret af den norske Cancer Society. JLD blev finansieret af Norges Forskningsråd. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Affitech Research AS delvis støttet KL under en industriel PhD sammen med forskningsrådet Norge giver nr. 205783. Men Affitech Research AS har ingen økonomiske interesser i dette arbejde. Forfatterne erklærer, at dette ikke ændrer deres tilslutning til enhver PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Bugspytkirtelkræft adenocarcinom er en yderst dødelig sygdom. Den tidlige forløb af sygdommen er ofte asymptomatisk, der fører til kun 8% af tilfældene bliver diagnosticeret i denne fase. Udsigterne for sene adenocarcinom patienter er dyster, med kun 20% af patienterne være kandidater til kirurgi (på grund af sen diagnose /tumor metastase), hvilket resulterer i en overlevelse på mindre end 5% [1] 5-årig periode. Nuværende behandlingsmuligheder til rådighed kan forlænge overlevelsen og lindre symptomer hos patienter, men er ikke helbredende i de fleste tilfælde.

5-fluorouracil (5-FU) har i lang tid været en etableret form for kemoterapi for pancreas adenocarcinom, sammen med lægemidlet gemcitabin [2]. Men iboende (de novo) og erhvervet resistens er væsentlige hindringer for succes 5-FU baseret kemoterapi i bugspytkirtlen adenocarcinom og andre tumorer [3]. Erhvervet lægemiddelresistens, der udvikles under behandling, er ofte manifesteres ved flere resistente mekanisme og er derfor terapeutisk vanskeligt at ændre.

5-FU nedsætter biosyntesen af ​​pyrimidinnukleotider ved at hæmme thymidylatsyntase (TS), et enzym, katalyserer det hastighedsbegrænsende trin i DNA-syntese [4]. Selvom resistensmekanismer til 5-FU er fortsat uklart, har flere rapporter knyttet kemoresistens i forskellige faste tumorcellelinier til epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) [5-8]. EMT er en grundlæggende embryologiske proces karakteriseret ved ændringer i morfologi, cellulære arkitektur, signal- og vedhæftning fører til en vandrende fænotype [9]. Når EMT forekommer i tumorceller, disse celler mister deres epitheliale træk og få en mere invasive og vandrende fænotype, der fører til forøget metastatisk potentiale. Molekylære markører for EMT indbefatter forøget ekspression af vimentin og N-cadherin og forøget ekspression af transkriptionsfaktorer, der undertrykker E-cadherin ekspression, herunder Twist, sneglen, og Slug [10].

L1 celleadhæsionsmolekyle (L1CAM ) er en særdeles konserveret transmembrant glycoprotein af immunglobulin-superfamilien, der først blev identificeret til at spille en rolle i udviklingen og regenerering af neuronvæv [11]. L1CAM ekspression er blevet observeret i en række cancer-cellelinjer og væv, og høj L1CAM ekspression er ofte forbundet med dårlig prognose og korte overlevelsestider [12]. L1CAM er blevet forbundet med EMT i flere forskellige typer cancer, herunder pancreascancer [13-18]. Især har L1CAM blevet forbundet med en kemoterapi og vandrende fænotype i pancreas duktal adenokarcinom (PDAC) [19-21]. For at undersøge de mekanismer, der er involveret i købet af 5-FU modstand, vi etablerede 5-FU-resistente kloner fra pancreas adenocarcinom cellelinie Panc 03,27, og udsat de cellelinier til funktionelle tests og microarray analyse. De kemoterapi Panc 03.27 celler undergik fænotypiske ændringer i overensstemmelse med en EMT, og udtryk for EMT-relaterede markører, især L1CAM, steget betydeligt. Knockdown undersøgelser viste, at L1CAM ekspression i de 5-FU-resistente kloner var afhængig af transkriptionsfaktoren Slug men ikke på β-catenin, og knockdown af L1CAM bekræftet en funktionel forbindelse mellem L1CAM og det proliferative og invasive potentiale kemoterapi Panc 03,27 kloner. Knockdown undersøgelser viste endvidere, at L1CAM moderat beskyttet kemoterapi B1V celler fra apoptose induceret af 5-FU. Vores resultater giver yderligere indsigt i de molekylære mekanismer, der fører til en kemoterapi og vandrende fænotype i bugspytkirtelkræftceller og fremhæve betydningen af, Slug-induceret L1CAM udtryk i tilbagevendende PDAC.

Resultater

Udvikling af 5-FU-resistente kloner

Panc 03.27 5-FU-resistente cellelinier blev dannet ved kontinuert eksponering af tumorcellerne til 5-FU over en 6 måneders periode, der starter ved 0,5 ug /ml 5-FU og øget til 1 ug /ml over tid. For at verificere dosisafhængig kemoresistens af de opnåede kloner blev en dosis kurve køre til en række af 5-FU-koncentrationer (0,5-10 pg /ml) over en periode 6 dage. Som forventet kloner, som blev dyrket uden 5-FU selektion (opkaldt Nt og Nw) var følsom over for alle koncentrationer af 5-FU. I de kemoresistent kloner blev B1Q og B1V normal vækst set med doser på op til 1 ug /ml 5-FU, mens de højere koncentrationer af 5-FU (5-10 ug /ml) stadig hæmmet vækst

(Fig 1A)

.

(A) chemosensitive (Nt, Nw) og modstandsdygtig (B1Q og B1V) cellelinjer blev behandlet med 0-10 ug /m 5-FU) i løbet af 6 dage. Graf viser vækst vs. dages eksponering. (B) Western blot, der viser niveauerne af thymidylatsyntase (TS) i chemosensitive og kemoresistent cellelinier. (C) RNA niveauer (relativ mængde) af ABCB1 (MDR1) og ABCC5 som målt ved RT-PCR. (D) Western blot, der viser niveauerne af survivin i chemosensitive og kemoresistent cellelinier. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse. Statistisk signifikant forskel mellem chemosensitive og kemoterapi kloner (P 0,05) er angivet med *

5-FU-resistente kloner vise resistensmekanismer

5-FU følsomhed har. blevet vist at være omvendt proportional med graden af ​​thymidin-synthase (TS) protein i cancerceller, og 5-FU-resistente tumorer udtrykker almindeligvis høje niveauer af TS-protein [22,23]. Høj udtryk for TS i kræftvæv er en indikator for dårlig prognose for 5-FU-baseret kemoterapi for patienter med tyktarmskræft [24]. Proteinet niveau af TS blev analyseret i alle fire kloner. TS blev drastisk forøget i kemoterapi kloner B1Q og B1V, som det fremgår af Western blot analyse

(Fig 1B)

. Brug TaqMan RT-PCR, vi næste analyserede RNA niveauer af effluxpumper forbundet med 5-FU, og multiresistens [25,26]. Vi observerede en statistisk relevant stigning i ekspressionen af ​​udstrømningen pumper ABCB1 (MDR1) og ABCC5 (MRP5) i kemoresistent kloner sammenlignet med de chemosensitive kloner

(Fig 1C).

Niveauet af survivin var også stærkt steget i de kemoresistent kloner som bestemt ved Western blotting

(fig 1D).

survivin er en inhibitor af apoptose udtrykkes i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus og overekspression af survivin er forbundet med resistens over for apoptotiske stimuli inducerede ved kemoterapeutiske lægemidler [27,28].

5-FU-resistente kloner viser morfologiske ændringer, der er forbundet med EMT

Når morfologien af ​​5-FU-resistente kloner blev sammenlignet med følsomme kloner, den tidligere viste en mere mesenchymal-lignende fænotype, med celle spredning og øget dannelse af pseudopodia, mens de følsomme kloner viser en tætpakket epitelial morfologi

(fig 2A)

. De 5-FU-resistente celler dukkede større og mere strakte end de følsomme celler. Den mesenchymale-lignende fænotype, som blev opretholdt i over 30 passager, er i overensstemmelse med tidligere observationer af lægemiddel-induceret kemoresistens i cellelinjer [29,30].

(A) fasekontrast billeder viser celle morfologi normal (Nw, Nt) og kemoterapi kloner (B1Q, B1V), 40x. (B-D) RNA niveauer (relativ mængde) af vimentin, E-cadherin, og N-cadherin, som målt ved RT-PCR. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse. Statistisk signifikant forskel mellem chemosensitive og kemoterapi kloner (P 0,05) er angivet med *. (E-G) Western blot og immunofarvningsprocedure viser niveauerne af vimentin, E-cadherin, og N-cadherin, i chemosensitive (Nt, Nw) og kemoresistent (B1Q, B1V) cellelinier. (H) immunofarvningsprocedure og (I) Western blot, der viser niveauer af CD19 i chemosensitive og kemoresistent cellelinier. (J) kurve, der viser resultaterne af 24 timers invasion assays udført på klonerne, med fasekontrast billeder (20x), der viser repræsentative områder af invaderende celler farvet med krystalviolet farvning (K). Assay blev udført tre gange. Statistisk signifikant forskel mellem chemosensitive og kemoterapi kloner (P 0,05) er angivet med *

Vigtige kendetegnende for EMT er en nedregulering af epitelial markør E-cadherin ledsaget af en opregulering af N. -cadherin og vimentin [9]. Derfor viste kemoterapi kloner en stigning i vimentin

(Fig 2B og 2E)

og N-cadherin

(Fig 2D og 2G)

på både protein og RNA-niveauer, og en nedregulering af E -cadherin

(fig 2C og 2F).

Cytokeratin 19 (CK19) er et mellemprodukt filament, der er delvis ansvarlig for den strukturelle integritet af celler. Forskellige cytoskeletale ændringer inden en celle er forbundet med malign transformation, og et tab af CK19 er blevet forbundet med EMT [31] og multiresistens [32]. Når Nt, NW, B1Q og B1V kloner blev analyseret for ekspression af CK19 ved immunocytokemi og Western blot blev en massiv reduktion af CK19 findes i de kemoresistent kloner sammenlignet med 5-FU følsomme kloner

(Fig 2H og 2I).

at evaluere, om den ændrede morfologi, der blev observeret i de kemoterapi kloner var funktionelt signifikant, vi undersøgte de invasive egenskaber af klonerne ved hjælp af en matrigel invasion assay

(fig 2J og 2K).

kemoterapi kloner B1Q og B1V var 4 til 6 gange mere indgribende end de to chemosensitive kloner Nt og NW.

L1CAM opreguleres i de 5-FU-resistente celler

for at etablere en mere udtømmende molekylær profil mellem de følsomme og ikke-følsomme cellelinier udførte vi microarray analyse herunder 5-FU resistent cellelinje B1V og chemosensitive klon Nt. 607 gener blev anset som de præsenteret med log2 forandring 1

(S1 Fig)

. 319 gener blev fundet at være opreguleret og 288 gener blev nedreguleret mindst 2 gange i B1V sammenlignet med Nt (P 0,05)

(S1 og S2 tabeller henholdsvis)

. Gene Ontology analyse af de 319 opregulerede gener viste, at L1CAM interaktion pathway var en af ​​de mest opreguleres veje i chemosresistant kloner, sammen med cytokin og inflammatoriske reaktioner

(Fig 3A)

. L1CAM selv blev opreguleret 4 gange i de B1V celler sammenlignet med NT-celler. Der blev også fundet Kendetegnende for Wnt signalering og pluripotens, apoptose, serotonin transporteren aktivitet, monoamin transport og glykogen metabolisme at være opreguleret i B1V kemoterapi cellelinje

(Fig 3A og S1 tabel).

(A), Gene Ontology analyse af 319 gener opregulerede i B1V klonen sammenlignet med Nt klon af Panc 03,27 cellelinje. (B) RNA niveauer (relativ mængde) af L1CAM i chemosensitive (Nt, Nw) og kemoresistent (B1Q, B1V) cellelinjer, som målt ved RT-PCR. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse. Statistisk signifikant forskel mellem chemosensitive og kemoterapi kloner (P 0,05) er angivet med *. (C) Western blot, der viser niveauer af L1CAM i alle cellelinjer. (D) Flowcytometrisk analyse ved anvendelse af anti L1CAM-PE-antistof på alle cellelinier. Ufarvede celler er vist i grå og antistof-farvede celler er vist i sort. (E) immunofarvningsprocedure af L1CAM. Øget lokalisering af L1CAM membran kan ses i de kemoresistent linjer (B1Q, B1V). Billeder er taget med 40x forstørrelse

Stigningen i L1CAM i kemoterapi kloner blev bekræftet ved real-time PCR (P 0,05). Og Western blot analyse (

Fig 3B og 3C henholdsvis )

. Desuden flowcytometrisk analyse ved hjælp af et PE-konjugeret anti-L1CAM antistof viste berigelse af L1CAM positive celler i B1Q og B1V celle linjer

(Fig 3D)

. Til støtte for denne observation, immunhistokemi afslørede en tydelig L1CAM udtryk i membranen af ​​kemoterapi kloner B1Q og B1V men ikke i de chemosensitive celler Nt og Nw

(Fig 3E).

En del af de kemoterapi celler også udstillet nukleare L1CAM immunoreaktivitet.

L1CAM er involveret i proliferation og invasivitet af de 5-FU-resistente kloner, og moderat beskytter kemoterapi celler fra 5-FU-induceret apoptose

EMT er blevet forbundet med en øget invasionsevne af tumorceller [33], og tidligere offentliggjorte rapporter viste, at L1CAM udløser celle migration og invasion i flere tumortyper [15,18,34]. For at undersøge om opregulering af L1CAM er involveret i den øgede invasion potentiale kemoterapi celler blev ekspressionen af ​​L1CAM slået ned ved hjælp esiRNA. esiRNA er endoribonuclease forberedt siRNA pools bestående af en heterogen blanding af siRNAs at alle målrette den samme mRNA-sekvens. esiRNA behandling drastisk reduceret protein niveauet L1CAM i kemoterapi celle linjer B1Q og B1V

(Fig 4A)

, sammenlignet med celler transficeret med kontrol esiRNA (målrettet EGFP). Når analyseret for invasiv i en matrigel invasion kammer antallet af invasive celler efter L1CAM knockdown var signifikant lavere sammenlignet med den negative kontrol efter 24 timers invasion

(Fig 4B).

For yderligere at vurdere forholdet mellem invasiv af kemoresistent kloner og L1CAM ekspression blev celler behandlet med enten et antistof rettet mod ekstracellulære del af L1CAM (klon UJ127.11), eller et muse isotype kontrol antistof, før en invasion assay eksperiment (invasion assaytider blev øget til 48 timer). Vores resultater viser, at behandling af B1Q og B1V celler med L1CAM antistof signifikant reduceret deres invasionsevne sammenlignet med behandling med kontrolgruppen antistof. Derimod behandling chemosensitive Nt og NW-celler med L1CAM antistof havde ingen effekt på invasionsevne

(Fig 4C).

(a) Kontrollen western blot, der viser niveauerne af L1CAM efter transfektion med esiRNA målretning L1CAM eller styre esiRNA, som beskrevet i

Materialer og metoder

. Actin anvendes som lastning kontrol. (B) Graf viser antal invaderende celler (24 timer invasion assays) efter transfektion med esiRNA målrettet L1CAM eller kontrollere esiRNA. Eksperimenter blev udført to gange med lignende resultater. Repræsentative resultater er vist. (C) kurve, der viser antal af invaderende celler (48 h invasion assays) af celler behandlet med 2 ug /ml anti-L1CAM antistof (klon UJ127.11) eller kontrol isotype antistof i 1 time ved stuetemperatur, før de blev sat til invasion assayplade. (D) Incucyte vækstkurver (96 timer) i alle cellelinjer efter transfektion med esiRNA målrettet L1CAM eller kontrollere esiRNA. Eksperimentet blev udført i triplikater. (E) Den chemosensitive cellelinie Nt og kemoresistent cellelinie B1V (F) blev behandlet med 1 ug /ml 5-FU i 72 timer efter transfektion med esiRNA målretning L1CAM eller kontrol, og Annexin V flowcytometriske assays blev udført. Hvert assay blev gentaget to gange med lignende resultater. Procentdel i graferne viser Annexin V-positive celler.

Overekspression af L1CAM har vist sig at fremme tumorcelleproliferation, og følgelig kan inhibering af L1CAM ekspression eller funktion undertrykke proliferation [35-37]. For at undersøge om knockdown af L1CAM haft indflydelse på cellevækst i kemoterapi celler, udførte vi

in vitro

proliferationsassays. Alle cellelinier blev underkastet L1CAM og styre esiRNA behandling, og den procentvise sammenløbet blev målt over tid ved en IncuCyte automatiseret læser

(Fig 4D)

. Målinger startede 24 timer efter esiRNA transfektion. Vi har tidligere observeret at virkningen af ​​esiRNA knockdown på protein-niveau gradvist aftager efter 72 timer (resultater ikke vist), men for at opnå en ordentlig vækst kurve eksperimenterne blev kørt i mindst 96 timer efter transfektion. Kurverne vækst viste ingen effekt af esiRNA behandling rettet mod L1CAM på chemosensitive cellelinjer Nt og NW. Men kemoterapi cellelinjer B1Q og B1V de viste signifikant reduceret vækst efter L1CAM knockdown

(Fig 4D)

viser, at L1CAM udtryk er involveret i celledeling af de kemoterapi celler.

Når anti- L1CAM antistof, som inhiberede invasion i kemoresistent celler blev sat til

in vitro

proliferationsassays, kunne vi ikke se nogen forskel i procent cellekonfluens mellem celler behandlet med antistoffet sammenlignet med celler behandlet med kontrol antistof. Dette blev udført på alle fire cellelinier.

L1CAM er blevet vist at spille en rolle i mediering af kemoresistens mod gemcitabin og etoposid i PDAC cellelinier [38]. At vurdere, om L1CAM var involveret i mediering resistens mod 5-FU i den kemoresistent Panc 03.27 cellelinier blev Annexin V flowcytometrisk assays udført i Nt og B1V celler 72 timer efter celler blev behandlet med L1CAM eller kontrol esiRNA i nærvær og fravær af 1 ug /ml 5-FU. Som forventet, NT celler behandlet med en kontrol esiRNA viste en signifikant skift mod Annexin V-positive celler efter at være blevet udsat for 5-FU (fra 0,87% til 18,32%). I modsætning hertil kontrolbehandlede B1V celler kun viser en svag stigning (fra 1,19% til 2,22%) i Annexin V-positive celler som respons på 5-FU behandling

(Fig 4E og 4F)

. Knockdown af L1CAM ændrede ikke signifikant satserne for apoptose i chemosensitive cellelinje Nt, enten i nærvær eller fravær af 5-FU behandling sammenlignet med ctrl Knockdown

(Fig 4E)

. Imidlertid knockdown af L1CAM større procentdel Annexin V-positive celler, både med eller uden 5-FU behandling. Således L1CAM tilsyneladende moderat beskytte kemoterapi B1V celler fra apoptose i fravær af 5-FU, og endnu mere i nærvær af 5-FU

(Fig 4F).

Transkriptionel regulering af L1CAM afhænger Slug, men ikke på β-catenin

Tidligere undersøgelser har impliceret både Slug og β-catenin i den transkriptionelle regulering af L1CAM [14,39-41]. Slug er en transkriptionel faktor, der er involveret i EMT og invasivitet i bugspytkirtelkræft [34,42]. L1CAM anses for at være et mål af β-catenin, nøglen mediator af kanoniske Wnt signalering med en rolle i kontekstuelle regulering af spredning, beslutningspunkter mellem ‘stemness «og differentiering, cellulære metabolisme og EMT [39,43]. Da microarray analyse afslørede en opregulering af komponenter, der kan bidrage til kanoniske Wnt signalering i de kemoresistent celler

(Fig 3A)

, niveauerne af β-catenin i de chemosensitive og kemoterapi cellelinier blev undersøgt. RNA-niveauer af β-catenin blev signifikant forøget (P 0,05) i kemoterapi kloner

(Fig 5A)

, men i microarray stigningen var mindre end to gange og dermed ikke vises på listen af gener, der var mere end dobbelt opreguleret i microarray

(S1 Table)

. Western blots viser ingen forskel i niveauerne af total β-catenin-protein mellem chemosensitive og kemoresistent celler, hverken i cytoplasmaet eller i kernen.

(Fig 5A)

. Aktive β-catenin-niveauer, som målt med et antistof detektion kun aktiv (ikke-phosphoryleret) protein, blev ikke ændret enten (resultater ikke vist).

(A) RNA niveauer (relativ mængde, RT-PCR) og western blot, der viser proteinniveauer af β-catenin i chemosensitive (Nt, NV) og kemoresistent (B1Q, B1V) cellelinier. (B) RNA niveauer (relativ mængde, RT-PCR) og western blot, der viser proteinniveauer af Slug i chemosensitive (Nt, Nw) og kemoresistent (B1Q, B1V) cellelinier. Protein niveauer af Slug i western blot blev kvantificeret ved hjælp af billede Studio Lite (version 3.1.4) (normaliseret mod læsning kontroller). (C) Niveauer af L1CAM efter transfektion med esiRNA målrettet β-catenin eller kontrollere esiRNA. (D) Niveauer af L1CAM efter transfektion med esiRNA målrettet Slug eller kontrollere esiRNA. Kvantificering af båndintensiteter kan ses i de nedre paneler i (C) og (D). (E) kurve, der viser antal invaderende celler (24 h invasion assays) efter transfektion med esiRNA målretning Slug eller kontrol esiRNA, i kombination med 2 ug /ml anti-L1CAM antistof (UJ127.11) eller kontrol isotype antistof i 1 time ved stue temperatur. Eksperimenter blev udført to gange med lignende resultater. Repræsentative resultater er vist. Actin anvendes som lastning kontrol i alle western blots. Fejl barer i RT-PCR-grafer repræsenterer standardafvigelsen. Statistisk signifikante forskelle (P 0,05) mellem chemosensitive og kemoterapi kloner er angivet med *

Slug viste ikke ændringer i microarray, hvilket også blev bekræftet ved RT-PCR

. (fig 5B)

. Dog viste en Western blot-analyse en klar opregulering af Slug protein niveauer i både kemoterapi cellelinjer sammenlignet med den chemosensitive celle linjer

(Fig 5B).

At teste virkningen af ​​β-catenin og Slug på ekspressionen af L1CAM, både β-catenin og Slug blev ramt af esiRNA. Knockdown af Slug, men ikke β-catenin, føre til et fald i L1CAM protein niveauer

(Fig 5C og 5D).

Når Slug og β-catenin blev slået ned samtidigt i kemoterapi celler, ingen yderligere reduktion i niveauerne af L1CAM blev observeret (resultater ikke vist)

Når analyseret for invasiv efter Slug knockdown, B1Q og B1V celler vises reduceret invasionsevne forhold til de esiRNA kontrol celler (24 timer invasion;

fig 5E).

på en måde svarende til, hvad der blev set med knockdown af L1CAM

(fig 4B).

Forbehandling med L1CAM antistof udover Slug knockdown ikke yderligere reducere den invasive evne kemoresistent linjer

(fig 5E).

Selv om overtagelsen af ​​5-FU-resistens fremkaldt et væld af ændringer i Panc 03.27 bugspytkirtlen adenokarcinomceller, identificerede vi L1CAM og dens regulering gennem Slug som en vigtig formidler af en invasiv fænotype og erhvervet kemoresistens, og som et potentielt terapeutisk mål.

diskussion

5-FU var den systemiske terapi valg for fremskreden kræft i bugspytkirtlen i mange år, men i slutningen af ​​90’erne blev det vist, at stoffet gemcitabin var overlegen i forhold til 5-FU i kontrollerende sygdomsrelaterede symptomer [44]. Men 5-FU er stadig en mulighed anbefales behandling for kræft i bugspytkirtlen i dag [45], og flere nyere undersøgelser har vist en værdifuld rolle for 5-FU i kombinerede behandlingsprotokoller sammenlignet med enkelt gemcitabin kemoterapi [46,47].

Resistens mod kemoterapeutiske lægemidler er en væsentlig årsag til behandlingssvigt og dårlig prognose i kræft i bugspytkirtlen. I denne undersøgelse har vi vist, at kræft i bugspytkirtlen cellelinie Panc 03,27 udsat for langvarig udsættelse for 5-FU udviklet resistens og erhvervet prototypiske molekylære funktioner, herunder opregulering af thymidylatsyntase, survivin og narkotika pumper. Endvidere påviste vi, at de kemoresistent celler blev mere mesenchymal-lignende og gennemgik EMT-relaterede ændringer, herunder tab af epitel- markører (E-cadherin og CK19) og forøget ekspression af mesenchymale markører vimentin og N-cadherin, og den transkriptionelle faktor Slug . Vi viste en opregulering af L1CAM i 5-FU-resistente celler, hvilket er i overensstemmelse med tidligere resultater, der understøtter hypotesen om, at L1CAM opreguleres ved kræftceller som en del af EMT-processen [13-18]. Vi blev yderligere stand til at linke L1CAM til processen med EMT ved at påvise, at den øgede invasivitet af de kemoresistent celler var afhængig L1CAM, og at ekspression af L1CAM var afhængig af Slug. I tråd med denne observation, Gavert

et al

. viste, at stimulering af pancreas duktale epitelceller med TGF-β1 førte til erhvervelsen af ​​en spindel-formet celle morfologi og opregulering af mesenkymale proteiner og L1CAM udtryk, som var afhængig af JNK-medieret aktivering af Slug [40].

i brystcarcinoma MCF7 har opregulering af L1CAM blevet vist at føre til afbrydelse af E-cadherin-holdige adherensovergange og derved øget transkriptionsaktivitet β-catenin [48]. Aktivering af β-catenin bidrog til vedvarende L1CAM udtryk og forbedret celle motilitet [48], hvilket er i overensstemmelse med andre beviser for, at L1CAM er et mål for β-catenin signalering [39]. Men vores resultater viser ikke ændret protein ekspression eller lokalisering af β-catenin i de kemoresistent celler, og endnu vigtigere, havde knockdown af β-catenin ikke reducere niveauet af L1CAM, hvilket indikerer, at L1CAM ekspression ikke blev reguleret af β-catenin i disse celler. Vores resultater er således i tråd med resultaterne af Pfeifer

et al

. viser i endometrisk carcinom, at Slug, og ikke β-catenin, der er ansvarlig for opregulering af L1CAM [41].

Overekspression af L1CAM har vist sig at fremme tumorcelleproliferation, og inhibering af L1CAM ekspression eller funktion kan undertrykke proliferation [35-37]. Knockdown af L1CAM reduceret spredning i kemoterapi Panc 03,27 celle linjer

(Fig 4D)

. Denne reduktion i væksten blev ikke set i de chemosensitive cellelinjer ikke udtrykker L1CAM. Vores resultater peger i retning af en specifik rolle L1CAM i udbredelsen af ​​5-FU-resistente bugspytkirtelkræftceller. Yderligere arbejde er nødvendigt for at forstå virkningen af ​​L1CAM på proliferation imidlertid andre rapporter peger mod et link til Erk1 /2 og Akt-veje, som både er kendt for at accelerere proliferation og vækst af tumorceller [35,37,49 , 50]. Desuden kan den reducerede proliferation set for kemoresistent kloner følgende L1CAM knockdown i fig 4D dels være et resultat af den lille stigning i apoptose ses i fig 4F, efter L1CAM knockdown.

Interessant nok forøgede invasionsevne vises af vores kemoresistent kloner blev reduceret, når L1CAM blev slået ned, eller når den ekstracellulære del af L1CAM blev blokeret med et antistof. Øget invasionsevne gennem opregulering af L1CAM er muligvis en af ​​mange regler nedstrøms for Slug efter induktion af EMT.

Der er nogle modstridende rapporter om, hvilken rolle L1CAM spiller i færd med EMT. For eksempel Gavert

et al

. viste for nylig, at L1CAM medieret metastase af coloncancerceller var undværlig for EMT induktion og en ændret ekspression af epitel- og mesenchymale markørproteiner [51]. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at uddybe, om opregulering af L1CAM er en del af EMT eller endda den inducerende begivenhed. L1CAM måske ikke være en EMT-mægler selv, men ser ud til at være reguleret af EMT-induceret Slug, og en gang udtrykte det synes at køre invasion.

L1CAM har vist sig at være involveret i formidling af kemoresistens mod gemcitabin og etoposid i PDAC cellelinjer [38]. Vi undersøgte om knockdown af L1CAM reducerede erhvervet resistens over for 5-FU vises af cellelinien B1V. I vores hænder, L1CAM syntes at moderat beskytte celler fra apoptose i fravær af 5-FU, og endnu mere i nærvær af 5-FU.

Yderligere undersøgelser er planlagt til at undersøge, om behandling med anti-L1CAM antistoffer vil reducere væksten eller metastase af vores 5-FU-resistente bugspytkirtelkræft cellelinier

in vivo

. Konstateringen af, at bugspytkirtelkræftceller med erhvervet resistens over for 5-FU show forøget ekspression af L1CAM, foruden sondringen L1CAM tilstedeværelse i kræft vs normale væv [52], gør os håb om, at målretning af L1CAM med terapeutiske antistoffer og /eller i kombination med 5-FU kan potentielt gavne udvalgte patienter med refraktære bugspytkirtlen tumorer. follows;

ABCB1-Hs00184500_m1

ABCC5-Hs00981087_m1

CTNNB1-Hs00355049_m1

GAPDH-Hs02758991_g1

Vimentin-Hs00185584_m1

CDH1/Ecadherin-Hs01023894_m1

CDH2/Ncadherin-