PLoS ONE: Aerosol azacytidin Forhindrer ortotopisk lungekræft i mus gennem sine DNA Demethylering og Gene Reaktivering effekter

Abstrakte

Vi udtænkt en aerosol baseret demethylering behandling for at opnå terapeutisk effekt i præmaligne eller in situ læsioner af lungekræft, uden systemisk toksicitet. Optimale regimer af aerosoliseret azacytidin (Aza) blev udformet og anvendt i ortotopisk humane ikke-småcellet lungekræft xenograftmodeller. Den terapeutiske virkning og toksicitet af aerosol Aza blev sammenlignet med intravenøst ​​administreret Aza. Vi observerede, at 80% af dråberne af aerosol Aza målte ~0.1-5 mikron, hvilket resulterede i aflejring i de nedre bronchiale luftveje. En dyremodel, der fænokopier felt carcinogeneisis hos mennesker blev udviklet af intratracheal indpodning af de humane lungecancerceller i mus, hvilket resulterer i deres fordeling i hele luftvejs plads. Aerosoliseret Aza forlængede signifikant overlevelsen af ​​mus med endo-bronkial lungetumorer. Den aerosol behandling forårsagede ikke nogen påviselig lungetoksicitet eller systemisk toksicitet. En præ-farmakokinetisk undersøgelse i mus viste, at lungeaflejring aerosoliseret Aza var signifikant højere end den intravenøse rute. Lungetumorer blev reseceret efter aerosol behandling og methylering niveauer af 24 promotorer af tumor-suppresser gener relateret til lungekræft blev analyseret. Aerosol Aza reducerede signifikant methylering niveau i ni af disse initiativtagere og reexpressed flere gener testet. Det kan konkluderes, aerosol Aza på ikke-cytotoksiske doser synes at være effektiv og resulterer i DNA-demethylering og tumorsuppressorgen re-ekspression. Det terapeutiske indeks aerosol Aza er 100 gange højere end for intravenøs Aza. Disse resultater giver en præklinisk rationale for en fase I klinisk afprøvning af aerosol Aza skal iværksættes på vores institution

Henvisning:. Qiu X, Liang Y, Sellers RS, Perez-Soler R, Zou Y (2014) Aerosol azacytidin Hæmmer ortotop lungekræft i mus gennem dens DNA Demethylering og Gene reaktivering effekter. PLoS ONE 9 (10): e109874. doi: 10,1371 /journal.pone.0109874

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Marts 19, 2014 Accepteret: 12. september 2014 Udgivet: 27 oktober 2014

Copyright: © 2014 Qiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen understøttes af en NIH tilskud 5R01CA154755. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft hævder 1,4 millioner liv om året (https://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index.html~~number=plural) [1], [2]. Lungekræft opstår som følge af kumulativ skader i bronkieepitel forårsaget af inhalerede kræftfremkaldende stoffer. Fordi den kumulative skade påvirker hele luftvej, beskadiget luftvejsepitel er tilbøjelige til at udvikle yderligere primære tumorer i et individs levetid [3]. Alle ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) stammer fra bronkieepitel dækker store eller små luftveje, hvilket giver anledning til centrale eller perifere tumorer. For eksempel pladecelle-lungecarcinom oftest opstår centralt i store bronkier, lunge adenocarcinomer udvikler typisk perifert i de mindre luftveje, og store celle lungecarcinomer kan opstå i enten placering. Men alle tumorer stammer fra transformerede luftvejs epitelceller. Derfor selektiv terapeutisk intervention for tumorer begrænset til luftvejene effektivt bør hæmme eller forsinke deres dannelse uden at forårsage systemisk toksicitet [4] – [7]. Desværre, ingen behandlinger specifikt rettet mod den bronkieepitel er i øjeblikket tilgængelige

Øget viden inden for området epigenetik og carcinogenese har ført til den konklusion, at afvigende epigenetiske ændringer spiller en vigtig rolle under lunge carcinogenese.; Desuden er disse ændringer opretholdes gennem hele processen med sygdomsprogression [8], [9]. For eksempel er nedregulering af tumorsuppressorgener (GTS) af Aberrant hypermethylering vist sig at spille en vigtig rolle i cancer initiering og udvikling i flere typer cancer [10] – [19]. TSG promotor hypermethylering er også blevet vist at korrelere med dårlig prognose og resistens mod kemoterapi [20] – [26]. Især kunne alle genetiske læsioner i lungekræft, herunder p53 og k-ras-mutationer, være konsekvensen af ​​afvigende epigenetiske ændringer [10], [27], [28]. Epigenetiske ændringer er reversible kræftfremkaldende begivenheder [10], [29]. Den kræft-specificitet af disse epigenetiske ændringer gør dem unikke mål for specifikke epigenetiske behandlinger [30]. Derfor er vi hypotesen, at ved at målrette luftvejene epitel med en demethyleringsmiddel, ved aerosol administration, kan vi påvirke positivt naturhistorie lungekræft.

Tidligere vi observeret, at hypermethylering i promotorområdet af Rassf1 genet i menneskelig NSCLC cellelinje H226 kan vendes ved demethyleringsmiddel azacytidin (Aza). Vi har også demonstreret, ved hjælp af en klinisk relevant dyremodel er udviklet af vores laboratorium, at intratracheal injektion (en lignende form for lokal administration som aerosol) af Aza på sub-toksiske doser kan øge overlevelsen af ​​mus orthotopisk implanteret H358 og H460 lungecancer [31 ], [32]. Dette klinisk relevant dyremodel var proof of concept, der luftveje målrettet epigenetisk terapi kan have en fordel i forebyggelse og behandling af tidlig NSCLC. Her rapporterer vi om effektiviteten af ​​aerosoliseret Aza i behandlingen af ​​ortotopisk humane NSCLC xenograftmodeller i mus samt terapiens effektivitet på demethylering af specifikke promotorer af GTS i tumorvæv. For at belyse de epigenetiske terapeutiske mekanismer, vi resektion tumorvæv fra xenotransplanterede dyr behandlet med aerosol Aza, analyseret status methylering af initiativtagerne til 24 lunge kræftrelaterede GTS, og bestemt protein ekspressionsniveauerne for de gener, der viste betydelig promotor demethylering efter aerosol Aza behandling.

Materialer og metoder

cellelinjer

Menneskelig NSCLC cellelinjer H226, H358, og H460 blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og holdt i en 37 ° C inkubator med 5% CO

2 og 95% luft.

Dyr

Male og kvindelige ICR og Athymiske nøgne mus, 6-8 uger gamle (Harlan) blev anbragt i dyret facilitet på Albert Einstein College of Medicine. Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen (Protokol nummer: 20.130.312) blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Albert Einstein College of Medicine. I overlevelse undersøgelse blev dyrene observeret dagligt. Humane endpoints blev brugt under denne undersøgelse: døende blev humant aflivet. Vi brugte to kriterier til at identificere de døende dyr baseret på vores brug dyr protokol: 1) mus har svært ved at trække vejret, spise eller drikke; 2) en mus mister ≥15% kropsvægt i 4 dage. Mus blev aflivet ved CO2 i en indånding kammer efterfulgt af forblødning. Anæstesi blev anvendt til at minimere ubehag under intratracheale injektioner.

Intratracheal injektion

I intratracheal (IT) injektion blev en bolus af celler i suspension eller lægemiddel injiceret i trachea. Den anvendte procedure for IT injektion er tidligere blevet beskrevet af os [33]. Kort fortalt er musene bedøvet ved med en Isofluran fordamper på 2,5% isofluran leveret med 2,0 PSI af ilt og immobiliseres ved hjælp af en fastholdelsesanordning. Munden er åbnet med en pincet og en lille rørformet lyskilde er indsat i munden for at lokalisere luftrøret, hvis det er nødvendigt. En 22 G fodring nål fastgjort til en 1 ml injektionssprøjte indeholdende cellesuspensionen eller lægemiddelopløsning er indsat i trachea. Ca. 3 pi opløsning /g legemsvægt injiceres derefter intratrachealt. Musen frigives fra fastholdelsesanordningen ved afslutningen af ​​proceduren og observeret indtil fuld bedring efter anæstesi.

ortotopisk endobronkial lungekræft xenograftmodeller

Athymiske nøgne mus blev bedøvet som tidligere og menneskelig beskrevet NSCLC cancerceller i suspension blev omhyggeligt inokuleret i trachea (ca. 2-4 x 10

6 celler /mus) ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet ovenfor. I disse modeller, flere tumorer vokser inden de pulmonære luftveje. Levetiden for dyrene korrelerer med tumorbelastning, som er relateret til størrelsen af ​​podestoffet.

aerosolformulering

Azacytidin (Sigma) blev opløst i sterilt normalt saltvand ved 10 mg /ml lige før dosering. Den aerodynamiske størrelse aerosol Aza blev bestemt med ekstrudering-præcipitationsmetode under anvendelse af en 7-Stage Cascade Impactor forbundet med PARI s forstøver-system ifølge producentens anvisninger [34]. Aerosol-administration. Aerosolen blev frembragt under anvendelse af et PARI personlige kompressor og LC Stjerne forstøver-system. Aerosolen generation var omkring 0,25 ml /min. En næse-only eksponeringssystemet (CH Technologies Inc. Westwood, NJ) bundet til PARI s aerosol-system i et lukket kemisk hætte blev anvendt til aerosol administration til mus. Aerosolindgivelsen (min) (T) blev strengt kontrolleret. Aerosolen dosis deponeres i lungerne (mg /m

2) (D) blev beregnet ved at multiplicere eksponeringstiden (min) ved inhalationsraten aerosol (ml /min) (R) og lægemiddelkoncentrationen (mg /ml) (C) som tidligere beskrevet af os [34], dvs. D = TRCi /W, hvor jeg er legemsoverflade /vægt index (mg /m

2: mg /kg) (3 for mus), og W er dyrenes legemsvægt (kg). I en tidligere undersøgelse, målte vi aerosol inhalation hos mus, defineret som volumenet af aerosol væske deponeret i muselunger i 1 min blev omkring 10

-4 ml /min i en 25 g mus [34]. Den ønskede deponerede dosis opnås ved at styre aerosol tid som T = DW /RCI. For eksempel aerosolindgivelsen tid til en deponerede dosis på 2,5 mg /m

2 i en 25 g mus under anvendelse af en 10 mg /ml Aza koncentration løsning er T = 2,5 x 0,025 /10

-4 × 10 × 3 = 20,83 min.

Toksicitetsundersoegelse

ICR-mus (6 /gruppe) blev behandlet med aerosol Aza på 2,5 eller 75 mg /m

2 dagligt × 7 dage. En gruppe mus blev behandlet med IT Aza i den maksimale tolererede dosis på 270 mg /m

2 som positiv kontrol for lungetoksicitet. Lungerne blev reseceret 7 dage efter den sidste aerosol administration. Lungen toksicitet blev bestemt ved patologisk evaluering (3 lunger /gruppe) under anvendelse af en tidligere beskrevet metode [34]. Desuden blev levedygtigheden af ​​luftvejs-epitelceller også bestemt (3 lunger /gruppe). Kort fortalt lungevævet blev fordøjet med Liberase (Roche) og filtreret til opnåelse af en enkelt cellesuspension, som blev mærket med anti-muse Ep-CAM-antistof og fluorescens-konjugeret gede-anti-rotte-sekundært antistof (Biolegend, San Diego, CA), og sorteret ved flowcytometri. Procentdelen af ​​levedygtige celler blev bestemt ved udelukkelse af 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol-farvning. Den systemiske toksicitet blev bestemt ved måling blodlegemer som indikator for myelosuppression (den alvorlig toksicitet ved IV Aza) [35]. Blodprøver blev taget på tidspunktet for eutanasi ved hjertepunktur 7 dage efter sidste behandling. blev bestemt det samlede antal hvide blodlegemer (WBC) efter fjernelse af røde blodlegemer som beskrevet tidligere [32].

Pre-farmakokinetisk undersøgelse

Normale ICR-mus fik aerosoliseret Aza 2.5 mg /m

2 under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet ovenfor. På hvert designet tidspunkt (5 min, 20 min, 2 timer, 6 timer og 24 timer), tre mus blev aflivet, og deres lunger blev reseceret efter højre ventrikel perfusion med saltopløsning. Azacytidin i lungerne blev ekstraheret og kvantitativt målt med en tidligere rapporteret fremgangsmåde ved LC-MS-system [36]. Den kvantitative påvisning blev udført ved Millis Scientific Inc. Følsomheden var 1 ng Aza /ml prøve. koncentrationen Aza i væv vs. time data blev analyseret og simuleret med den bedste fitting (den højeste R

2 værdi) under Microsoft Excel-programmet. Ligningen af ​​de simulerede kurver C = f (t) blev anvendt til at beregnet AUC fra 0 til 24 timer som AUC = ∫

0-24 f (t) dt. Toppet tid (T) og maksimal koncentration blev opnået direkte fra observation af kurverne.

antitumorvirkning

Ti dage efter intratrakeal podning af tumorceller, de nøgne mus blev tilfældigt opdelt i 3 grupper (6 mus /gruppe): 1) aerosoliseret Aza ved 2,5 mg /m

2 dagligt i 7 dage, 2) aerosoliseret normalt saltvand (vehikel) dagligt i 7 dage, 3) eller IV Aza ved 75 mg /m

2 dagligt i 7 dage. I denne overlevelse undersøgelsen blev dyrene observeret dagligt. Humane endepunkter for eutanasi (tidligere beskrevet) blev anvendt under denne undersøgelse og døende mus blev aflivet på human vis, og mus blev obduceret. Den Øget levetid (% ILS) [37] blev anvendt til at vurdere effekten af ​​hver testet middel.

Histologi af lungekræft implanteret

Mus fra anti-tumor effekt studiet blev obduceret efter døden og lunge- og tumor- prøver til histologi blev opsamlet og anbragt i 10% neural pufret formalin. Prøverne blev overført til 70% ethanol og forelægges Histologi og sammenlignende Patologi Shared Resource på Einstein til rutinemæssig behandling til paraffin. Væv blev snittet til 5 um, farvet med hematoxylin og eosin (H 0,5 mm) stykker af en Eppendorf-rør homogenisator. Hver tumor prøve blev delt i to portioner: en for methylering assay og en anden til western blot. status methylering af promotorområder af 24 tumorsuppressorgener, der er involveret i lunge carcinogenese blev målt under anvendelse af en methylering qPCR array metode Qiagen (SA Bioscieces) som tidligere beskrevet [38].

Analyse af proteinekspression i lungetumorer

den anden portion af lungen tumorprøver blev anvendt til at bestemme protein ekspression af GTS. De GTS viser betydelig promotor demethylering efter aerosol Aza behandling som analyseret af methylering qPCR array blev udvalgt til evaluering af western blot. De frosne væv blev homogeniseret i kold RIPA puffer med protease inhibitor cocktail (Sigma) under anvendelse af en hånd homogenisator, efterfulgt af lydbehandling. Proteinprøver blev fremstillet til Western blot efter en rutine protokol fra Life Technologies (Grand Island, NY). Primære antistoffer mod human H-cadherin, OPCML, Rassf1a (Abcam), SFRP1 (Epitomics, Burlingame, CA), og beta-actin (Santa Cruz Biotechnology) blev anvendt til at identificere de målrettede proteiner. LI-COR C-cifret Blot Scanner blev brugt til at scanne Western blots; båndene analyseredes af Image Studio software (LI-COR). Forholdet tæthed af målrettet protein vs. actin ladningskontrol af hver prøve blev anvendt til at præsentere proteinekspressionsniveauer semikvantitativt.

Statistisk analyse

Forskelle blandt forskellige grupper blev analyseret ved to-side Log-rank (Mantel-Cox) test. En forskel blev betragtet som statistisk signifikant, når p. 0,05

Resultater

ortotopisk NSCLC modeller

NSCLC er en sygdom i luftvejene epitel som følge af kronisk eksponering af luftbårne kræftfremkaldende stoffer . For at efterligne denne særlige tumorvækst i luftvejene i en xenograft model, vi intra-trachealt inokuleret humane NSCLC-celler direkte i luftvejene, og derefter sammenlignet denne form for transplantation til IV injektion af tumorceller i nøgne mus. Histologisk undersøgelse af lungen afslørede, at tumoren distribution og vækstmønster var mere ligner human lungecancer i IT implantation model: størstedelen af ​​frøet kræftceller på overfladen af ​​luftvejsepitel på cirka en uge efter implantation. Ved 3 uger blev små mucosale tumorknuder lokaliseret i luftvejene eller lungevævet støder op til luftvejene, hvilket indikerer primær tumorvækst i luftvejene og invasion til lungeparenkymet (figur 1 øverste række). Den tumorvækst og størrelse er celle line-og inokulum størrelse-afhængig. Det er vores erfaring, H460 (storcellet carcinom) tumorer udviklet hurtigere end H358 (bronchioalveolar karcinom) og meget hurtigere end H226 (planocellulært karcinom), når podet IT i mus. I mangel af enhver intervention, mus bukke under for lungetumorer mellem dag 40 og 102. Der var ingen identificerbare fjernmetastaser. I modsætning hertil næsten alle synlige /detekterbar IV implanteret cancerceller podet i kapillærsystemet af lungen og relativt langt væk fra luftvejene (figur 1 nederste række), mere ligner metastatiske tumorceller migrerer fra andre organer til lungen. Tumorerne udviklede også hurtigere end efter it implantation, og musene sædvanligvis døde på dag 35 til 68 (data ikke vist). Vores resultater tyder på, at it-implantation er en mere hensigtsmæssig ortotopisk xenograftmodel til at efterligne menneskelige NSCLC end IV model eller andre ektopiske modeller.

Modellen blev skabt af intratrachealt injicere NSCLC H460 celler i nøgne mus. Top: H E farvede lunge sektioner fra IT podet mus på dag 35. De tumorer (T) opstå inden luftvejene og vokse vicinalt ind lungeparenkym. Nederst: H E farvede lunge sektioner fra IV podede mus på dag opstår 35. Tumorer i små fartøjer i lungeparenkym. Målet forstørrelse var 40X. Skalaen søjler var 50 um.

Aerosol formulering

Vi har udviklet en aerosol formulering til prototypiske demethylering agent, Azacytidin (Aza). Formuleringen er sammensat af Aza og injektion kvalitet sterilt normalt saltvand eller vand. Den Aza magt kan hurtigt opløses ( 30 sek) i den vandige opløsning lige før aerosol-administration. Det er blevet foreslået, at aerosoldråber 5 um, især 3 um, i indskud diameter hyppigst i de nedre luftveje, og derfor er egnede til farmaceutisk indånding af aerosolpræparater af mennesker [39] [40]. Vi målte den aerodynamiske størrelse af Aza aerosolformulering under vores aerosoldannelse system med den ekstrudering-fældningsmetoden [34], og fandt, at omkring 80% af dråberne (vægt%) var mellem 0,25-5 um i diameter og ca. 71% mellem 0.25~3 um (figur 2). Vores resultater tyder på, at ca. 71~80% af dråberne skulle deponere i den distale luftveje hos mennesker [39] [40].

T bestemmes med ekstrudering-præcipitationsmetode under anvendelse af en 7-Stage Cascade Impactor knyttet til PARI s personlig kompressor og LC stjerne forstøver-system. Aza opløsning (4 ml) blev aerosoliseret ved en luftstrøm på 5 l /min. De kondenserede aerosol prøver blev opsamlet ved 3 forskellige intervaller, fra 1 til 1,5 min, den 3.-3,5 min, og fra 5 til 5.5 min. Aerodynamisk størrelse og brøkdel af aerosol med en bestemt størrelsesområde blev målt og beregnet ifølge producentens protokol. Dataene var middelværdi ± standardafvigelse af den aerodynamiske på basis af vægt (solide søjler) og kumulativ vægt (tomme søjler) fra 3 uafhængige forsøg.

Toksicitet og dosis udvælgelse

Fra vores tidligere undersøgelse har vi lært, at den effektive demethylering koncentration af Aza for dyrkede celler kunne være 3 logs lavere end IC

50. Den antitumor effektive dosis (7,5 mg /m

2 × 3) ved intratrakeal injektion af Aza i musemodel forårsagede ikke lungetoksicitet eller påviselig systemisk akut toksicitet, og lungetoksicitet kun forekom ved den højeste dosis på 270 mg /m

2, som var den maksimalt tolererede dosis af IV injektion [32]. Baseret på disse resultater har vi udvalgt en dosis til aerosol Aza at vi forudsagde ville have demethylering funktion og terapeutisk effektivitet uden signifikant toksicitet. Resultaterne viser, at den valgte aerosol dosis på 2,5 mg /m

2 (ca. 21 min aerosol eksponering for en 25 g mus) dagligt i 7 dage eller en højere intratracheal bolusinjektion dosis på 75 mg /m

2 for 5 dage bevirkede ikke nogen påviselig lungetoksicitet (evalueret histologisk) eller systemisk toksicitet (målt ved myelosuppression) på dag 7 efter den sidste administration (figur 3A, B). Pulmonal toksicitet (pneumonitis) (figur 3C) og myelosuppression (figur 3D) kun opstod, når musene fik den højeste dosis af intravenøs eller intratrakeal injektion af Aza på 270 mg /m

2 (MTD intravenøs Aza). Tilsvarende har aerosol Aza ved den valgte terapeutiske dosis ikke forårsage nogen død luftvejsepitelceller bestemt ved flowcytometri, sammenlignet med den positive kontrol i mus behandlet med den højeste IT doser Aza ved 270 mg /m

2 ( Figur 3E).

Lung sektioner af mus behandlet med aerosol Aza ved 2,5 mg /m

2 × 7 (A), it Aza ved 75 mg /m

2 × 7 (B), og IT Aza på 270 mg /m

2 × 5 (C), viser henholdsvis ingen toksicitet ved 2,5 og 75 2,5 mg /m

2, men pneumonitis på 270 mg /m

2. Målet forstørrelse var 40X. Skalaen søjler var 50 um. Hvide blodlegemer ratio (efter behandling vs. før behandling, n = 6) (D) og procentdelen af ​​levedygtige celler af sorteret luftvejsepitelceller (n = 6) (E), henholdsvis.

Terapeutisk virkning

Systemisk (IV) administration af Aza har ført til kun begrænset effekt i NSCLC patienter [41] [42], som er blevet sammenfattet i vore eksperimentelle musemodeller af NSCLC behandlet med IV Aza, (figur 4A-C). Der er faktisk lidt eksperimentelle beviser støtte brugen af ​​en demethylering middel til effektivt at hæmme lungekræft i dyremodeller [43] [32]. En af de mulige årsager er, at dette meget ustabil lægemidlet ikke var effektivt leveret til lungetumorer. Vi var den første gruppe til at rapportere et proof of concept studie, hvor administrationen af ​​Aza direkte i luftvejene effektivt forlængede overlevelsen af ​​mus med ortotopisk lungekræft [32]. I den aktuelle undersøgelse, er vi rapportering af resultaterne ved hjælp af aerosol Aza til behandling i humane ortotopisk NSCLC xenografter i mus. Et af vores mål var at demonstrere, at aerosol levering af Aza til luftvejsepitel effektivt kunne inhibere væksten af ​​klinisk relevante NSCLC modeller. Desuden blev disse undersøgelser yderligere designet til at undersøge, om aerosol levering af demethyleringsmiddel kunne inhibere væksten af ​​tumorer inden luftvejene ved lave demethylering doser snarere end cytotoksiske doser (figur 4A-C).

Mus intratrachealt inokuleret med cellelinier H226 (A), H358 (B) eller H460 (C) blev behandlet med aerosol Aza (rød tyk linie) ved 2,5 mg /m

2 dagligt i 7 dage eller aerosol køretøj (blå tynd linje) med det samme volumen. Behandling med IV Aza (stiplet linie) ved den optimale dosis på 75 mg /m

2 dagligt i 5 dage blev anvendt som kontrol. Den statistiske sammenligning af overlevelseskurverne blev udført med Log-rank (Mantel-Cox) test. P-værdier for H266, H358, og H460 modeller var 0,0135, 0,0150 og 0,0719, henholdsvis. Pre-farmakokinetik aerosolen Aza (D). ICR-mus blev behandlet med aerosol Aza ved 2,5 mg /m

2. Dataene på hvert tidspunkt var den gennemsnitlige ± standardafvigelse for den procent af afgivet /initialdosis fra lungerne hos 3 mus. Ligningen for hver kurve blev simuleret kurve med den bedste fitting (den højeste R

2-værdi) under Microsoft Excel-programmet.

Vores resultater viser, at en lav dosis aerosol Aza signifikant forlænget levetiden af musene bærende endobronchiale tumorer. De% ILS og median overlevelse blev forlænget med 5.1- og 1,5-, (p = 0,0135), 6.4- og 1.9- (p = 0,0150), og 8.9- og 1,6 (p = 0,0719) fold i grupperne behandlet med aerosol aza anvendelse af en dosis mere end 20 gange lavere end den dosis, der anvendes i den systemiske behandling kontrolgruppen, i H226, H358, og H460 model hhv. Disse resultater viser klart, at aerosol administration af Aza på demethylere, ikke-cytotoksiske doser er overlegen i forhold til systemisk administration af Aza i form af tumorvækst hæmmende effekt.

Pre-farmakokinetik

For at bestemme deposition af Aza i lungerne gennemførte vi pre-farmakokinetiske undersøgelser in vivo. Intravenøst ​​injiceret Aza med samme dosis blev anvendt en sammenligning. På det første tidspunkt (3 min, det tidligst mulige tidspunkt), kunne vi genvinde ~89% af den oprindelige aerosol dosis fra lungerne. Men når den samme dosis blev givet ved systemisk injektion, maksimal koncentration i lungerne var kun 1,62% af den oprindelige dosis. Arealet under koncentration vs tid-kurven (AUC

0~24 h) aerosol Aza var 15 gange større end den for IV Aza (tabel 1). Aza givet via begge ruter viste et tilsvarende fald mønster: et hurtigt fald inden for de første 2 timer efter administrationen fulgt op af en langsommere tilbagegang. Aerosoliseret Aza viste en langsommere fald i langsommere fase, mens IV Aza viste en forsinket toppede koncentration i lungen (figur 4D). Disse data viser, at aerosoliserede Aza har koncentration højere væv i lungerne med forudsigelig lavere systemisk eksponering end IV Aza.

Aerosol Aza demethylering

For at analysere, om Aza har en demethyleringsmiddel effekt i de klinisk relevante NSCLC modeller, vi høstede de lungetumorer fra xenograftmodeller behandlet med aerosol Aza eller IV Aza og bestemmes status methylering af promotorområder af 24 tumorsuppressorgener, hvis promotor hypermethylering er blevet rapporteret som relevant i lungekræft litteratur. Normale bronkiale epitelceller fra dyr uden Aza behandling blev anvendt som methylering basisliniekontrol. De 24 GTS udvalgte er APBA1, APC, CADM1, CDH1, CDH13, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CXCL12, CYP1B1, DLC1, FHIT, MLH1, MTHFR, PAX5, PRDM2, RaRb, RASSF1, RASSF2, SEMA3B, SFRP1, SLIT2, TCF21 og TGFB1. Vi fandt, at 11 af de 24 promotorer blev hypermethyleret i tumorprøverne fra 3 forskellige xenograftmodeller og at aerosol Aza kunne demethylate 5 af dem (figur 5A). I kontrakt, IV Aza i samme dosis viste ingen demethyleringsmiddel effekt (figur 5B). De i figur methylering level 5 skildre data detekteres af en Q-PCR methylering array og præsenteres som% methylering af den samlede CG cytosin af den særlige promotor regionen.

tumorbærende mus fra 3 ortotopisk lungekræft modeller (H226-xeno, H358-xeno, og H460-xeno) blev behandlet med aerosol Aza (A) eller IV Aza (B) ved 2,5 mg /m

2 dagligt × 7. Lungerne blev resektion 14 dage efter den sidste behandling og tumor knuder større end 1,5 mm blev isoleret for methylering afsløring af qPCR array teknologi på Qiagen (SA Biosciences). Dataene er% methylering af det samlede CG cytosin af den særlige promotor-regionen.

TSG re-udtryk

For at analysere, om demethylering ved promotor-regionen i GTS kan genaktivere den GTS, vi resektion lunge tumorer og målt protein udtryk for GTS, hvis initiativtagerne var signifikant demethyleres efter aerosol Aza behandling. Western blotting assay blev anvendt til påvisning af genekspression i tumorprøverne fra de samme mus anvendt i demethylering undersøgelsen. Vi valgte 5 GTS hvis promotorer var signifikant demethyleres efter aerosol Aza behandling. Vi fandt, at H-Cad og Rassf1 i H266 tumorer, H-cad, OPCML, og SFRP1 i H358 tumorer, og OPCML i H460 tumorer blev genaktiveret på proteinniveau (figur 6A og B) efter aerosol Aza behandling. Ekspression af disse GTS er blevet vist at inhibere eller forsinke udviklingen af ​​kræft i flere typer af cancer, herunder lungekræft. For eksempel har vi rapporteret før dette tab af H-cadherin i human NSCLC er associeret med tumorigenicitet [44]. Promotorregionen Rassf1a findes også kraftigt methyleret i lungekræft [45]. OPCML, en bred tumor suppressor oprindeligt fundet i ovariecancer, findes methylerede i mange lungekræft cellelinjer [46]. SFRP1 i Wnt signalvejen er transkriptionelt tavse af promotor hypermethylering i NSCLC [47]. Resultaterne af denne in vivo-undersøgelse indebærer, at aerosol demethyleringsmiddel behandling kan være effektive til inhibering af endo-bronkial lungetumorer og bronchiale præmaligne læsioner.

Western blotting assay blev anvendt til at bestemme protein ekspression af GTS med betydelig promotor demethylering efter aerosol Aza behandling identificeret ved methylering q-PCR array. Tumorprøverne var de samme som anvendt i figur 5; Histogram af Western blots (B). Western blot foto film blev scannet og forholdet tæthed af målrettet protein vs. actin lastning kontrol af hver prøve blev præsenteret som det protein udtryk niveau.

Diskussion

Lungekræft ses som en “genetisk sygdom” [48], [49]. Efter påvisning af, at GTS deaktivering og onkogen aktivering spiller en kritisk rolle i carcinogenese, har de terapeutiske indsats gradvist flyttet fra optimere uspecifikke stråling og kemoterapi former for terapi, der primært dræber hurtigt delende celler til at udvikle midler, der er målrettet mod specifikke genetiske ændringer . Seneste tyder en direkte sammenhæng mellem afvigende epigenetiske ændringer og kræft udvikling; betyder det, at cancer er også delvis en epigenetisk sygdom. I modsætning genetiske ændringer, forekommer epigenetiske ændringer tidligere i cancer progression og er reversible. Derfor bør en terapeutisk strategi sigter mod at vende afvigende epigenetiske ændringer være en mere effektiv strategi end dem, der fokuserer på brugen af ​​ikke-specifikke cytotoksiske midler eller på at målrette irreversible genetiske defekter.

Ifølge feltet cancerization model [3 ] [50], alle bronchiale epitelceller akkumulere epigenetiske og genetiske læsioner, indtil en enkelt celle erhverver en malign fænotype og giver anledning til en invasiv tumor, mens de resterende af marken fortsætter akkumulere epigenetiske og genetiske skader og er i risiko for at udvikle anden primær lungekræft (anden primærvalg) [51] [52]. Under denne proces, de afvigende epigenetiske ændringer, såsom hypermethylering af initiativtagerne til GTS, ske før og kan forårsage de efterfølgende genetiske ændringer, og de fortsætter i tumorceller gennem hele processen med carcinogenese.

På denne