PLoS ONE: En optimeret GD2-Targeting retroviral kassette for mere potent og sikrere Cellular Behandling af neuroblastom og andre kræftformer

Abstrakt

Neuroblastom er den hyppigste ekstra kranie fast kræft i barndommen. Trods optrapning af behandlingsregimer, et betydeligt mindretal af patienterne dør af deres sygdom. Disialoganglioside (GD2) er konsekvent udtrykkes ved høje-niveauer i neuroblastomtumorer, som er blevet målrettet med nogen succes under anvendelse af terapeutiske monoklonale antistoffer. GD2 udtrykkes også i en række andre kræft, men med undtagelse af nogle perifere nerver er stort set fraværende fra ikke-transformerede væv. Kimære Antigen Receptorer (biler) er kunstige type I proteiner, som pode specificiteten af ​​et monoklonalt antistof på en T-celle. Kliniske data med tidlige bildesign rettet mod GD2 har vist en vis løfte i neuroblastom. Her beskriver vi en GD2-targeting CAR retroviral kassette, der er optimeret til CAR T-celle vedholdenhed, effekt og sikkerhed

Henvisning:. Thomas S, Straathof K, Himoudi N, Anderson J, Pule M ( 2016) En optimeret GD2-Targeting retroviral kassette for mere potent og sikrere Cellular Behandling af neuroblastom og andre kræftformer. PLoS ONE 11 (3): e0152196. doi: 10,1371 /journal.pone.0152196

Redaktør: Sophia N. Karagiannis, Kings College London, England

Modtaget: Januar 27, 2016 Accepteret: 10 marts 2016; Udgivet: Marts 31, 2016

Copyright: © 2016 Thomas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. undersøgelsen blev finansieret af neuroblastom Society nu re-mærket “neuroblastom UK”. Denne lille velgørenhed forudsat et tilskud på £ 133,000 i 2005 til et projekt med titlen “Genetic Engineering af T-celler til adoptiv immunterapi af neuroblastom”. Martin Pule er støttet af den britiske NIHR Biomedical Research Centre og Wellcome Trust. John Anderson er støttet af Great Ormond Street Hospital, Biomedical Research Centre og Great Ormond Street Hospital Børns Charity. Karin Straathof er støttet af Great Ormond Street Hospital, Biomedical Research Centre og Wellcome Trust. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. MP har modtaget støtte kontraktforskning fra Cellectis. Han ejer lager og modtager løn bidrag fra Autolus Ltd. Han er en opfinder på patenter indgivet af UCLB og har modtaget og kan modtage royalties derfra. Han har modtaget honorarer fra Roche og Amgen for at tale. JA og ST ejer bestand fra Autolos Ltd. De er opfindere om patenter indgivet af UCLB og kan modtage royalties herfra. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Neuroblastom tegner sig for ca. 15% af kræftdødsfald hos børn [1]. Trods markant intensivering af behandlingen, mindre end 40% af højrisikopatienter er langsigtede overlevende, med kemoterapi og strålebehandling modstand og sene tilbagefald er det kendetegnende for behandlingssvigt [2]. Disialoganglioside (GD2), en overflade, glycolipid antigen, der er allestedsnærværende og rigelig på neuroblastomceller, samt at have kræft-specifik ekspression i en række voksne og pædiatriske maligniteter [3], er et ideelt mål for immunterapi [4]. Faktisk anti-GD2 monoklonale antistoffer i øjeblikket en del af standard behandling for høj risiko neuroblastom, og deres effekt og toksicitet profil er veletableret [3,5].

Administration af tumor-specifikke T-celler (adoptiv immunterapi) har vist sig at være en effektiv behandling af cancer i Epstein-Barr-virus-drevne lymfomer [6] og melanom [7] med responser i voluminøse resistent sygdom. Det har dog ikke været muligt at generere neuroblastom specifikke T-celler under anvendelse af traditionelle metoder til udvælgelse og ekspansion. Kimære antigen-receptorer (biler) kan konstrueres ved at forbinde en enkelt kæde variable region (scFv) fra et monoklonalt antistof mod intracellulære signalsystemer domæner. GD2-targeting CARs derfor opnåelse os en alternativ fremgangsmåde til frembringelse af neuroblastom specifikke T-celler ved genetisk manipulation. GD2 CAR behandling kan resultere i forbedrede reaktioner end mAb terapi på grund af en vedholdende og dynamisk afvisning af GD2-tumor.

Et fase I klinisk studie med anti-GD2 CAR transducerede T-celler i recidiverende neuroblastompatienter højrisiko rapporteret en vis effekt [8]. En mulig begrænsning af denne undersøgelse var brugen af ​​en første generation CAR, giver kun CD3ζ Itam signaler, som kan have resulteret i dårlig vedholdenhed og ekspansion. Et stigende krop af kliniske data for CD19 CAR i B-celle cancerformer samt en dobbelt-mærkning undersøgelse [9] antyder, at biler giver ekstra co-stimulerende signaler resultere i forbedret vedholdenhed og virkning. Her beskriver vi vores bestræbelser på at konstruere en mere potent, men sikkert GD2-targeting kassette til brug mod neuroblastom, som benytter en tidligere beskrevet tredje generation endodomain [10]. Fokus i dette arbejde er optimering af de resterende CAR arkitektur og ekspressionskassette for maksimal effekt og sikkerhed.

Den undersøgte i undersøgelsen rapporteret af Pule et al CAR brugte en scFv afledt fra 14-18, et mAb, som i en kimær form, er i øjeblikket i regelmæssig klinisk anvendelse. Vi har derfor anvendt en målretningsdomæne fra en anden anti-GD2-mAb familien at undgå anti-idiotype afstødning /aktivering af CAR T-celler. For at reducere risikoen for afstødning blev en humaniseret version af bilen testet og iterative optimering af CAR arkitektur blev udført. Anti-GD2-mAb-behandling er associeret med perifer neurotoksicitet. Mens den indledende GD2 CAR undersøgelse ikke rapportere dette [8], dvæler den bekymring, som i stigende grad potente biler er indført i klinikken. I forventning om denne eventualitet, vi co-udtrykte CAR med iCasp9 selvmord gen [11] og optimeret en bi-cistroniske retroviral kassette for at opretholde co-ekspression og konsistent transgen output. Den endelige konstruktion blev testet in vivo. Vi har genereret en GD2 CAR målrettet retroviral kassette optimeret til effektivitet og sikkerhed.

Resultater

CAR med humaniseret scFv giver tilsvarende udtryk og øget cytokinfrigivelse og T-celle ekspansion

KM8138 er et fuldt humaniseret anti-GD2-monoklonalt antistof fremstillet ved podning epitopen bindende komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) af murine anti-GD2-antistof KM666 på kompatible humane V

H og V

L rammeregioner [12]. Det resulterende humane scFv-sekvensen adskiller sig fra den murine i 31 rester i skeletregionerne uden for CDR’erne. Murint antistof 14.18-afledte scFv anvendt i tidligere beskrevne GD2 biler må være et mål for immunafstødning enten på grund af anti-idiotype (siden terapeutiske mAb’er i nuværende klinisk anvendelse er afledt af den samme klon) eller fra anti-muse-antistoffer. Vi afledt derfor en bil baseret på humaniserede KM8138 antistof [12]. For at bestemme eventuelle konsekvenser af at bruge et humaniseret scFv vi genererede også et CAR afledt af forældrenes museantistof derfor vi genererede et par anti-GD2 CARs identiske bortset fra deres scFv’er, som blev afledt fra en muse anti-GD2 mAb KM666, eller sin humaniseret modstykke KM8138 [12]. Bilerne havde humane IgG1 hængsel-Fc afstandsstykker, CD28 transmembrane domæne og den CD28-OX40-Zeta endodomain (Fig 1A). I første omgang søgte vi at sammenligne udtryk og funktion af dette humaniseret CAR (HuK666) med sin murine modstykke (MuK666). Normal donor humane T-celler blev transduceret med lige titere af retroviral vektor, der koder for hver receptor. Overfladeekspression af hver CAR bestemmes ved flow-cytometri med et polyklonalt anti-Fc var identiske (Fig 1B). Mean fluorescensintensitet (MFI) af transducerede T-celler var ikke forskellig mellem humaniserede og murine biler. Transducerede T-celler var i en 4-timers chromfrigivelsesassay CD56-depleteret T-celler, der udtrykker enten CAR demonstrerede sammenlignelig aflivning af GD2-bærende Lan-1 neuroblastomcellelinje og en tilsvarende mangel på aktivitet mod A204 osteosarkom cellelinie, som mangler ekspression af GD2. Hverken ikke-transducerede T-celler (NT) eller T-celler transduceret med et irrelevant CAR rettet mod CD19 viste nogen cytotoksicitet til enten cellelinje (figur 1C) begge receptorer var stand til at stimulere proliferation af transducerede T-celler som brønde som sekretionen af ​​IL2 og IFN-g som reaktion på LAN1 men ikke A204 (figur 1D). Der var ingen signifikant forskel mellem huK666 og muK666 biler til proliferation (Fig 1D), interferon γ frigivelse (Fig 1E), eller interleukin 2 (IL-2) udgivelse (Fig 1F), selv om der var en ikke-signifikant tendens til alle tre i retning af øget funktion af huK666 CAR.

(a) sammenligning af aminosyresekvenser af huK666 og muK666 scFv’er sammenlignes. Komplementaritetsbestemmende regioner er vist med rødt. Linkersekvensen er vist i grøn. På højre, arkitekturer af bilerne genereret for indledende sammenligning af huK666 med muK666. Begge adskiller sig kun i scFv’er anvendes, bliver enten de oprindelige murine muK666 sekvenser eller det humaniserede (CDR graftede) huK666. Ellers bilerne består af et humant IgG1 hængsel-CH2-CH3 spacer, en TM domæne afledt af CD28 og en forbindelse endodomain bestående af fusioner mellem endodomains fra CD28, OX40 og CD3-Zeta. (B) Stabilitet af muK666 vs huK666 Cars. T-celler fra 5 donorer blev transduceret med lige titere af retroviral supernatant koder for muK666 eller huK666 biler. CAR-ekspression blev påvist ved anti-human-Fc polyklonale antistoffer. MFI var identisk i begge konstruktioner. Et repræsentativt eksempel er vist med NT (grøn), muK666 (blå) og huK666 (rød) histogrammer overlejret. Disse CAR T-celler blev udfordret med LAN-1 (a neuroblastomcellelinje udtrykker GD2) og A204 (en rhabdomyosarcoma cellelinie, som er GD2 negativ). Cytotoksicitet er vist i (c), proliferation på dag 7 er vist i (d), IFN-γ i (e) og IL-2-frigivelse i (f). Viste data som betyder +/- SEM fra 6 uafhængige forsøg med forskellige donorer.

Spacer bestående af IgG1 Fc-domæne resulterer i optimal drab og cytokinfrigivelse

CAR-funktion kan påvirkes af spacer domænenavn valg [13-15]. Ud over den huK666-baserede CAR beskrevet ovenfor indeholdende det humane IgG1 hængsel-CH2-CH3-domæne som afstandsstykke, genereret vi yderligere huK666 CAR varianter, hvor spacerregionen bestod af hængslet alene, hængslet fastgjort til stilken af ​​CD8a eller den CD8a stilk alene (figur 2A). Udvælgelse af disse afstandsstykker var baseret på størrelse overvejelse, med IgG1 hængsel-alone bliver en kort spacer, stilk CD8 mellemprodukt og IgG1 Fc bliver en lang spacer. Vi postulerede også, at CD8 stilk ikke kan give tilstrækkelig artikulation af scFv og dermed vi skabte en yderligere variant med IgG1 hængsel forbundet til CD8 stilk. For at tillade let påvisning af CAR, vi mærkede den huK666 med en aminoterminal HA-tag, indsat mellem signal-peptidet og VH. Endvidere at kontrollere for variation i vektor udtryk, vi klonede mund- og klovesyge 2A sekvens TAV (2ATaV) i ramme med carboxyterminalen af ​​CAR, som igen blev klonet i ramme til afkortet CD34 (dCD34ngg). Vi kunne derfor opdage CAR udtryk i forhold til vektor udtryk ved farvning for HA og anti-CD34.

Flere huK666 biler blev klonet ind i en identisk format hvorved scFv mærket med en HA-tag, og bilen blev co -expressed med en afkortet FMD-2A sekvens med afkortet CD34. Ekspressionskassetten er vist i (a) og tegningerne af disse formater er vist i (b). Co-ekspression af CAR (HA) og CD34 markørgen fra de forskellige kassetter. De fire hængselsområder blev sammenlignet med hensyn til cytotoksicitet (c) (LAN1 = GD2 positive mål og A204 = GD2 negativ mål), IFN-γ-sekretion (d), IL-2 (e) og målspecifik proliferation (f). Data vist som betyder +/- SEM fra 4 uafhængige forsøg med forskellige donorer.

primære humane T-celler blev transduceret med lige titer supernatant fra disse konstruktioner og farvet med anti-HA og anti-CD34. En repræsentativ flow-cytometrisk analyse af denne farvning er vist i fig 2B. Hinge-CH2-CH3, hængsel-Stilk og stilk spacer CARs udtryk var identiske, mens hængslet-alone spacer CAR resulterede i reduceret HA-farvning (Fig 2B). Dette kan skyldes reduceret stabilitet, eller til reduceret adgang til HA-tag i dette format. Funktionelle eksperimenter blev udført næste, og der var tydelige forskelle i evner spacer varianter at mægle cytotoksicitet, cytokinfrigivelse og spredning som reaktion på Lan-1 celler. PBMC’er transduceret med nogen af ​​de spacer variant CARs viste cytotoksicitet mod Lan-1 celler; men der var betydelige forskelle mellem effekt afhængigt spacer. CAR udtrykker CH2-CH3 spacer var signifikant mere effektive end hængsel /stilk (P = 0,009) og hængsel (p = 0,0003) selv om tendensen til øget drab sammenlignet med stilk var ikke-signifikant. Ingen af ​​afstandselementerne variant CARs medieret enhver drab af GD2 negative A204-celler (fig 2C). Forskelle blev også observeret i evnen af ​​de andre spacer varianter at stimulere produktionen af ​​IFN-γ eller IL-2 efter dyrkning med LAN1 celler. CH2CH3 spacer konsekvent inducerede begge cytokinerne, og var signifikant bedre end hængsel til IFN-γ-produktion (p 0,003, figur 2D), og signifikant bedre end hængsel /stilk (p 0,03) og hængsel (p 0,006) for IL -2 produktion (fig 2E). Med undtagelse af hængslet variant syntes alle receptorer sammenlignelige med hensyn til deres evne til at stimulere celledeling som reaktion på GD2-bærende LAN1 trods betydelig variation mellem donorer (fig 2F). T-celler, der udtrykker hængslet variant viste lidt påviselig proliferation, hvilket er i overensstemmelse med den nedsatte evne til denne receptor til at mediere IL-2 release. Samlet IgG Fc-region syntes at være den optimale afstandsstykke for GD2 CAR og vi brugte denne receptor format i efterfølgende optimeringer.

Udvidet CAR funktion gennem modifikation af Spacer

En normal funktion af CH2 -CH3 region i Fc-regionen af ​​immunoglobuliner er bindingen af ​​Fc receptorer på immuneffektorceller. Den humane IgG1 CH2-CH3 spacer anvendes i GD2 CAR er den naturlige ligand for høj affinitet FcyRI (CD64) udtrykt på medfødte effektorer såsom makrofager og monocytter. Derfor er der en teoretisk risiko for indgreb af CAR udtrykker T-celler med myeloide celler ved binding af CD64 resulterer i både forbi mål toksicitet af myeloide celler, og afledning af bilen T-celler fra deres tilsigtede effektorfunktion. Faktisk dette fænomen af ​​biler, der indeholder IgG1 CH2-CH3 afstandsstykker er tidligere blevet rapporteret [16,17]. De kritiske aminosyrer til IgG1 anerkendelse opholde sig i CH2-domæne (PELLGG og ISR motiver [18]), og Hombach et al har vist, at erstatning af disse centrale aminosyrer med de tilsvarende aminosyrer fra IgG2 inden for rammerne af CAR design, ikke har hæmmende virkning in vitro af en CD30 målretning CAR, men forhindrer forbi mål lysis af CD64-udtrykkende THP1-celler [16]. Derfor muterede vi den PELLGG og ISR rester som pr tilgangen af ​​Hombach et al (Fig 3A) og demonstrerede tilsvarende ekspression i T-celler fra CAR bærer det muterede (forkortet til PVAA) CAR (Fig 3B). Den PVAA-muterede CAR bevaret antigen specifik effektorfunktion mod SupT1 celler manipuleret til at udtrykke GD2 på lyse niveauer (fig 3C). Mens PVAA-holdige CAR lyserede GD2-udtrykkende LAN1 celler med tilsvarende effektivitet med vildtype havde PVAA CAR signifikant reduceret forbi mål cytolyse imod CD64 udtrykkende THP1-celler (p = 0,0005 Fig 3D). Tilsvarende mens co-kultur af WT-CAR T-celler med THP1 celler resulterede i gennemsnitlig påviselige IL1β i supernatant af 886pg /ml, blev dette reduceret til værdier, der var ikke over baggrund med PVAA indeholder CAR (Fig 3E). Derfor inkorporeringen af ​​en mutation til at forhindre binding af høj affinitet FcyR undgår forbi mål toksicitet ved GD2-CAR. Salg

(a) aminosyresekvensen af ​​vildtype (øverst) og muteret (PVAA) CH2- regioner ansvarlige for FcyR binding. (B) flow farvning med anti-Fc-antistof til at vise sammenligneligt niveau af ekspression af receptor med eller uden PVAA mutation. Identiske biler med og uden PVAA blev sammenlignet side om side med hensyn til cytotoksicitet mod GD2 manipuleret SupT1 og GD2 negative vildtype SipT1 celler (c), cytotoksicitet mod GD2 positive LAN1 celler og FcRγ positive THP-1-celler (d), og IL- 1β udgivelse den kultur med THP-1-celler (e). Data, der er vist som betyder +/- SEM fra 4 uafhængige forsøg med forskellige donorer.

Optimering af co-ekspression med selvmord gen

Selvom give en kraftfuld potentiel behandling af cancer, CAR- T-celler har kapacitet til at mediere potentielt dødelige bivirkninger. GD2 målretning kan føre til on target off-tumor toksicitet forårsaget af det centrale og perifere nervesystem GD2 udtryk. Et middel til selektivt slette CAR T-celler over for uacceptabel toksicitet er ønskelig. For at opnå dette, vi co-udtrykte inducerbare Caspase 9 (iCasp9) selvmord gen [11]. Co-ekspressionen af ​​CAR og iCasp9 var ved hjælp af selv-kløve MKS-2A som sekvens TAV

13. Dette resulterer i obligat 1: 1 co-ekspression af CAR med selvmordsgen. Da retrovirale ekspression resulterer i en normal fordeling af udtryk intensitet, en overvejelse er udslip af lavt niveau iCasp9 udtrykke CAR T-celler. Derudover kan høje niveauer af iCasp9 være basalt giftige. Celler, der udtrykker lavt niveau iCasp9 kan overleve selvmordsgen aktivering, så vi søgte at opnå homogen lyse ekspression af CAR og iCasp9 trods den yderligere transskriptionelle byrde, som 1,5 kb iCasp tilføjer til vektoren, og for at vise, at iCasp9 ikke var basalt toksisk ved opnåede ekspressionsniveauer. Vi modificerede vektoren og åbne læserammer som følger: Vektor 3’LTR U3 blev modificeret til at omfatte kylling β-globin chromatin insulator [19]. Stilladset tilhæftning-region fra det humane interferon-β-genet blev indsat i 3’UTR [20] (Fig 4A). Vi genererede også konstruktioner med både modifikationer sammen, men titre var for lav til at være brugbar, og blev ikke testet yderligere (data ikke vist). Endvidere blev hele den åbne læseramme kodon-optimeret. Endelig, for at sikre, at iCasp9 ikke resulterede i basal toksicitet ved høje-ekspressionsniveauer vi genereret en ikke-funktionel mutant med det aktive sted cystein muteret til serin (figur 4A). PBMC’er blev transduceret med lige titre af retroviral supernatant for hver receptor, og ekspression blev overvåget 72 timer efter transduktion ved flowcytometri. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af hver variant fusioneret til det ikke-funktionelle iCasp9 er lidt større end den tilsvarende ikke-optimeret receptor bundet til en funktionel iCasp9, hvilket tyder stærkt udtrykkende celler kan gå tabt på grund af uhensigtsmæssig, ikke-specifik aktivering af iCasp9 (Fig 4B og 4C)

(a) Ni forskellige ekspressionskassetter blev sammenlignet:. Tre forskellige retrovirusvektorer blev genereret-vildtype SFG, SFG med stillads-tilhæftning-region (SAR) indsat i 3’UTR og SFG med CHS4 indsat i 3 ‘LTR U3 region. (Retrovirusvektorer med både SAR og CHS4 blev genereret, men produceret meget lav vektor titre og blev ikke sammenlignet yderligere); Ind i disse retrovirale vektorer vildtype iCasp9-2A-huK666 CAR-konstruktioner blev indsat og iCasp9 blev indsat i 3 former; codon-optimeret, vildtype, og med det katalytiske domæne muteret. (B) Histogrammes på dag 3 efter transduktion (blå linjer). Overlagte T-celler dyrket i 20 nM CID er vist i rødt. Stregkoder af MFI af celler i fravær af CID på dag 3 (c) og (d) dag 7. Data vises som betyder +/- SEM fra 5 uafhængige forsøg med forskellige donorer.

For at evaluere virkningerne af vektor modifikationer i forhold til mere langvarige perioder, transducerede PBMC’er blev derefter dyrket i i alt 7 dage. Over varigheden af ​​denne kultur periode vi bemærkede forskellen fald i niveauet af udtrykket mellem 3 grupper: den umodificerede (ingen SAR /CHS) og CHS-receptorer viste et betydeligt fald i MFI op spænder fra 22,4 til 49,5% i forhold til dag 3 MFI (fig 4D sammenlignet med figur 4C). Dette fald i ekspression var forventet og skyldes sandsynligvis reaktionsevne MoMLV LTR til aktivering T-celle-tilstand. Efter lang tids 7 dage kultur MFI vektorer indeholdende SAR var signifikant højere end umodified. Dette fald i udtryk var signifikant mindre markant for SAR-holdige receptorer (p 0,02 for ikke codon optimeret, se figur 4D) tyder på, at SAR fungerer for at forhindre nedregulering af GD2 Cars. Fænomenet med lavere MFI på dag 7 sammenlignet med Dag 3 observeres ligeledes i vektorer indeholdende eller ikke indeholdende det C til S mutation tyder på, at ikke-specifik aktivering af selvmordsgen er ikke ansvarlig for denne dæmpning.

Efter inkubering med CID niveauerne af CAR ekspression af levende PBMC’er blev bedømt ved flowcytometri (fig 4B). Som forventet C-til-S mutant receptorer var refraktære over for CID behandling. Hverken codon-optimering eller inddragelse af SAR sekvens påvirket CID svar, men CHS4 sekvens syntes at resultere i en højere grad af transducerede T-celler undslipper CID behandling (Fig 4B). Flugten fra selvmord genaktivering syntes at være overvejende observeret de lave CAR-expressers og dette var i overensstemmelse med den lavere samlede udtryk observeret for CHS4 receptorer. Mens en meget lille antal resterende CAR-udtrykkende T-celler kunne påvises i de umodificerede og SAR-grupper efter CID behandling, er det uklart, om cellerne bevare tilstrækkelig CAR udtryk for at vise aktivitet.

Derfor, i form af udtryk , stabilitet og reaktion CID, den codon-optimerede SAR-holdige receptor (iCasp-HuK) udføres bedst og denne receptor sammenlignet med den oprindelige HuK666 CAR for sin evne til at mediere cytotoksicitet og cytokinfrigivelse som reaktion på LAN1 celler (fig 5 ). Transducerede PBMC’er blev inkuberet i 72 timer i fravær eller nærvær af 10 nm CID og derefter co-dyrket med Lan-1 eller A204-celler. Et eksempel på ekspression af disse biler i nærvær og fravær af CID er vist i fig 5A. Niveauer af HuK666-iCasp9 udtryk blev effektivt elimineret ved induktion af iCasp9 (Fig 5A).

SAR codon-optimeret kassette blev taget yderligere og sammenlignet med den oprindelige kassette uden iCasp9. (A) Angivelse af bilen var uændret. Udtømning er vist ved FACS efter tilsætning af CID. Funktionen af ​​kassetter med og uden iCasp9 blev vurderet ved (b) Killing (c) IFN-γ frigivelse og (d) IL-2 release. Viste data som betyder +/- SEM fra 4 uafhængige forsøg med forskellige donorer.

HuK666-transducerede PBMC’er viste sammenlignelige niveauer af cytotoksicitet og cytokinfrigivelse som reaktion på LAN1 celler uanset forudgående kultur med CID. I mangel af CID den HuK666-iCasp9 konstrukt udført samt receptoren mangler selvmordsgen. Men en 72-timers forbehandling med CID afskaffet frigivelse af cytokiner ved (Fig 5C og 5D) og cytotoksicitet af (Fig 5B) T-celler, der udtrykker HuK-iCasp9.

In vivo

funktion af iCasp9-CAR kassette

for at bekræfte, at effektiviteten og specificiteten af ​​co-udtrykte optimeret CAR og selvmord gen observeret in vitro var tilbøjelige til at svare til den kliniske effekt vi vurderet iCasp9-CAR kassette i en immunkompetente musemodel. Den GD2-antigenet er et gangliosid af identisk kemisk struktur mellem arterne, så ScFv huK666 ScFv binder GD2 ligeligt i muse og humane celler. Vi gjorde brug af den svagt immunogene CT26 coloncancercellelinie, som konsekvent danner tumorer subkutant i Balb /c mus. CT26 celler blev transduceret med en gammaretrovirus koder GD2 og GD3 synthaser, og en klon (nummer 7) med lyse GD2 ekspression blev udvalgt til analyse af GD2 målretning af GD2-CAR i et immunkompetente model (S1 Fig). CT26-klon 7-celler induceret specifik frigivelse af IL-2 og IFN-γ følgende co-kultur med splenocytter transduceret med GD2-CAR (S2 Fig). In vivo blev CT26-GD2 klon 7-afledte tumorer effektivt elimineret ved CAR transducerede splenocytter i modsætning til GD2 negative CT26 celler, som voksede i samme takt som tumorer i mus behandlet med utransducerede splenocytter (Fig 6).

Balb-C-mus blev innocultaed med 1×10

6 CT26 eller CT26-GD2 celle blandet i matrigel. 10 dage efter inokulation af tumor blev mus sub-letalt bestrålede (200 rad) og to uger efter tumorinjektion, musene intravenøst ​​transplanteret med i alt 1,5×10

6 transducerede splenocytter eller ikke transducerede kontrolforanstaltninger ved injektion i halevenen. Vild typen CT26 blev anvendt som antigen negative kontroller (a, c), mens CT26 -GD2 tumorer behandlet med utransducerede T-celler (b) ikke relatere mens CT26-GD2 tumorer udfordret med CAR T-celler regression. Hver linje repræsenterer en mus.

Diskussion

Høj risiko neuroblastom repræsenterer et uløst klinisk problem. Neuroblastomtumorer udtrykke diasialoganglioside GD2 rigeligt og ubikvitært. GD2 er en af ​​de få fast tumorantigener med relativt lidt udtryk på andre væv, specielt udtryk GD2-lavt niveau på perifere nerver, hvilket gør GD2 et attraktivt mål for CAR terapi. En tidlig GD2 CAR T-celle blev udført, som sammenlignede EBV-CTL’er og perifere blod-T-celler transduceret med biler i den samme patient. Svarene var forbigående og kun lavt niveau vedvarende CAR T-celler blev observeret [8].

En mulig begrænsning af denne undersøgelse var brug af en første generation [21] receptor, som kun transmitterer immunologisk signal 1 på ligering. Anden generation biler er blevet beskrevet, som også transmittere co-stimulerende signaler [22]. En dobbelt mærkning sammenligning af første og anden generation CAR antyder overlegenhed af sidstnævnte [9]. Faktisk stadig flere kliniske data med andengenerations CARs rettet mod CD19 CAR T-celleterapi i B-celle sygdomme har bekræftet overlegenhed anden generation CARs [23,24]. Her har vi indarbejdet en endodomain som sender to costimulerende signaler, en hver fra Ig superfamilien coreceptor familie (CD28) og TNF-familien coreceptor familie (OX40).

Stigende klinisk erfaring har vist, at biler inkorporerer bindende domæner afledt fra murine antistoffer kan fremkalde alvorlige reaktioner hos patienter, der kan bidrage til øget clearance af transducerede T-celler og CAR aktivering med betydelig toksicitet [25,26]. Denne eventualitet er mere presserende i Neuroblastom: da anti-GD2 mAb terapi er nu standard-of-care, vil mange patienter har været udsat for den kimære 14-18 mAb. Især disse terapeutiske antistoffer er afledt af den samme klon som RCA anvendt af Pule et al. CARs indeholdende 14,18-baserede scFv er blevet påvist for nylig at føre til tonic signalering tilstrækkelig til at inhibere funktionen [27]. Derfor har vi forsøgt at behandle mulighederne for både præformerede og CAR-induceret anti-idiotype og anti-muse ramme respons. Vi anvendte derfor forskellig bindemiddel familie, som var humaniseret.

Funktionen af ​​receptoren og udvælgelse af den korrekte afstandsstykke kan være vigtigt for klinisk effektivitet [13,14,21,28]. Guest et al har undersøgt, hvordan sekvensen af ​​afstandsstykket og CAR funktion synes at vedrøre afstanden af ​​receptoren bindingssted på målantigenet fra målcellemembranen [13]. Forfatterne bemærkede, at i tilfælde af NCAM og 5T4, antigener hvor bilen epitop placeret ved siden af ​​membranen, deres beslægtede CARs kræves tilstedeværelsen af ​​en Fc spacer for optimal funktion. Fjernelse af denne spacer resulterede i fald i cytotoksicitet og IFN-γ-sekretion fra transducerede T-celler som respons på antigen-udtrykkende tumorceller. Det modsatte optrådte sandt i tilfældet med CD19 og CEA, begge antigener, hvor CAR-bindingssted er længere væk fra membranen. CARs rettet mod disse to sidstnævnte antigener de viste reduceret IFN-γ respons, hvis de indeholdt Fc spacer, selvom cytotoksicitet var upåvirket. Hudecek et al i ROR-1 og CD19-modeller har foreslået, at optimale længde og fleksibilitet af spaceren er også afhængig af placeringen af ​​en målepitop i forhold til celleoverfladen [14,28].

Vi observerede at ændring af spaceren i vores GD2 CAR resulterede i ændringer i det cytotoksiske potentiale og cytokinsekretion af transducerede PBMC’er. Samlet Fc spacer billede den optimale respons, mens begge receptortyper varianter indeholdende CD8 stilk optrådte sub-optimalt med hensyn til cytotoksicitet og IL-2 release, selvom stilk-variant-transducerede PBMC’er konsekvent blev observeret at udskille højere niveauer af IFN-γ på stimulering end PBMC’er transduceret med Fc-variant. En manglende korrelation mellem cytotoksicitet, proliferation og cytokinsekretion for visse receptorkonstruktioner er blevet bemærket tidligere [13] [29,30]. Transduktion niveauer var konsekvent den samme for alle spacer varianter og dette syntes ikke at tage højde for observerede forskelle i funktion, undtagen i tilfælde af hængslet variant, som svagt blev udtrykt på celleoverfladen af ​​transducerede celler, og vises kun lidt eller ingen reaktivitet mod tumoren celler i nogen af ​​de målte parametre. Dette kan skyldes begrænset adgang af påvisning anti-HA-antistof til HA-tag på hængslet receptor eller en nedsat stabilitet på celleoverfladen, selv om denne receptor konfiguration har vist sig at være funktionelle i andre systemer [13,21]. Omfattende hængselsregionen i stilken variant syntes negativt at påvirke receptor funktion og lindres cytokinsekretion i forhold til alene stilken. Det er blevet postuleret, at det centrale element i spacerregionen at bestemme funktionen er fleksibilitet, hvilket tillader bindingsdomænet at få adgang til målantigenet. En mulighed er, at inklusion af hængslet segment kan nedsætte receptor fleksibilitet og at dette kan overvinde nogen fordel stammer fra en lille stigning i receptor længde.

I sidste ende valgte vi Fc-spacer-variant som værende optimal i vores hænder og tog dette frem til yderligere undersøgelse. Men et spørgsmål, der er blevet bemærket med biler indeholdende IgG-Fc er bindingen af ​​denne region til Fcy-receptorer (FcyR) på celler i det medfødte immunsystem resulterer i uhensigtsmæssig off-target aktivering af de transducerede T-celler [16,17]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.