PLoS ONE: antitumorvirkninger af en sirtuin Inhibitor, Tenovin-6, mod mavekræft Cells via Død Receptor 5 Up-forordningen

Abstrakt

opreguleret sirtuin en (SIRT1), en NAD

+ – afhængig klasse III histondeacetylase, deacetylerer p53 og hæmmer dens transkriptionelle aktivitet, hvilket fører til celle overlevelse. SIRT1 overekspression er blevet rapporteret at forudsige ringe overlevelse i nogle maligne lidelser, inklusive gastrisk cancer. Imidlertid antitumorvirkningen af ​​SIRT1 inhibering stadig vanskeligt at definere i gastrisk cancer. Her undersøgte vi de antitumor mekanismer i en sirtuin inhibitor, tenovin-6, i syv humane gastrisk cancer cellelinjer (fire cellelinjer med vildtype

TP53

, to med mutant-typen

TP53

, og en med nul

TP53

). Interessant tenovin-6 inducerede apoptose i alle cellelinjer, ikke kun dem med vildtype

TP53,

men også mutant-type og null versioner ledsaget af opregulering af dødsreceptor 5 (DR5). I KatoIII cellelinien (

TP53

-null), DR5 lyddæmpning markant svækket tenovin-6-induceret apoptose, hvilket tyder på, at den drejelige mekanisme bag dets antitumorvirkninger er baseret på aktivering af dødsreceptoren signalvejen. Selvom endoplasmatisk reticulum stress forårsaget af sirtuin hæmmere blev rapporteret at inducere DR5 opregulering i andre cancer cellelinjer, kunne vi ikke finde markant aktivering af dens relaterede molekyler, såsom ATF6, PERK, og CHOP, i mavekræft celler behandlet med tenovin- 6. Tenovin-6 i kombination med docetaxel eller SN-38 udøvede en svag til moderat synergistisk cytotoksicitet mod gastriske cancerceller. Afslutningsvis tenovin-6 har potent antitumoraktivitet mod humane gastriske cancerceller via DR5 opregulering. Vores resultater bør være nyttige for den fremtidige kliniske udvikling af sirtuin hæmmere

Henvisning:. Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose M, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) antitumorvirkninger af en sirtuin Inhibitor, Tenovin-6, mod mavekræft Cells via Død Receptor 5 Up-forordningen. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10,1371 /journal.pone.0102831

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 28 oktober, 2013; Accepteret: 23 juni 2014; Udgivet: 17 Juli 2014

Copyright: © 2014 Hirai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Aid fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (til IH). Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de hyppigste årsager til kræft dødsfald verden over [1], [2]. Selvom forskellige kemoterapier til avanceret mavekræft er blevet udviklet, er prognosen stadig er behov for fattige og nye anticancer lægemidler til mavekræft. Gastrisk kræft er en biologisk og genetisk heterogene kræft involverer mange genetiske mutationer og epigenetiske vekslen [3]. Blandt disse, abnormiteter i

TP53

tumorsuppressorgen spiller en vigtig rolle i tumorigenese [4], [5]. Ca. 30% af patienter med mavekræft har

TP53

mutation [6]. Selv i cancerceller med vildtype (wt)

TP53

, er det blevet rapporteret, at funktionen af ​​

TP53

undertrykkes af negativ regulering herunder ubiquitinering, methylering, og deacetylering [7], [8]. I den forbindelse ville det være en lovende strategi for at antage, at hæmning af disse negative regulatorer resulterer i forøgelse af antitumor virkninger gennem aktivering af p53 i vægt

TP53

kræftformer. Murint dobbelt minute 2 (MDM2) er en vigtig fysiologisk antagonist af p53 [7]. Vi har tidligere rapporteret, at en MDM2 inhibitor, nutlin-3, demonstreret kraftigt virkende antitumor virkninger mod gastriske cancerceller gennem aktivering af p53 pathway [9]

sirtuin 1 (SIRT1), en NAD

+ -. Afhængig histon deacetylase (HDAC), har en række funktioner, der er involveret i kromatin lyddæmpning, levetid, og genomisk stabilitet. Det findes i kernen og virker som en sensor for celle metaboliske status i overlevelse og ældning under genotoksisk og oxidativ stress [10], [11]. Udover histondeacetylering, disse funktioner dels afhænge af deacetylering af forskellige ikke-histon proteiner, der omfatter transkriptionelle faktorer: p53, forkhead kasse (FOXO) familie proteiner, nuklear faktor KB, c-myc, N-myc, E2F1, og hypoxi-inducerbare transkriptionsfaktorer (HIF) 1α /2α; kromatin-beslægtede enzymer: histonacetyltransferase, p300, DNA-afhængig kinase subunit Ku80, og TIP60; DNA reparation elementer: Ku70, RAD51, og NBS1; og celle-signalering faktorer: STAT3, β-catenin, og Smad7 [11] – [13]. SIRT1 fysiologisk interagerer med p53 og dæmper sine funktioner gennem deacetylering ved sin C-terminale Lys382 rest [12]. Overekspression af SIRT1 blev fundet i mange cancere, såsom mave og tyktarm [10], [14], og rapporteres til at fungere som en tumor promotor. SIRT2 er en af ​​det cytoplasmatiske NAD

+ – afhængige histondeacetylaser og deacetylerer histon H3 lysin 56 (H3K56) og α-tubulin. Den deler også ikke-histon substrater af FOXO1, FOXO3 og p53 med SIRT1 [11]. Men den nøjagtige rolle SIRT2 stadig vanskeligt at definere i kræft biologi.

På denne baggrund undersøgte vi, om tenovin-6, et lille molekyle stof, der hæmmer SIRT1 og SIRT2 funktioner [15], [16], udøves antitumorvirkninger gennem aktivering af p53 pathway i gastriske cancerceller. For nylig er det blevet rapporteret, at SIRT inhibitorer opreguleres død receptor 5 (DR5), et medlem af tumornekrosefaktor-receptorfamilien, i nogle kræftformer [17], [18]. Vi har desuden studeret inddragelse af denne receptor i antitumoraktiviteten af ​​tenovin-6 for mavekræft. Derudover undersøgte vi synergien af ​​tenovin-6 med konventionelle cytotoksiske lægemidler for den fremtidige kliniske udvikling i mavekræft.

Materialer og metoder

Cellelinjer

Seven mavekræft celle linjer blev anvendt: fire cellelinier med wt

TP53

(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), to cellelinier med mutant-type (MT)

TP53

(NUGC-3, STKM-1), og én cellelinje med null

TP53

(KatoIII) [19] – [21]. Cellelinier med wt

TP53

(MCF-7 brystcancer, HEK293 humane embryonale nyreceller) og MRC-5 normale humane fibroblaster blev inkluderet som kontroller i dette studie. MKN-45, NUGC-4, KatoIII, og MRC-5-cellelinier blev opnået fra Riken BRC Cell Bank (Tsukuba, Japan). SNU-1 og MCF-7 cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). NUGC-3 og HEK293 cellelinjer blev opnået fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). STKM-1 og STKM-2 cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af Dr. Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Japan).

Kemikalier

Tenovin-6 blev købt fra Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Docetaxel, SN-38, cisplatin, 5-fluorouracil (5-FU), doxorubicin og thapsigargin blev opnået fra Wako (Osaka, Japan). De blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) ved en koncentration på 20 mM og alikvoter blev opbevaret ved -20 ° C. Stamopløsninger blev fortyndet til de ønskede slutkoncentrationer med vækstmedium før anvendelse.

Antistoffer og Western blot-analyse

SDS-polyaclylamidegel elektroforese og Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [22]. De primære og sekundære antistoffer blev anvendt, var som følger. Kanin polyklonale antistoffer mod SIRT1 (D739), acetyleret (Ac) p53 (Lys382), phosphoryleret (Phospho) p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-tubulin (Lys40), dødsreceptor 5 (DR5), Fas associeret død domæne (FADD), kløvet poly (ADP) -ribose polymerase (PARP) (Asp214), og mus monoklonale antistoffer mod p21

Waf /Cip1 Hotel (DCS60), histon H3 (96C10) , β-actin (8H10D10), α-tubulin (DM1A) og C /EBP homolog protein (CHOP) (L63F7), og kanin monoklonale antistoffer mod TRAIL (C92B9), caspase-3 (8G10), inositol-krævende enzym (IRE ) 1α (14C10), og phospho-RNA-afhængig proteinkinase-lignende endoplasmatisk reticulum kinase (PERK) (16F8) blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Muse monoklonalt antistof mod p53 (BP53-12) blev købt fra Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) monoklonalt antistof var fra Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO), og anti-aktiverende transskriptionsfaktor 6 (ATF6) monoklonalt antistof (70B1413.1) var fra Enzo Life Science (Farmingdale, NY). Kanin polyklonalt antistof mod Ac-histon H3 (Lys18) var fra Merck Millipore (Billerica, MA). Både peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-muse-IgG får og anti-kanin IgG æsel sera var fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Antistofbinding blev påvist under anvendelse af en ECL Prime Western Blotting Detection System (GE Healthcare), i overensstemmelse med producentens protokol. Signalet intensitet blev kvantificeret ved hjælp af Ez-capture II chemiluminescens imaging system (Atto, Tokyo, Japan).

Real-time kvantitativ PCR til analyse af

SIRT1

SIRT2

genekspression

RNA-prøver blev ekstraheret fra cellelysat ved anvendelse af en High Pure RNA Isolation kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Efter det genomiske DNA blev fjernet ved DNase blev cDNA fremstillet ved anvendelse af en høj kapacitet RNA-til-cDNA kit (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Real-time kvantitativ PCR blev udført ved hjælp af en Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primere og TaqMan sonde til

SIRT1

SIRT2

blev opnået fra Applied Biosystems (Assay ID: Hs01009005 og Hs00247263 henholdsvis), og dem, for

18S ribosomale RNA (18S rRNA)

designet og syntetiseret af Sigma-Aldrich var som følger: 5′-AACCCGTTGAACCCCATTCG (fremadrettet primer), 5′-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (bagudrettet primer), 5′-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (probe). Reaktioner blev udført tre gange under standard termocykliseringsbetingelser anvendelse af 30 ng cDNA, 900 nm primere, 250 nm prober, og et Taqman Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) i overensstemmelse med producentens protokol.

RNA’er ekstraheret af celler blev analyseret for de relative mængder af målgenet (

SIRT1, SIRT2

) og henvisningen genet (

18S rRNA

) ved kvantitativ realtids-PCR.

WST-8 celle levedygtighed assays

WST-8 kolorimetriske assays blev udført ved anvendelse af en Cell Counting Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japan), i overensstemmelse med producentens protokol. Celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5 x 10

3 brønd med 100 pi dyrkningsmedium i 24 timer, behandlet med tenovin-6 i 72 timer, inkuberet i nærvær af WST-8, og derefter analyseret med en iMark mikropladelæser (Bio-Rad, Hercules, CA).

Analyse af apoptose ved flowcytometri

Celler blev podet i 60 mm skåle ved en densitet på 5 × 10

5 pr skål. Efter inkubering med tenovin-6 (10 uM) eller en ækvivalent mængde DMSO i 72 timer blev cellerne forsigtigt løftes med Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, PA) ved stuetemperatur i 10 min. Cellerne blev derefter vasket en gang med phosphatbufret saltvand. Apoptotiske celler blev påvist ved dobbelt farvning med propidiumiodid (PI) og fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket annexin V under anvendelse af et Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, Brea, CA) i overensstemmelse med producentens protokol. Flowcytometrisk analyse blev derefter udført med en FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) og CELLQuest software (BD Biosciences).

siRNA målretning

DR5

siRNA målrettet DR5 designet ved hjælp siDirect software (https://sidirect2.rnai.jp/), som tidligere [22] rapporteret. siRNA transfektion blev udført under anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kontrol siRNA var en kunstig sekvens designet til at have den mindste homologi med humane og muse-gener. Sense- og antisense-strenge af siRNA anvendt i denne undersøgelse var som følger: DR5, 5′-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 ‘(sense), 5′-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3′ (antisense); kontrol siRNA, 5’-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 ‘(sense), 5′-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3’ (antisense).

Til analyse af virkningerne af siRNA på cellevækst og levedygtighed blev celler udpladet ved en lav densitet (1 × 10

3 celler pr brønd) i plader med 96 brønde indeholdende 100 pi RPMI1640 medium med 10% føtalt kalveserum (Sigma-Aldrich). Levedygtighed transfekterede celler blev vurderet 72 og 120 timer efter transfektion af WST-8 analysen.

Kombination indeks

For at bestemme om tenovin-6 kan forbedre antitumor virkninger af konventionelle kemoterapeutiske midler, vi anvendes en kombination index (CI) og et isobologram beregnet ved anvendelse CalcuSyn software (Cambridge, UK) i overensstemmelse med median virkning princip Chou og Talalay [23]. I denne analyse, CI 1.3 indikerer antagonisme; CI = 1,1-1,3 moderat antagonisme; CI = 0,9-1,1 additiv virkning; CI = 0,8-0,9 svag synergi; CI = 0,6-0,8 moderat synergi; CI = 0,4-0,6 synergi; og CI = 0,2-0,4 stærk synergisme.

Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og blev gentaget mindst tre gange. Alle data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Betydningen af ​​forskelle blev bestemt ved t-test og Dunnetts test.

s

-værdier 0,05 blev anset for signifikant

Resultater

Angivelse af SIRT1, SIRT2, og acetyleret (Ac) p53 i gastrisk cancer cellelinjer

.

først undersøgte vi ekspressionsniveauerne af SIRT1, SIRT2, og Ac-p53 i syv gastrisk cancer cellelinjer. Vi anvendte HEK293-celler for den positive kontrol af SIRT1 /2, og MCF-7-celler behandlet med doxorubicin til den positive kontrol af Ac-p53 [24]. Alle gastriske cancercellelinier undtagen NUGC-4 og STKM-1-celler udtrykte høje niveauer af SIRT1-protein, og SIRT2 ekspressionsniveauer var lave i alle cellelinjer med undtagelse af MKN-45-celler (figur 1A). Ac-p53 ekspressionsniveauerne var meget lavt i alle gastrisk cancer cellelinjer med vægt

TP53

A:. Udtrykket af SIRT1, SIRT2, p53, Ac-p53, og phospho-53 i syv gastriske cancercellelinier og MRC-5-fibroblaster blev undersøgt ved Western blotting. Semi-kvantificering af Western blotting densitometri involverede normalisering til p-actin niveauer. MCF-7 *: MCF-7-celler behandlet med doxorubicin (1 uM, 24 timer). B: Angivelse af

SIRT1

mRNA og

SIRT2

mRNA i gastriske kræftceller. Niveauer af

SIRT1

mRNA og

SIRT2

mRNA blev bestemt i gastriske kræftceller og MRC-5 fibroblaster ved kvantitativ real-time PCR og normaliserede til niveauet af

18S

rRNA . mRNA-niveauer er vist i forhold til de af MRC-5 fibroblaster.

Vi analyserede genet udtryk for

SIRT1

SIRT2

af real-time kvantitativ PCR. MKN-45 celler udviste

SIRT1

genekspression, der var omkring 2,5 gange højere end i fibroblaster, men andre gastrisk kræft cellelinjer ikke (figur 1B). I NUGC-4-celler, niveauet af genekspression af

SIRT1

var lav, var SIRT1 protein. MKN-45 celler viste lidt høj

SIRT2

genekspression, mens andre cellelinjer viste temmelig lavt ekspressionsniveauerne.

Tenovin-6 hæmmet vækst af gastriske kræftceller

For at bekræfte tenovin-6-aktivitet, studerede vi, om tenovin-6 påvirket acetylering af histon H3 og α-tubulin. Tenovin-6 forøgede acetylering af histon i tre (MKN-45, NUGC-4, og KatoIII) af de fire gastriske cancer testede cellelinjer, hvilket indikerer inhibering af SIRT1 deacetylering aktivitet (figur 2A). Ac-α-tubulin steg kun i én cellelinje (MKN-45) behandles med tenovin-6, dermed hæmning af SIRT2 deacetylering aktivitet kunne ikke afgjort vist i gastriske kræftceller

A:. Gastrisk kræftceller var dyrket med tenovin-6 (10 uM) for forskellige tidsperioder og analyseret for niveauet af SIRT1, SIRT2, Ac-H3, og Ac-α-tubulin ved Western blotting. B: Tenovin-6 inhiberede væksten af ​​gastriske cancerceller uanset

TP53

status. Alle eksperimenter blev vurderet ved WST-8 assay og udført tredobbelt. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD. C: WST-8 assay blev udført i MRC-5-celler til at sammenligne toksiciteten af ​​tenovin-6 til cancercellelinjer. Den vækstinhibering af tenovin-6 i NUGC-4-celler var signifikant højere end i MRC-5-celler. Betydningen af ​​forskelle blev evalueret under anvendelse af Students t-test.

Dernæst vurderede vi den potentielle anti-tumor effekt af tenovin-6 mod gastriske cancerceller. Hver gastrisk cancercellelinie blev dyrket i nærvær af tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20, og 50 uM) i tre dage. Dosisafhængig vækstinhibering blev observeret i alle cellelinier, ikke kun dem med wt

TP53

men også mt og null versioner (Figur 2B). Deres IC

50 værdier varierede fra 2,34 til 4,28 uM. Desuden blev WST-8 assay udført i den humane fibroblastcellelinie MRC-5 (IC

50: 6,09 uM) at sammenligne toksiciteten af ​​tenovin-6 til gastriske cancercellelinier. Levedygtighed NUGC-4-celler behandlet med tenovin-6 var signifikant lavere end den for MRC-5-celler, som vist i figur 2C.

Tenovin-6 inducerede apoptotisk celledød i gastriske cancerceller

Som vist i figur 3A og S1, tenovin-6 behandling forøgede ekspression af p53 og p21 i vægt-

TP53

celler (MKN45 og NUGC-4). Opregulering af Ac-p53 blev vist i MKN-45-celler, men ikke i NUGC-4-celler. Forøget p21 udtryk blev også observeret i mt

TP53

celler (NUGC-3). Derimod har bcl-2-ekspression ikke ændre i næsten alle fire gastriske cancercellelinier. Stigninger i DR5 og spaltet PARP udtryk blev observeret i alle testede cellelinier. Niveauerne af udtryk for TRAIL, der fungerer som en ligand i kobling død signalering, blev steg en smule i alle cellelinjer, skønt udtryk for FADD, en vigtig adapter, ikke var påvirket af tenovin-6.

A : Tidsforløb analyse af ekspressionen af ​​p53, dets nedstrøms molekyle p21

Waf /Cip1

, og apoptose-relaterede molekyler i gastriske cancerceller behandlet med tenovin-6 (10 uM). Relativ intensitet af proteinerne ‘ekspression er vist i figur S1. Tenovin-6 inducerede ekspression af Ac-p53 og p21

Waf /Cip1

, men ikke bcl-2. DR5 ekspression blev kraftigt induceret af tenovin-6. TRAIL, og kløvet PARP blev let øget, men FADD udtryk blev ikke påvirket. En dublet af DR5 viser dets precursor (øvre bånd) og modne isoformer (nederste bånd). B: Fire cellelinjer blev behandlet med tenovin-6 (10 uM) eller en vehikelkontrol i 72 timer, dobbelt-farvet med FITC-annexin V og PI og analyseret ved flowcytometri. Den statistiske signifikans af forskelle mellem grupper blev evalueret under anvendelse af Students t-test. *

s

0,01; **

s

. 0,05

Vi undersøgte, om tenovin-6 faldt levedygtigheden af ​​gastriske kræftceller via induktion af apoptotisk celledød. Cancer celler blev udsat for det i en koncentration på 10 uM eller en tilsvarende mængde kontrol vehikel (DMSO) i 72 timer og derefter farvet med FITC-annexin V og PI. De blev analyseret ved flowcytometri: celler negative for både annexin V og PI blev anset for at være ikke-apoptotisk, celler positive for annexin V kun blev betragtet som tidlig apoptotisk, og celler positive for både annexin V og PI blev anset for at være sent apoptotisk eller nekrotisk. Eksponering af MKN-45 celler til tenovin-6 forøgede fraktionerne af tidlige og sene faser af apoptose fra 2,8% til 52,1% og fra 1,8% til 18,5%, henholdsvis (figur 3B). Tilsvarende stigninger i befolkningerne i tidlige og sene faser af apoptose blev observeret i andre cellelinjer (NUGC-4, NUGC-3, og KatoIII). Tenovin-6-induceret apoptose i alle testede cellelinjer, uanset

TP53

status.

Effekt af

DR5

knockdown på tenovin-6-induceret apoptose

Næste, at kontrollere, om

DR5

lyddæmpning påvirket tenovin-6-induceret apoptose, cellernes levedygtighed og apoptotisk sats blev analyseret ved WST-8 assay og flowcytometri henholdsvis i

TP53

-null KatoIII celler. Inhibering af DR5-ekspression ved specifik siRNA (figur 4A) signifikant reduceret tenovin-6-induceret celledød og apoptosis i KatoIII celler (figur 4B og 4C). Vi brugte tre forskellige siRNAs i vores indledende forsøg, og vi fik lignende resultater med eventuelle siRNA’er

A:. KatoIII celler blev transficeret med 1 nM siRNA kontrol eller siRNA mod DR5 mRNA. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 5 pM tenovin-6 i 24 timer. Western blotting viste nedregulering af DR5 af siRNA transfektion. En dublet af DR5 viser dets precursor (øvre bånd) og modne isoformer (nederste bånd). B: Celler blev transficeret med 1 nM siRNA kontrol eller DR5 siRNA i 48 timer, behandlet med 0,2, 1 og 5 uM tenovin-6 i 72 timer og derefter udsat for cellelevedygtighed målinger ved WST-8 assay. Den statistiske signifikans af forskelle mellem grupper blev evalueret under anvendelse af Students t-test. *

s

0,01; **

s

0,05. C: Effekten af ​​DR5 knockdown på tenovin-6-induceret apoptose blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse PI-farvning. Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SD. Den statistiske signifikans af forskelle mellem grupper blev evalueret under anvendelse af Students t-test.

Vi undersøgte aktivering af det endoplasmatiske reticulum (ER) stress pathway, som er knyttet til DR5 opregulering, som tidligere rapporteret [ ,,,0],17]. CHOP er en af ​​de mest potente inducer af DR5 og opstrøms for apoptose, og ofte frigøres under ER stress. Som vist i figur 5A og 5B, selvom CHOP var marginalt opreguleret ved tenovin-6 behandling i alle fire gastriske cancercellelinier, de forhøjede niveauer signifikant lavere end i kontrolceller behandlet med thapsigargin, som er en selektiv inhibitor af sarkoplasmiske /endoplasmatisk reticulum Ca

2+ – ATPaser og udbredt som en cellulær ER stressor [25], [26]. På den anden hænder, IRE1, som er en ER stress sensor og placeret opstrøms for CHOP, var lidt opreguleret ved tenovin-6 behandling i alle cellelinjer, men ikke phosphoryleret PERK og ATF6. [27], [28]. Det syntes sandsynligt, at tenovin-6 forårsagede ER stress fører til DR5 induktion i vores gastriske cancerceller

A:. Ekspression af proteiner associeret med ER stress i gastrisk cancer cellelinier før og efter behandling med 10 pM tenovin-6 . Thapsigargin på 3 uM blev administreret til HEK293-celler som en kontrol. En dublet af DR5 viser dets forstadium og modne isoformer. B: Relativ intensitet af ekspression af CHOP i testede cellelinjer er vist. Den statistiske signifikans af forskelle mellem grupperne blev vurderet ved anvendelse Dunnetts test.

antitumorvirkningen af ​​tenovin-6 i kombination med kemoterapeutiske midler

Endelig har vi undersøgt, om tenovin-6 forøgede antitumor virkninger af kemoterapeutiske midler, herunder docetaxel, SN-38, cisplatin og 5-FU, i gastriske cancercellelinjer. Fire cellelinjer med vægt

TP53

(MKN-45, NUGC-4), mt

TP53

(NUGC-3), og null

TP53

(KatoIII) blev behandlet med disse midler alene eller i kombination med to doser (2 og 5 um) af tenovin-6. Koncentrationerne var 0,25 nM docetaxel, 1 nM SN-38, 0,5 eller 1 uM cisplatin og 0,25 uM 5-FU. Som vist i tabel 1 (og figur S2), docetaxel og SN-38 viste en lille til moderat synergistisk virkning på tenovin-6 behandling i tre cellelinier, og cisplatin med tenovin-6 viste en moderat synergistisk virkning i to cellelinier, hvorimod 5-FU i kombination med tenovin-6 viste en lavere effekt end de andre agenter. Vi undersøgte udtrykkene for DR5 efter administration af tenovin-6 med kemoterapeutiske midler. DR5 opregulering af tenovin-6 blev forbedret med en kombination af docetaxel i MKN-45 celler (figur S3).

Diskussion

Vi viste, at tenovin-6 viste potent antitumor aktivitet ledsaget af apoptotisk celledød i humane gastriske cancerceller med vægt

TP53

såvel som dem med mt

TP53

. Flere specifikke hæmmere af sirtuins, såsom sirtinol, suramin, salermide, og thiobarbiturates, blev rapporteret til at hæmme cellevækst i forskellige former for kræft [29]. De fleste forskere beskrev antitumor virkninger af sirtuin inhibitorer i cellelinjer med vægt

TP53

[15], [29] – [31], og tilskrives disse til aktivering af apoptose gennem acetylering af p53. I mellemtiden blev flere rapporter udgivet i de seneste år, der viste de antitumor aktiviteter sirtuin inhibitorer i cellelinjer med mt

TP53

gennem p53-uafhængige veje [17], [18]. Vi viste, at DR5 knockdown svækket de antitumor virkninger af tenovin-6 i

TP53

-null gastriske kræftceller. Aktivering af død receptor signal pathway via opregulering af DR5 spiller en central rolle i tenovin-6-induceret celledød, som nævnt i andre rapporter om sirtuin hæmmere.

Det er blevet rapporteret, at salermide forbedret DR5 udtryk og induceret apoptose i humane ikke-småcellet kræftceller transporterer mt

TP53

[17]. I denne rapport, samtidig lyddæmpning af

SIRT1

SIRT2

samt salermide opreguleret DR5, ledsaget af opregulering af ER stress-relaterede proteiner, såsom ATF4 og CHOP. Disse resultater antydede, at ER stress var involveret i denne DR5 induktion. Vi spekuleret på, at tenovin-6 også ført til en stigning i DR5 udtryk via aktivering af ER stress medieret af PERK, IRE1, ATF6, og CHOP. Men i modsætning til forventningerne, det signal pathway af ER stress aktiveres ved tenovin-6 blev ikke åbenbart opdaget. Men der var klare beviser for, DR5 er fremkaldt ved tenovin-6. Der er andre veje for CHOP-medieret DR5 opregulering: reaktive oxygenarter (ROS), c-Jun-NH

2-terminale kinase (JNK) pathway, p38 mitogenaktiveret proteinkinase pathway, og så videre [ ,,,0],32] – [38]. Men vi ikke undersøge disse veje her, fordi vi ikke kunne identificere CHOP aktivering i vores undersøgelse. Vores resultater antyder, at andre p53 og CHOP-uafhængige pathways deltage i tenovin-6-induceret DR5 ekspression i gastriske cancerceller.

Vi viste, at tenovin-6 inducerede apoptotisk celledød gennem aktivering af DR5-vejen. Dog syntes p53 og hak veje usandsynligt at være involveret i denne DR5 induktion, og opregulering fortsat uklart mekanismen i DR5. Vi har for nylig undersøgt antitumorvirkninger af tenovin-6 i flere coloncancer-cellelinjer, og fundet sin potente antitumor aktivitet mod de fleste af dem med opregulering af DR5 såvel [39]. Men i CaCo2 tyktarmskræft celler (mt

TP53

), apoptotisk celledød ved tenovin-6 var mindre indlysende og DR5 udtryk var ikke stærkt opreguleret. Caco2 celle er blevet rapporteret til at udtrykke høje varmechokproteiner kendt som en undertrykker af DR5 [40] – [43]. Denne relation bør undersøges yderligere i fremtiden. SIRT1 kan deacetylate histon H4 lysin 16 (H4K16) samt H3K9, H3K14, og H1K26, som er tæt knyttet til gen-silencing [11]. Desuden har mange tilsvarende ikke-histon substrater: transkriptionelle faktorer, DNA reparation maskiner elementer, nukleære receptorer, histon-modificerende enzymer og celle-signalmolekyler, som beskrevet andetsteds [11] – [13]. Disse mange og komplicerede sammenslutninger af SIRT1 aktivitet er involveret i forskellige biologiske funktioner, såsom regulering af genekspression og DNA-skader reparation. Kræftceller har tendens til at kræve, at disse funktioner SIRT1 for at overleve, formere sig, og reparere katastrofale genomisk skader. Nylige undersøgelser har identificeret evne tenovin-6 til at inducere differentiering og inhibere autophagy som en del af sine antineoplastiske virkninger i leukæmiceller [44], [45]. Det kan afhænge af kræft celle adfærd hvordan tenovin-6 påvirker neoplastisk aktivitet. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at tydeliggøre forbindelsen mellem tenovin-6-medieret død vej og de komplekse roller SIRT1.

Vi undersøgte effekten af ​​at kombinere docetaxel, SN-38, cisplatin og 5-FU med tenovin -6 fordi de er ofte blevet brugt til behandling af patienter med fremskreden mavekræft [46], [47]. Let til moderat synergistiske virkninger af docetaxel og SN-38 med tenovin-6 i mavens kræft cellelinjer, uanset

TP53

status, blev fundet.

Selvom behandlinger med kombinationer af docetaxel og sirtuin inhibitorer er ikke blevet rapporteret, kombinationer af docetaxel og andre HDAC-inhibitorer, såsom Trichostatin A og suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA) er blevet rapporteret at have synergistiske virkninger relateret til caspaseaktivering eller tubulin acetylering i flere cancercellelinier [48] – [50] . I vores undersøgelse, er det stadig uklart, om det tubulin acetylering ved tenovin-6 altid påvirket antitumorvirkningen, fordi tubulin acetylering blev kun vist i én cellelinje. SN-38 (den aktive form af irinotecan) er en DNA-topoisomerase I-inhibitor, der kun virker i S-fasen og interfererer med DNA-replikation og celledeling [51], [52]. HDAC-hæmmere inducerer acetylering af histoner og løsn kromatin struktur, hvorved topoisomerase-hæmmer kan lettere få adgang til DNA, lette DNA skader [51], [53]. Derudover har en bemærkelsesværdig stigning på ROS-generering er rapporteret i småcellet cancerceller upon samtidig udsættelse for SAHA og topotecan (et derivat af camptothecin) [51]. Den forøgede styrke af behandling, som kombinerer tenovin-6 og SN-38 kan skyldes kooperativ regulering af DNA-skade respons.

Fordelen ved kombinationsbehandling med tenovin-6 og cisplatin eller 5-FU var mindre end med de andre agenter i gastriske cancerceller, selv om flere rapporter har vist en forbedring af apoptose ved kombineret behandling med cisplatin eller 5-FU og andre HDAC-inhibitorer i andre tumorer [54] – [57].

med hensyn til toksicitet evaluering af tenovin-6, brugte vi en fibroblast cellelinje som de alternative ikke-tumorigene celler til at forudsige toksicitet mod normale celler, der henviser til de tidligere rapporter [15], [18]. Det var svært at finde en passende normal kontrol til sammenlignende undersøgelser, og derfor endeligt nødvendig for at studere toksicitet tenovin-6 (i kombination med anti-cancer medicin)

in vivo

, hjælp dyr xenograftmodeller.

Som konklusion, en sirtuin inhibitor, tenovin-6, viste en robust antitumor effekt mod humane gastriske kræftceller. Dette var uafhængigt af

TP53

status og blev induceret via opregulering af DR5. Yderligere undersøgelse er nødvendig for at klarlægge den mekanisme, hvormed tenovin-6 regulerer DR5 udtryk.