PLoS ONE: Hurtig Analyse af glykolytisk og Oxidativ Substrat Flux af kræftceller i en Mikroplade

Abstrakt

Kræftceller udviser bemærkelsesværdige ændringer i cellulær metabolisme, især i deres næringsstof substrat præference. Vi har udtænkt adskillige eksperimentelle metoder, der hurtigt analysere den metaboliske substrat flux i cancerceller: glycolyse og oxidationen af ​​større brændstof substrater glucose, glutamin og fedtsyrer. Brug af XF ekstracellulære Flux analysator, disse metoder foranstaltning, i realtid, oxygenforbrugshastigheden den (OCR) og ekstracellulær forsuring rate (ECAR) af levende celler i en mikroplade som de reagerer på substrater og metaboliske forstyrrelse agenter. I proof-of-principle eksperimenter, vi analyserede substrat flux og mitokondriske bioenergetik af to humane glioblastom cellelinier, SF188s og SF188f, som blev afledt fra den samme parentale cellelinje men prolifererer ved langsomme og hurtige satser hhv. Disse analyser førte til tre interessante observationer: 1) begge cellelinier indåndes effektivt med betydelig endogene substrat respiration; 2) SF188f celler undergik et markant skift fra glykolytisk til oxidativ metabolisme, sammen med en høj grad af glutamin oxidation i forhold til SF188s celler; og 3) den mitokondrie proton lækage-linked respiration SF188f celler kraftigt i forhold til SF188s celler. Det er sandsynligt, at proton lækage af SF188f celler kan spille en rolle i at tillade kontinuerlig glutamin-drevne anaplerotisk TCA cyklus flux ved delvis frakobling af TCA cyklus fra oxidativ fosforylering. Tilsammen disse hurtige, følsomme og high-throughput substrat flux analysemetoder indføre meget værdifulde tilgange til at udvikle en større forståelse af genetiske og epigenetiske veje, der regulerer cellulær metabolisme, og udvikling af behandlingsformer, der er målrettet kræft stofskifte.

Henvisning: Pike Winer LS, Wu M (2014) hurtig analyse af glykolytisk og Oxidativ Substrat Flux af kræftceller i en mikroplade. PLoS ONE 9 (10): e109916. doi: 10,1371 /journal.pone.0109916

Redaktør: Robert W. Sobol, University of Pittsburgh, USA

Modtaget: August 25, 2013; Accepteret: September 1, 2014; Udgivet 31. oktober, 2014

Copyright: © 2014 Pike Winer, Wu. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev gennemført i og finansieret af Seahorse Bioscience. LSPW er en medarbejder og MW var en medarbejder på tidspunktet for arbejdet i virksomheden. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Lisa S. Pike Winer er en medarbejder på Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA. Min Wu var en medarbejder på Seahorse Bioscience på tidspunktet for dette arbejde, North Billerica, MA, USA. Det betyder dog ikke ændre forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kræftceller væsentligt omprogrammere deres stofskifte til at køre tumorvækst og overlevelse. Otto Warburg bemærkes først under aerobe betingelser, tumorer havde høje glycolyse i forhold til det omgivende væv, et fænomen kendt som Warburg virkning eller aerob glykolyse [1]. Han postulerede, at øget glykolyse og nedsat mitokondrier åndedræt er den primære årsag til kræft [2]. For nylig, en stor mængde data viser, at kræftceller undergår metabolisk omprogrammering, hvilket fører til omfattende brug af og afhængighed af glukose eller glutamin for deres vækst og overlevelse [3] – [9]. Denne metaboliske omprogrammering har vist sig at være resultatet af onkogen aktivering og /eller tab af tumor suppressor-funktioner, samt som respons på miljømæssige signaler, som alle regulerer næringssubstrat optagelse og metabolisme [10] – [14]. Afhængigt af kombinationer af disse faktorer og en given cellulær sammenhæng, kan cancerceller manifestere en række metaboliske fænotyper [15], som kan påvirke enten behandling selektion eller respons på behandling.

I betragtning af mange typer af genetisk og metabolisk forskellige kræftceller, en hurtig, informativ, relativt let at udføre og højere throughput substrat flux analyse kan bidrage til større forståelse af de genetiske og epigenetiske veje, der regulerer kræftcelle stofskifte, afgøre, om der er et begrænset antal metaboliske fænotyper . blandt alle typer af kræftceller, uafhængige af væv oprindelse og opdage midler, der er målrettet specifikke metaboliske veje for kræftbehandlingen

celler producerer ATP via to store energiproducerende veje: glykolyse og oxidativ fosforylering. Den glycolytiske omsætningsvej omdanner glucose til pyruvat. En skæbne pyruvat er reduktion til lactat i cytosolen i en oxygen-uafhængig biokemisk reaktion, der resulterer i ATP-produktion og netto proton produktion. Protoner pumpes ud af cellen ved hjælp af forskellige mekanismer til at fastholde den intracellulære pH [16] og udstrømningen af ​​protonerne i det ekstracellulære rum eller medium, der omgiver cellerne forårsager ekstracellulær forsuring [17] – [21]. Den største substrater næringsstoffer glucose, kan glutamin og fedtsyrer fuldstændigt oxideret til i CO

2 og H

2O via tricarboxylsyrecyklen (TCA cycle), hvilket kræver elektrontransportkæden (ETC) i mitokondrierne ved hjælp oxygen som terminal elektronacceptor, og som er koblet til ATP-produktion ved oxidativ phosphorylering. CO

2 fremstillet kan omdannes til bicarbonat og protoner som katalyseret af carbololie anhydrase [16], en anden kilde til protoner forårsager medium forsuring. I mange ikke-transformerede differentierede celler, såsom neuroner, oxidativ phosphorylering producerer størstedelen af ​​den cellulære ATP. I modsætning hertil kræftceller stærkt afhængige glycolyse foruden oxidativ phosphorylering for deres ATP-produktion [22]. Samt brændstofpåfyldning ATP-produktion, glucose og glutamin er væsentlige carbonkilder, der giver anabolske forstadier, hvoraf nogle (fx citrat og oxaloacetat) produceres ved en trunkeret TCA-cyklus for biosyntesen af ​​lipider, nukleinsyrer og aminosyrer.

Da levende celler ikke gemme ATP, de producerer det løbende og efter behov, og derfor hele tiden forbruge ilt og brændstof substrater. Efterspørgslen efter ATP i celler (dvs. ADP tilgængelighed) styrer således hastigheden af ​​iltforbrug. Elektroner (energi), der er gemt i næringsstoffer substrater udvindes via mitokondrie TCA cyklus reaktioner og båret af reducerede elektronbærere NADH og FADH

2 til ETC. Som elektronerne flyde ned ETC, bliver energien frigivet anvendes til pumpning protoner fra matrixen ind i intramembrane rum, der danner en transmembran elektrokemisk proton gradient over den mitokondriske indre membran. Ved afslutningen af ​​ETC, er elektronerne overføres til molekylært oxygen, hvilket reducerer det til vand via terminalen cytochrom C oxidase. Som protoner vende tilbage til den mitokondrielle matrix gennem ATP syntase kompleks, energien lagret i protongradienten driver derefter phosphorylering af ADP til ATP kobling respiration (elektrontransport) med ATP-produktion. Oxidativ phosphorylering imidlertid ufuldstændigt koblet til respiration. Protoner kan også vende tilbage til matricen via proton kanaler såsom frakobling proteiner (UCP), som er placeret på den indre membran, uden om ATP syntase og sprede energi gradient uden at producere ATP i en proces kendt som proton lækage. Delvist reducerede ilt arter (ROS), såsom superoxid anion kan produceres på forskellige steder i ETC afhængigt af forholdene [23]; proton lækage er betragtet som en vigtig cellulære mekanisme for beskyttelse af celler mod oxidativ skade ved at sænke ROS produceres af ETC [24].

grund af sammenhængen mellem iltforbrug og ekstracellulær forsuring med næringssubstrat stofskifte, øget oxygenforbrug er et mål for substratoxidering når et substrat tilsættes til cellerne. Ligeledes en stigning i antallet af ekstracellulær forsuring på glukose tilføjelse er et mål for glykolytisk flux.

Forskellige traditionelle eksperimentelle metoder, der analyserer substrat metabolisme har bidraget til den nuværende forståelse af cellulære stofskifte. Disse omfatter måling af ophobning af radioaktivt mærkede slutprodukter såsom H

2O og CO

2 metaboliseres fra substrater såsom

3H mærket glucose og

14C mærkede fedtsyrer. Andre tidligere anvendte (og mere nyligt udviklede) metoder til at kvantificere metabolitter er stabile isotop sporstoffer kombineret med massespektrometri og NMR-analyse, som begge har givet detaljerede oplysninger om substrat metabolisme. Disse teknikker kan imidlertid alligevel være enten arbejdskrævende og besværlig, og /eller relativt utilgængelige for mange laboratorier.

Denne undersøgelse havde to hovedformål. Den første var at anvende ovennævnte principper for at etablere en række hurtige og nemme metoder til at analysere glykolytisk flux og oxidativ substrat flux af kræftceller. Dette blev opnået ved at måle cellulær oxygenforbrugshastigheden og ekstracellulær forsuring under anvendelse af XF ekstracellulære Flux analysator [22]. Den anden var at udføre proof-of-princippet eksperimenter gennem anvendelse af disse substrat flux metoder, sammen med at analysere mitokondrie bioenergetik i humane glioblastom celler SF188s og SF188f at afhøre deres metaboliske netværk.

Materialer og metoder

Reagenser

Carbonyl cyanid 4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP), myxothiazol, antimycin A, rotenon, 2-deoxyglucose, oxamat, aminooxyacetate, glucose, natriumpyruvat og natriumpalmitat blev opnået fra Sigma (St. Louis , MO, USA). L-glutamin blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Oligomycin blev opnået fra EMD (San Diego, CA, USA). Bovint serumalbumin fraktion V (fedtsyre ultra-fri) blev opnået fra Roche Diagnostics (Indianapolis, IN, USA). Alle forbindelser og medium blev fremstillet i overensstemmelse med producentens anvisninger, medmindre andet er angivet.

cellelinjer og cellekultur

menneskelige glioblastom SF188 celler blev opnået fra University of California i San Francisco Brain Tissue Bank . Disse celler blev oprindeligt vedligeholdt, som anbefalet af udstederen, i et MEM-medium indeholdende 5,5 mM glucose og 2 mM L-glutamin. De blev tilpasset trinvis til DMEM-medium indeholdende 25 mM glucose og 6 mM L-glutamin som et modelsystem til undersøgelse af glutamin metabolisme som [6] rapporteret. Som kontrol blev de parentale celler også indrettet parallelt med DMEM-medium indeholdende 5,5 mM glucose og 2 mM L-glutamin. Den tidligere erhvervet en langt hurtigere vækst efter 4 uger kultur i mediet og blev opkaldt SF188f (hurtig). Sidstnævnte dog opretholdt lignende vækstrater som de parentale celler opretholdt i MEM, og blev navngivet SF188s (langsom). At opretholde deres særskilte vækstfænotype, SF188s og SF188f celler blev altid dyrket i DMEM indeholdende 5,5 mM glucose og 2 mM L-glutamin og 25 mM glucose og 6 mM L-glutamin, henholdsvis ved 37 ° C i en Forma inkubator med 10% CO

2 og 100% luftfugtighed på -80% sammenløb i 175 cm

2 T-kolber (Corning). Human prostatacancer PC-3 og livmoderhalskræft HeLa-celler blev erhvervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), og blev opretholdt i RMPI1640. Alle celledyrkningsmedier blev suppleret med 10% føtalt bovint albumin (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA).

XF assaymedium

En base medium blev anvendt til analyserne beskrevet i dette studie direkte eller suppleres med substrater og cofaktorer som specificeret i hvert af de specifikke analyser (se nedenfor), og for hvert forsøg. Basen assaymedium blev fremstillet som følger. Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) pulver (Sigma, katalognummer D5030) blev udgangsmaterialet. Den indeholder ingen glucose, L-glutamin, natriumpyruvat, natriumbicarbonat, eller phenolrødt, og har en lav phosphat (se Materialer S1 i File S1for detaljer forberedelse). Derudover kan en modificeret Krebs-Henseleit- bicarbonatpuffer (KHB), som ikke indeholder bicarbonat og lavere phosphat også anvendes (Materialer S2 i File S1) som et alternativt assay medium til fedtsyreoxidation. Anvendelsen af ​​aminosyre-fri buffer, i modsætning til basen medium for andre assays er mulig, men kan resultere i forskellige eksperimentelle resultater, som kan kræve forskellige data fortolkninger. Alle her beskrevne assays blev udført udelukkende i bunden medium med angivne tilskud, med undtagelse af fedtsyreoxidation, som blev udført i både basemedium og KHB, hvilket gav lignende resultater.

Fremstilling af palmitat-BSA-konjugat

natriumpalmitat blev solubiliseret ved at varme det til 68 ° C i 150 mM natriumchlorid opløsning. Den blev derefter bundet til BSA i opløsning ved molforhold på 6:01. Den komplette protokol er beskrevet i Materiale S3 i File S1.

Måling af ilt forbrug sats og ekstracellulære forsuring satser

OCR og ECAR målinger blev udført ved hjælp af XF24 eller XF96 Ekstracellulær Flux analysator (Seahorse Bioscience , North Billerica, MA) som beskrevet [22]. Kort beskrevet blev celler udpladet i XF24 (V7) eller XF96 (V3) polystyren cellekulturplader (Seahorse Bioscience, North Billerica). SF188s celler blev podet ved 30.000 /brønd (XF24 plade) eller 20.000 /brønd (XF96 plade) og SF188f celler ved 20.000 /brønd (XF24 plade) eller 15.000 /brønd (XF96 plade), hhv. PC-3 og HeLa-celler blev udpladet ved 25.000 og 30.000 celler per brønd i henholdsvis XF24 celledyrkningspladerne. Cellerne blev inkuberet i 24 til 28 timer i en befugtet 37 ° C inkubator med 10% CO

2 (DMEM medium) eller 5% CO

2 (RMPI1640 og MEM-medium), hhv. Da de to cellelinjer prolifererer ved forskellige hastigheder under 24-28 timers inkubationsperioden blev SF188s og SF188f celler behandlet med trypsin og derefter talt for at bestemme celleantallet i hver brønd efter et assay. Disse celletal blev brugt til at normalisere enten OCR eller ECAR. Deres levedygtighed, som bestemt efter assays, var næsten ikke skelnes uanset nærvær eller fravær af exogene substrater eller metaboliske inhibitorer i assaymediet. Før udførelse af et assay, blev vækstmediet i brøndene af en XF cellepladen udveksles med den passende assaymedium for at opnå et minimum af 1:1000 fortynding af vækstmediet. 600 pi (XF24) eller 150 pi (XF96) af assaymedium sættes til celler til en XF-assay. Mens sensor patroner blev kalibreret blev celleplader inkuberet i et 37 ° C /ikke-CO

2 inkubator i 60 minutter før starten af ​​et assay. Alle eksperimenter blev udført ved 37 ° C. Hver måling cyklus bestod af en blanding på 3 minutter og en dataindsamlings- periode på 3 minutter (13 datapunkter) for XF24 og 2 minutter og 4 minutter for XF96. OCR og ECAR datapunkter refererer til de gennemsnitlige satser under målingen cyklusser. Alle forbindelser blev fremstillet i passende koncentrationer i ønsket assaymedium og indstillet til pH 7,4. Et volumen på 75 pi til XF24 (25 pi for XF96) af forbindelse blev tilsat til hver indsprøjtningsåbning. I et typisk eksperiment blev 3 basislinjemålinger taget før tilsætning af en hvilken som helst forbindelse, og 3 responsmålinger blev taget efter tilsætning af hver forbindelse. OCR og ECAR blev rapporteret som absolutte satser (pmol /min for OCR og mph /min for ECAR) eller normaliseret mod celletal, eller udtrykt i procent af forbruget baseline ilt. I denne undersøgelse baseline OCR eller ECAR (et teknisk udtryk) refererer til de udgangsmaterialer satser før tilsætningen af ​​et middel, der kan anvendes til sammenligninger med disse satser efter tilsætningen. I modsætning hertil basal OCR eller ECAR (en biologisk term) henviser til OCR eller ECAR der forekommer i celler i hvile for at opretholde grundlæggende cellefunktion. Medmindre andet er angivet, blev den tredje måling af baseline eller efter tilsætning af hvert substrat eller forbindelse, der anvendes til at generere absolutte OCR eller ECAR værdier. Samt blev procentdel af baseline OCR-værdier beregnet som OCR på den tredje måling efter en agent injektion divideret med OCR umiddelbart før injektionen. Hver datum blev bestemt minimalt i tre eksemplarer.

XF Substrat Flux Assay Betingelser

glykolytisk flux og glykolytisk kapacitet.

Analysen medium består af basen medium suppleret med 2 mM L -glutamine. Glutamin er nødvendig for at opnå den maksimale glykolyse sats for nogle, men ikke alle cellelinjer. Det samme medium blev anvendt til bestemmelse glycolytisk kapacitet. Koncentrationen af ​​glucose tilsat for at initiere glykolyse og måle glycolytiske kapacitet var 10 mM, større end mætningspunktet under begge betingelser.

Glucose oxidation.

Assaymediet var base medium uden nogen eksogene brændstof substrat tilskud. Koncentrationen af ​​glucose tilsat for at initiere glucoseoxidation var 10 mM, som blev bestemt i præliminære eksperimenter at være over mætning.

Glutamin oxidation.

Assaymediet var base medium uden nogen eksogene brændstof substrat. Koncentrationen af ​​glutamin tilsat til cellerne for at initiere glutamin oxidation blev 4 mM, som også var forudbestemt til at være over mætning.

fedtsyreoxidation.

Assaymediet var base medium (eller KHB) suppleret med 5,5 mM glucose og 50 uM carnitin (påkrævet at transportere langkædede fedtsyre i mitokondrierne). Fede testede syrer omfatter langkædede fedtsyrer palmitat, medium kæde fedtsyre octanoat, og kortkædede fedtsyrer butyrat. De blev titreret for koncentrationer stimulerende maksimal OCR respons. Arbejdsgruppen koncentration af palmitat konjugeret med BSA var 150 uM, og octanoat 1 mM, hvilket også var over mætning.

Det er afgørende, at de ovenstående assaybetingelser nøje overholdes. Enhver variation i assaymediet sammensætning kan resultere i forskellige fortolkninger og indsigt i cellulære metaboliske netværk. Mættende substratkoncentrationer og optimale sammensatte koncentrationer blev bestemt ved udførelse titreringsforsøg som beskrevet i Materialer S4 og S5 i File S1. Effekten af ​​assay betingelser om fortolkningen af ​​forsøgsresultater vil blive beskrevet andetsteds.

celletælling

SF188s og SF188f celler blev fritliggende med trypsin-EDTA og høstet umiddelbart efter en XF assay. Antallet af celler i hver brønd blev bestemt under anvendelse af en ViCell automatiseret trypanblåt tæller (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) og blev anvendt til at normalisere OCR og ECAR som angivet i figurteksterne.

Statistisk analyse

data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse, med mindst tre gentagelser anvendes for hvert datapunkt. Medmindre andet er angivet, en parret Students

t

test blev udført for hver forsøgsgruppe for at vurdere den statistiske signifikans mod respektive kontroller.

Resultater

Glycolysis og glykolytisk kapacitet

Vi har tidligere vist, at glycolyse udgør -80% af den samlede ECAR i et antal cancerceller som bestemt gennem to metoder: a) fjerne glucose fra assaymediet og b) tilsætning af glycolytiske pathway hæmmere såsom hexokinase inhibitoren 2- GD og laktat dehydrogenase (LDH) hæmmer oxamatet [22]. De resterende 20% af ECAR kan tilskrives andre metaboliske processer, såsom CO TCA cyklus

2 evolution. For at måle glykolysen hjælp ECAR mere præcist og nemt, tog vi følgende fremgangsmåde. Glucose tilsættes til celler, der er inkuberet i et glucose-frit medium, men suppleret med glutamin (se Materialer og fremgangsmåder). Den ECAR stigning efter tilsætning af glukose etablerer glykolysen sats. En efterfølgende tilsætning af en glycolyse inhibitor eliminerer glucose-induceret ECAR stigning. Enhver forsuring på grund af andre metaboliske processer som CO TCA cyklus

2 frigivelse (fra enhver substrat, men glukose) registreres som ECAR før glukose tilføjelse. OCR reaktion på glucose, overvåges samtidig med ECAR, tjener som en indikator for, om glucose også kataboliseres via mitokondriel respiration (figur 1A).

A. Skematisk illustration af glycolytiske vej. NADH produceret i cytosolen som glucose omdannes til pyruvat og regenereres ved LDH i cytosolen. B. Kinetic ECAR respons SF188s celler til glucose (10 mM) og 2-DG (100 mM) eller oxamat (100 mM), hhv. SF188s celler blev udpladet med 30.000 celler /brønd i XF24 V7 cellekulturplader 24-28 timer forud for assays. Assaymediet var substrat-fri base-medium (som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder) suppleret med 2 mM glutamin. Den ECAR værdien var ikke normaliseret. Et repræsentativt eksperiment ud af mindst tre er vist her. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse, n = 4. C. ECAR respons HeLa-celler til glucose (10 mM), 2-DG (100 mM) og antimycin (1 uM). Indsæt: OCR respons i de samme forsøg, der viser den Crabtree virkning, og at glucose forøgede ikke OCR. HeLa-celler blev udpladet ved 30.000 /brønd i XF24 cellekulturplader 24-28 timer før analyserne. ECAR eller OCR-værdier var ikke normaliseret. Assaymediet var substrat-fri base-medium (som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder) suppleret med 2 mM glutamin. Et repræsentativt eksperiment ud af mindst tre er vist her. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdi ± SD, n = 5.

Vi udførte eksperimentet under anvendelse SF188s og HeLa-celler. Som vist i figur 1B, glucose foruden SF188s celler udløste en øjeblikkelig ECAR stigning, 38 ± 4 mph /min (ECAR af måling 6 mindre end måling 3), som efterfølgende blev ophævet ved tilsætning af glycolyse inhibitorer, enten 2-DG eller oxamatet. Dette eksperiment indikerede, at eksogent tilsat glukose blev fordelt til laktat (fordi LDH hæmning af oxamatet reducerer ECAR på samme måde som 2-DG), der forårsager en ECAR stigning og dermed validere vores eksperimentelle design. Lignende resultater blev opnået i HeLa-celler (Fig 1C.), Som var i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse [22], samt med en række nylige rapporter, der viser, at ECAR reaktion paralleller den for lactat produktion [25] – [27]. Før tilsætning af glucose til cellerne samt efter tilsætning af 2-DG eller oxamat, vi igen observeret en lille ECAR, 6 ± 1 km /h /min og 10 ± 2 km /h /min (ved måling 3), henholdsvis i SF188s og HeLa-celler (Figur 1B og C). Vi henviser til denne lille, men målbar ECAR som ikke-glycolytisk forsuring. OCR respons viste, at injektion af glucose ikke blot undladt at udløse en stigning, men faktisk gav en mindre nedsættelse i OCR (figur 1C), hvilket svarer til Crabtree Effect, først observeret i tumorceller ved Crabtree i 1920’erne [ ,,,0],28].

de to væsentligste proton kilder, der kan bidrage til ikke-glykolytisk forsuring er TCA cyklus og nedbrydning af intracellulære glykogen, dvs. glycogenolyse [20]. For at bestemme bidraget fra CO TCA cyklus

2 evolution, anvendte vi et kompleks III inhibitor antimycin at stoppe strømmen af ​​elektroner og således TCA cyklus flux i HeLa-celler. Glucose blev sat først at indlede glykolysen, efterfulgt af 2-DG at afskaffe den, efterlader ikke-glycolytisk ECAR. Den endelige tilsætning af antimycin stoppede TCA cyklus producere CO

2. Selv om en rest tilbage, 4 ± 1,4 km /h /min, antimycin slået omkring halvdelen af ​​den ikke-glycolytiske ECAR (figur 1C), hvilket bekræfter bidrag TCA cyklus CO

2-afledte proton til ikke-glycolytisk forsuring. Vi testede, om antimycin-resistente ECAR skyldtes glycogenolyse ved hjælp CP91149, en inhibitor af glycogenphosphorylase (det første enzym af glykogen nedbrydning), men vi havde ikke iagttage nogen signifikant effekt af CP91149 på ikke-glykolytisk forsuring (data ikke vist) , hvilket fører os til at konkludere, at den tilbageværende ikke-glykolytisk ECAR skulle forklares ved andre metaboliske processer, såsom decarboxylering reaktioner katalyseret af glucose-6-phosphat dehydrogenase og /eller pyruvat dehydrogenase. Kollektivt, disse resultater igen bekræftet, at glycolyse tegner sig for størstedelen af ​​ECAR observeret i kræftceller, og fastslog, at TCA-afledte CO

2 er en primær bidragyder af ikke-glykolytisk forsuring.

glykolytisk flux bestemt

in vitro

ved omgivende ilt niveauer afspejler basal glykolyse sats. Når celler oplever tab af mitokondrie ATP-produktion på grund af hæmning af oxidativ phosphorylering, enten ved lav oxygenspænding eller ved oligomycin, de forøge deres glycolytiske flux og gøre mere ATP fra glycolytiske veje til at opretholde cellulær ATP homeostase [22]. Vi henviser til denne øgede glycolytiske flux som reaktion på mangel i mitokondriel ATP-produktion som glycolytiske kapacitet. Eksperimentelt, vi definerer glykolytisk egenskab af glukose-induceret ECAR af mitokondrie ATP syntase inhibitor oligomycin.

For at bestemme både glykolytisk flux og glykolytisk kapacitet samme celle population i et eksperiment, vi målte ECAR mens fortløbende intravenøse glucose, oligomycin, og 2-DG. Som vist i figur 2A, tilføjer glucose til HeLa-celler, som forventet, udløste et glycolytisk flux på 19 ± 0,9 km /h /min (EACR ved måling 6 mindre end ved måling 3) i HeLa-celler. Den efterfølgende tilsætning af oligomycin forårsagede en yderligere stigning i ECAR til 44 ± 3,8 km /h /min (ECAR ved måling 9 mindre, at ved måling 3), hvilket indikerer en forhøjet glukose flux mod lactat og afslørende den glycolytiske kapacitet HeLa-celler. Den endelige tilsætning af glycolyse inhibitor 2-DG afskaffet samlede glycolyse (figur 2A). Den beregnede glycolytiske flux og glycolytiske kapacitet fra glycolyse forsøg er vist i figur 2B.

A. Kinetic ECAR respons af HeLa-celler til glucose (10 mM), oligomycin (2 uM), og 2-DG (100 mM). Indsæt viser OCR respons som respons på glucose og oligomycin. HeLa-celler blev udpladet ved 30.000 /brønd i XF24 V7 cellekulturplader 24-28 timer forud for assays. Assaymediet var substratet-fri base-medium suppleret med 2 mM glutamin. ECAR eller OCR-værdier var ikke normaliseret. Et repræsentativt eksperiment ud af ved 5 er vist her. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse, n = 4. B. Beregnet glycolytiske flux, glycolytiske kapacitet. Glykolytisk flux er forskellen mellem de ECARs måling 6 og måling 3. Ligeledes glykolytisk kapacitet beskriver forskellen mellem ECAR måling 9, og at måling 3. * p. 0,05

To eksperimenterende betingelser skal være opfyldt i ovenstående eksperiment. For det første bør oligomycin koncentrationen maksimalt inhiberer respiration. Dette blev opnået ved at vælge oligomycin koncentration, der resulterede i maksimal OCR hæmning i en titrering eksperiment. For eksempel blev 0,5 uM oligomycin sig at være tilstrækkelig til at opnå maksimal inhibering af OCR i HeLa-celler (data ikke vist). For det andet er det vigtigt at sikre, at forsyningen af ​​exogent glucose mætte, hvilket tillader den glycolytiske maskineri til at være den begrænsende faktor. Den mættende koncentration af glucose til opnåelse maksimal ECAR respons blev bestemt i en glucosekoncentration titreringseksperiment, hvori stigende koncentrationer af glucose blev tilsat til cellerne, efterfulgt af tilsætning af bekæmpelse, oligomycin ved koncentrationen, der maksimalt inhiberer respiration. I HeLa-celler for eksempel, fandt vi, at ECAR steget kontinuerligt indtil glucosekoncentrationen nåede 5 mM, hvorefter der ikke var nogen yderligere ECAR stigning (figur S1). Lignende resultater blev opnået med et dusin transformerede og ikke-transformerede cellelinier (data ikke vist). Vi valgte en højere end mættende koncentration på 10 mM som standard koncentration til at bestemme både glykolytisk flux og glykolytisk kapacitet.

Glucose oxidation

Glucose-afledte pyruvat kan også indtaste mitokondrierne, hvor det omdannes til acetyl CoA ved pyruvatdehydrogenase og kommer ind i TCA-cyklus via citratsynthase (eller som oxaloacetat via pyruvat carboxylase [29]. The acetyldel til sidst oxideres til CO

2 og H

2O (figur 3A) . Den oxygenholdige forbrugende proces af glucose oxidation første, pyruvat og derefter til CO

2 og H

2O omtales her som glucose oxidation.

A. Skematisk illustration af biokemisk vej for glucose oxidation . den NADH produceret i cytosolen som glucose omdannes til pyruvat importeres til mitokondrierne via malat-aspartat shuttle og regenereres via ETC at opretholde kontinuerlig glukose oxidation. B. Kinetic OCR respons PC-3 celler til glukose (10 mM ); C. OCR reaktion på glucose (10 mM), oligomycin (1 uM) og FCCP (0,3 uM). PC-3-celler blev udpladet ved 25.000 /brønd i XF24 V7 dyrkningsplader. Assaymediet var substratet-fri base medium. OCR værdier blev ikke normaliseret. Et repræsentativt eksperiment ud af tre er vist her. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdi ± SD, n = 4.

Eksperimentelt, vi brugte den glukose-induceret OCR til at måle glukose oxidation. For at fastslå den glucoseoxidation assayet, vi valgte PC-3-celler, som aktivt oxiderer glukose. Til bestemmelse af glucose oxidation, blev 10 mM glucose tilsat til cellerne i assaymedium indeholdende ingen glucose eller glutamin (se Materialer og fremgangsmåder). Som vist i figur 3B, tilsætning af glucose til PC-3-celler forårsagede en øjeblikkelig forøgelse OCR, 45 ± 11 pmol /min (OCR ved måling 6 mindre end ved måling 3), hvilket indikerer glucoseflux ind i TCA-cyklus, og i sidste ende , ETC til fuldstændig oxidation. Denne eksperimentelle design forudsat en kvantitativ måling af glucose oxidation under denne eksperimentelle betingelse. I en variant design blev PC-3-celler eksponeret for glucose, oligomycin, og FCCP fortløbende, med 3 målinger før hver forbindelse tilsætning og efter hver forbindelse tilsætning. FCCP afkobler respiration fra oxidativ phosphorylering, hvilket tillader oxidation af enhver oxiderbare substrat til stede i assaymediet at forekomme. Som vist i figur 3C, FCCP stimulerede en stigning i OCR efter glucose tilføjelse, men ikke kontrol, hvilket yderligere bekræfter, at de biokemiske veje for glucoseoxidation var aktive i PC-3-celler. OCR respons på FCCP bekræfter og giver en semi-kvantitativ vurdering af cellers evne til at oxidere glucose. I denne eksperimentelle design blev celler præinkuberet i substrat-fri base-medium i 60 minutter før et assay, så der er en mulighed, at de kan være blevet stressede og ændret deres reaktion på glucose tilsætning.