PLoS ONE: Nedsat Niveauer af Active SMAD2 korrelerer med dårlig prognose i Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

TGF-β spiller en dobbelt rolle i udviklingen af ​​kræft hos mennesker. I de tidlige stadier af carcinogenese, TGF-p fungerer som en tumorsuppressor. I de sene stadier af tumorudvikling, men kan TGF-β fremme tumorvækst og metastase. Et skift i Smad2 /3 phosphorylering fra carboxyterminalen til linker sites er en central begivenhed bestemmelse biologiske funktion af TGF-β i colorektal og hepatocellulært carcinom. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi den potentielle rolle differentieret Smad2 /3 fosforylering gastrisk adenocarcinom.

Metode

immunhistokemisk farvning med anti-P-Smad2 /3C og P-Smad2 /3L antistoffer blev udført på 130 paraffinindlejrede gastrisk adenocarcinom prøver. Forholdet mellem P-Smad2 /3C og P-Smad2 /3L immunhistokemisk score og clinicopathologic karakteristika patienter blev analyseret. Real time PCR blev anvendt til at måle mRNA ekspressionen af ​​Smad2 og Smad3 i kræft og omgivende ikke-tumorvæv.

vigtigste resultater

Ingen signifikant P-Smad2L og /eller P-Smad3L positiv farvning var påvist i de fleste af enheder (positiv farvning i 18/130 prøver). Positive P-Smad2 /3L farvning blev ikke forbundet med et fald i carboxyterminal fosforylering farvning. Tab af P-Smad2C bemærkelsesværdigt korreleret med dybden af ​​tumor infiltration og dårlig differentiering af cancerceller hos patienter med gastrisk cancer. Ingen sammenhæng kunne påvises mellem P-Smad3C og clinicopathologic karakteristika gastrisk adenocarcinom. afslørede imidlertid co-farvning analyse, at P-Smad3C co-lokaliseret med α-SMA og kollagen I i gastriske kræftceller, hvilket indikerer en potentiel sammenhæng mellem P-Smad3C og epitelial-til-mesenkymale overgang kræft. Real time PCR viste reduceret mRNA ekspressionen af ​​Smad2 i mavekræft sammenlignet med omgivende ikke-tumorvæv i 15/16 patienter.

Konklusioner

Tab af P-Smad2C tæt korreleret med kræft invasion og dårlig differentiering i mavekræft. I modsætning til kolorektal og hepatocellulært carcinom, kanonisk carboxyterminal fosforylering, men ikke linker fosforylering af Smad2 er kritisk for mavekræft

Henvisning:. Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Munker S, et al. (2012) Nedsat Niveauer af Active SMAD2 korrelerer med dårlig prognose i Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10,1371 /journal.pone.0035684

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: 6. oktober, 2011; Accepteret: 20 mar 2012; Udgivet 23. april, 2012 |

Copyright: © 2012 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af Health Bureau of Zhejiang-provinsen i Kina, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S.D.); BMBF “Hepatosys” 0313082L, “Virtual lever” og “celleterapi” 01GN0987 (standardafvigelse); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (standardafvigelse) og LA997 /5-1 (standardafvigelse); og Dietmar Hopp Stiftung GmbH (standardafvigelse). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gastrisk kræft er en førende årsag til kræft dødsfald i verden, ranking sekund hos mænd og fjerde hos kvinder i frekvens [1]. Patogenesen af ​​mavekræft er forbundet med flere faktorer. Blandt disse, dysregulering af signalveje relateret til udviklingsmæssige processer, herunder transformerende vækstfaktor-β (TGF-β), Wnt /β-catenin, pindsvin og Notch signalering, spiller en central rolle i udviklingen og progressionen af ​​denne kræft [2].

TGF-β-familien af ​​molekyler, herunder TGF-p-isoformer, activiner og knoglemorfogenetiske proteiner (BMP’er), har vigtige funktioner i forskellige fysiologiske og patofysiologiske processer, fx fosterudvikling, autoimmune sygdomme, fibrose og cancer [3], [4]. TGF-β transducerer sine signaler ved at stimulere dannelsen af ​​heteromere komplekser af TGF-β type I (TGF-βRI) og type II (TGF-βRII) serin /threonin kinase receptorer. Aktiveret TGF-βRI forplanter signalering ved rekruttering og phosphorylering af receptor-regulerede-Smads (R-Smads, herunder Smad2 og Smad3). Phosphorylering af C-terminale serin rester i R-Smads er et afgørende skridt for kanonisk TGF-β-signalering. De to mest C-terminale serinrester på serin 465/467 i Smad2 og serin 423/425 i Smad3 phosphoryleres sammen med en tredje ikke-phosphoryleret serinrest, danner en evolutionært bevaret SSXS motiv i alle R-Smads [5], [6]. Udover C-terminale phosphorylering af Smad2 /3 (P-Smad2C og P-Smad3C) af TGF-βRI, andre kinaser, f.eks c-Jun N-terminal kinase (JNK) og Ras-associerede kinaser, årsag fosforylering af R-Smads på linker steder omkring serin 249/254 i Smad2 og serin 208/213 i Smad3 (P-Smad2L og P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforylerede R-Smads danne et kompleks med fælles Smad (Co-Smad, Smad4 i pattedyr) og shuttle ind i kernen for målgenet transskription [3]. Udover R-Smad og co-Smad, den tredje type af Smad protein er inhibitor-Smad (I-Smad, Smad6 og Smad7). I-Smads er transkriptionelt induceret af TGF-β, hvilket indikerer en negativ feedback mekanisme af denne signalvej [4].

TGF-β spiller en dobbelt rolle i progressionen af ​​human cancer [9], [10] . I de tidlige stadier af cancer, TGF-p fungerer som en tumorsuppressor ved at hæmme cellulær proliferation eller ved at fremme cellulær apoptose. Men i de sene stadier, TGF-β understøtter, tumorudvikling såsom tumorcelleinvasion, formidling og immun unddragelse [9]. Desuden er TGF-β godt anerkendt som en mediator af epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) i cancer [11]. Selvom forstyrrelser af TGF-β /Smad signalering er centrale for carcinogenese i de fleste organer, dets tumor fremme resultatet er meget kontekstafhængig. For eksempel, TGF-β-signalering er afgørende i vedligeholdelse af kræft stamceller selv-fornyelse og tumorigen aktivitet i gliom og leukæmi, mens virkningerne af TGF-β-signalering i brystkræft stamcelle er kontroversielle [12]. En undersøgelse viste, at blokering TGF-β-vejen via en dominant negativ TGF-βRII øger størrelsen på brystet knoglemarven og fremmer tumorigenese, hvilket indikerer en undertrykkelse af bryst carcinogenese af dette cytokin [13]. Derimod Mani og kolleger fandt, at TGF-β pathway os kritisk i vedligeholdelse af brystcancer stamcellelignende egenskaber og tumorigen aktivitet via induktion EMT [14]. Salg

mavekræft, single-polymorfier ( SNP’er) af TGF-β er forbundet med modtagelighed for fase i og fase II af mavekræft [15], [16]. Serumniveauerne af TGF-β blev rapporteret signifikant korrelerer med venøs invasion i patienter med gastrisk cancer [17]. Imidlertid detaljerede mekanismer i TGF-β signalering i gastrisk cancer progression er stadig ukendt. Derudover er det stadig uklart, hvornår og hvordan TGF-β forvandler sig fra en tumor suppressor i en tumor promotor under carcinogenese.

For nylig et skift i phosphorylering af Smad2 /3 fra C-terminalen til linker-sites blev påvist som en central begivenhed bestemmelse biologiske funktion af TGF-β i cancer [18], [19], [20]. Tidligere undersøgelser baseret på 12 år opfølgning viste, at kronisk HBV /HCV-patienter med P-Smad2 /3L i levervæv havde en højere risiko for at videre til hepatocellulært carcinom (HCC) end dem med P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. I overensstemmelse med resultaterne i HCC blev lignende observationer foretaget i kolorektal cancer [7], [22].

For at undersøge bidraget fra forskellen Smad fosforylering mod carcinogenese i mavekræft, vi undersøgte P-Smad2 /3C og P-Smad2 /3L-niveauer i 130 patienter med gastrisk adenocarcinom ved immunhistokemi (IHC). Vi analyserede potentielle sammenhænge mellem forskellige steder i phosphorylering af R-Smads og invasion, lymfeknude metastaser, differentiering og stadium af mavekræft.

Resultater

Linker phosphorylering af Smad2 /3 er ikke forbundet med mavekræft

I modsætning til tidligere resultater fra kolorektal cancer og HCC [7], [8], [21], [22], vi ikke afsløre signifikant P-Smad2L og /eller P-Smad3L positive farvning i gastriske væv fra patienter med gastrisk cancer. Kun 18 ud af 130 patienter viste p-Smad3L positiv farvning hovedsageligt i ikke-kræftceller. Disse resultater antyder, at linker phosphorylering i serin-lokaliteter af Smad2 /3 er ikke kritisk i gastrisk cancer.

Forskellige træk ved P-Smad2C og P-Smad3C niveauer i gastrisk cancer

118 ud af 130 gastrisk væv viste P-Smad2C positiv farvning, og 91 ud af 130 gastriske væv var positive for P-Smad3C farvning hhv. Adskiller sig fra P-Smad2C positiv farvning, som først blev visning i kernen af ​​normale celler og cancerceller (fig. 1A), P-Smad3C positiv farvning blev påvist i kernen (59/130, fig. 1 B), på membranen og /eller i cytoplasmaet (73/130, fig. 1C) af gastriske cancerceller. Desuden blev P-Smad3C set af positiv farvning i fibroblaster omgivende cancerceller (81/130 og 91/130, fig. 1D).

Mønstre af P-Smad2C (A) og P-Smad3C (B -D) IHC farvning i mavekræft. (B) P-Smad3 kernefarvning; (C) P-Smad3 membran /plasma farvning; (D) P-Smad3 fibroblast farvning.

Reduceret P-Smad2C bemærkelsesværdigt korrelerer med tumor dybde (T) og differentiering af kræft (G) hos patienter med mavekræft

Vi målte P-Smad2C IHC-farvning ikke kun i tumoren, men også i omgivende ikke-tumorvæv fra 130 patienter med gastrisk cancer. P-Smad2C positiv farvning i enten kræft eller normale celler omvendt korreleret med differentiering af mavekræft (begge

s

0,0001, tabel 1). Desuden faldt P-Smad2C IHC score i cancerceller korrelerede med tumor dybde (

s Restaurant 0,05, tabel 1). P-Smad2C niveauer i normal væv samt viste en potentiel omvendt korrelation med kræft invasion i disse patienter (

s

= 0,07, tabel 1). P-Smad2C IHC score blev signifikant reduceret i cancervæv sammenlignet med ikke-tumorvæv i 77 af 130 patienter med gastrisk cancer. Endvidere inden for tumorvæv, cancerceller med dårligt atypi viste reduceret P-Smad2C farvning, når man sammenligner med veldifferentierede dem (fig. 2). Kendall-tau korrelationsanalyse afslørede en potentiel korrelation mellem reduktion af P-Smad2C farvning og overgangen fra normal til cancerceller i gastrisk cancer (

s

= 0,05, tabel 2), hvilket antyder, at aktivering af Smad2 signalering er en kritisk suppressor tumor dannelse og progression.

(a) Immun positivitet af P-Smad2C blev signifikant reduceret i kræft væv (

b

) sammenlignet med omgivende normale væv (

en

) i 77 ud af 130 patienter med mavekræft. Repræsentative billeder blev taget fra en patient med signet-ring cell carcinoma. (B) I tumorvæv, kræftceller med dårlig atypi (

e-h

) viste reduceret P-Smad2C farvning sammenlignet med dem med en veldifferentieret fænotype (

a-d

). Vejviser

P-Smad3C ofte findes i kræft forbundet fibroblaster

P-Smad3C IHC score ikke udviste en signifikant sammenhæng med T /N /G /S af gastrisk cancer prøver (tabel 1). Men P-Smad3C positiv farvning ofte forekommet i fibroblaster omkringliggende kræftceller hos patienter med gastrisk cancer (fig. 1).

Kræftceller er af epitelial oprindelse og udtrykker ikke mesenkymale markører, f.eks a-SMA og kollagen I. Hvis cancerceller udtrykker mesenkymale markører, er det tyder på epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) [11]. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi α-SMA positiv farvning i cancerceller i 54 af 130 patienter med gastrisk cancer (fx patient-1 i fig. 3). For at tydeliggøre kan være sammenhæng mellem p-Smad3C og EMT, undersøgte vi sammenhængen mellem p-Smad3C farvning (kræft og omgivende ikke-cancer væv) og α-SMA positiv farvning i kræftceller. Kendall-tau rang korrelationskoefficienter mellem p-Smad3C IHC scores i kræft /omkringliggende ikke-cancer væv og α-SMA IHC scoringer i kræft er 0,14 (

s

= 0,08) og -0,09 (

p

= 0,99) (tabel 3). At bekræfte EMT hos disse patienter, udførte vi co-farvning for SNAIL, anden specifik markør for EMT, og kollagen I /α-SMA i gastriske væv. Konfokal mikroskopi afslørede co-lokalisering af Sneglen og collagen I (fig. 4A) /α-SMA (fig. 4B) i nogle gastriske cancerceller. Disse α-SMA-positive gastriske cancerceller såvel viste P-Smad3C positiv farvning (fig. 4C). Udover co-lokalisering med α-SMA-positive gastriske cancerceller, afslørede konfokal mikroskopi, at P-Smad3C co-lokaliseret med kollagen I i gastriske cancerceller (fig. 4D). Endvidere P-Smad3C positiv farvning co-lokaliseret med α-SMA og kollagen I ikke kun i kræftceller, men også i fibroblaster (fig. 4C-4D). Disse resultater antyder, at P-Smad3C kan bidrage til EMT af gastrisk cancer hos nogle patienter.

Repræsentative billeder fra to patienter med gastrisk cancer show α-SMA og P-Smad3C farvning i cancer-området (tumor) og omgivende ikke -cancer væv (ikke-tumor).

Konfokal mikroskopi analyse viser co-lokalisering af sneglen og collagen i (a) /α-SMA (B) i et repræsentativt patient med mavekræft. Den samme patient derudover viser co-lokalisering af P-Smad3C og kollagen I (C) /α-SMA (D) i mavekræft.

Tab af total Smad2 og Smad3 udtryk i patienter med gastrisk cancer

Foruden at måle P-Smad2 i gastrisk cancer, vi brugte realtids-PCR til påvisning mRNA ekspression af Smad2 og Smad3 i gastrisk cancer og omgivende ikke-tumorvæv fra 16 patienter. 15 og 12 patienter henholdsvis påviste reduceret mRNA-ekspression af Smad2 og Smad3 i cancervæv sammenlignet med omgivende normale væv (fig. 5). Disse resultater viser, at ikke kun aktiveret Smad2 men også mRNA ekspression af total Smad2 reduceres under gastrisk carcinogenese.

Real-time PCR blev udført for at bestemme mRNA ekspression af Smad2 (A) og Smad3 (B) i 16 mavekræft væv og de omkringliggende ikke-tumorvæv (nr 1-5: middle differentieret kræft, nr 6-13: dårligt differentieret kræft og nr 14-16: signet-ring celle kræft)

diskussion

i kolorektal adenocarcinom og HCC har et skift i fosforylering fra carboxyterminus at linker regioner blevet foreslået som en kritisk hændelse i forbindelse med skift af TGF-β fra en cancer suppressor til en onkogen faktor [ ,,,0],8], [18], [19], [20], [21], [22]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi dette potentiale forening i gastrisk cancer. Vi har ikke konstatere væsentlige P-Smad2L og P-Smad3L niveauer i 130 patienter med mavekræft. 112 ud af 130 patienter viste ikke P-Smad2L eller P-Smad3L farvning i gastriske cancerceller, hvilket antyder, at den foreslåede ændring i phosphorylering af R-Smad ikke kan bidrage til TGF-β-medieret carcinogenese i denne type af cancer. I modsætning til P-Smad2 /3L, både P-Smad2C og P-Smad3C blev detekteret positiv farvning i de fleste patienter med gastrisk cancer. Kendall-tau rang korrelationsanalyse viste, at P-Smad2C IHC score omvendt korrelerer med dybden af ​​tumor (T) og differentiering af cancer (G).

rolle Smad2 under dannelsen og udviklingen af ​​forskellige cancer typen forbliver kontroversielt . I overensstemmelse med den aktuelle fund, tidligere undersøgelser af esophageal pladecellekræft, brystkræft og tarmkræft viste, at tabet af Smad2 udtryk er korreleret med tumor udvikling og dårlig prognose [23], [24], [25], [26]. For nylig, Hoot og kolleger fandt, at Smad2, men ikke Smad3, ofte blev tabt i 83 patienter med hud pladecellekræft. Endvidere mus med keratinocyt-specifik Smad2 deletion vist fremskyndet dannelse og malign progression af kemisk inducerede muse hudtumorer sammenlignet med vildtypemus [27]. Men i en undersøgelse af 52 patienter med gliom, blev en positiv P-Smad2 IHC score rapporteret at korrelere med spredning af gliomer og dårlig prognose [28]. Forud for den foreliggende undersøgelse Shinto og kolleger målte P-Smad2C farvning i 135 patienter med gastrisk cancer. De fandt, at de P-Smad2C niveauer var højere i dårligt differentieret kræft sammenlignet med godt differentierede dem [29]. Det står endnu ikke klart, hvorfor der er helt modsatrettede resultater i gastrisk cancer.

I kanonisk TGF-β-signalering, aktiveret TGF-βRI normalt inducerer carboxyterminale phosphorylering af både Smad2 og Smad3. Aktiveret Smad2 og Smad3 spille forskellige roller i cellevækst, differentiering og andre biologiske funktioner [30]. I leveren Smad2 er kritisk i mediering hepatocytvækst og differentiering, mens Smad3 spiller en central virkning på den morfologiske og funktionelle modning af hepatiske stjerneformige celler [31], [32]. I kræft, det er kontroversielt, om afbrydelse af Smad3 genet bidrager til tumorigenese. Zhu rapporterede, at Smad3-deficiente mus udvikler coloncarcinom [33]. Men andre undersøgelser ved hjælp Smad3-mangel mus foreslog, at tabet af Smad3 alene ikke er tilstrækkelig til at indlede tumorigenese [34], [35], [36], [37]. I mavekræft, Han fandt lave niveauer af Smad3 i 3 ud af 8 patienter og i ni menneskelige gastrisk cancer cellelinjer [38]. Indførelse af en Smad3 vektor i gastriske cellelinjer restaureret TGF-β reaktionsevne. Endvidere injektion af Smad3-udtrykkende gastriske celler i nøgne mus viste forsinket tumorigenese sammenlignet med kontroller, hvilket indikerer en korrelation af tab af Smad3 med carcinogenese [38]. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi ikke en signifikant sammenhæng mellem P-Smad3C farvning i gastrisk cancerceller og kræft invasion, differentiering og scene. Adskiller sig fra P-Smad2C, som kun udtrykkes i kerner af celler, P-Smad3C positiv farvning kan påvises i kernen, på membranen og i cytoplasmaet af gastriske cancerceller. Den biologiske relevans af forskellige mønstre af P-Smad3C farvning i cancerceller er i øjeblikket stadig ukendt.

EMT af cancerceller er en forudsætning for forløber til avancerede metastatiske tumorer [11]. Det er blevet erkendt, at TGF-β er en vigtig aktør i EMT. Smad3, men ikke Smad2, er en vigtig mediator i TGF-β afhængig EMT [39]. For eksempel TGF-β undlader at inducere EMT i primære tubulære epitelceller afledt fra nyrer fra Smad3-deficiente mus [40]. Inhibering af TGF-β-signalering ved Ki26894, et TGF-βRI inhibitor, nedsat invasion og EMT af scirrhous gastrisk cancer

in vitro

[41]. Vores resultater viser, at en del af gastriske cancerceller udtrykker EMT markører, f.eks Snegl, kollagen I og α-SMA. Co-lokalisering af P-Smad3C med α-SMA /collagen I findes i en væsentlig undergruppe af patienter. Desuden α-SMA positiv farvning i cancerceller har en potentiel korrelation med P-Smad3C IHC score af cancerceller, men ikke omkring andet væv. Disse resultater viser, at P-Smad3C kunne spille en rolle i EMT af mavekræft.

I resumé, nærværende undersøgelse tyder på, at Smad2 er en vigtig mediator at forsvare gastriske celler fra fremad mod dårligt differentieret kræft. Ifølge vores resultater, er Smad3 ikke direkte forbundet med karakteristika af mavekræft, men vores data viste, at det kan spille en rolle i cancer associeret fibroblaster og EMT af gastriske kræftceller.

Metoder

patienter

Kirurgiske prøver blev undersøgt fra patienter med primær mavekræft ved Institut for Almen Kirurgi, First Affiliated Sygehus, Medical School, Zhejiang University, Kina fra 2003 til 2009. gastric vævsprøven blev opkrævet ved operationer dissekeret den mavekræft. De indsamlede væv inkluderet tumor og omkringliggende ikke-tumor områder (væv i det mindste mere end 5 cm langt væk fra tumoren). En del af væv blev fikseret med i 4% formaldehyd og indlejres i paraffin til histologi og IHC måling. Forblev friske væv blev anbragt i flydende nitrogen umiddelbart efter mRNA måling. I alt 130 parrede gastrisk væv, herunder kræft og de omkringliggende ikke-tumorvæv blev inkluderet. Patologisk diagnose og klassifikationer blev anslået i henhold til tumor-node-metastaser (TNM) klassificering anbefalet af Den Internationale Union mod Kræft (syvende udgave) [42]. Grundlæggende karakteristika for de inkluderede patienter er vist i tabel 4. forsøgsprotokollen var i overensstemmelse med de etiske retningslinjer i Helsinki-deklarationen (1975). Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité af First Affiliated Sygehus, Medical School, Zhejiang University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere, der er involveret i undersøgelsen.

Antistoffer

Kanin polyklonale antistoffer mod P-Smad2C (Ser 465/467), P-Smad3C (ser 423 /425) blev P-Smad2L (Ser 250/255), og P-Smad3L (Ser 208/213) beskrevet i tidligere undersøgelser [43], [44]. Muse-anti-humant α-SMA (M0851), polyklonalt anti-SNAIL (ab-17.732), og monoklonalt anti-collagen I (C2456) antistoffer blev indkøbt fra DAKO, Abcam og Sigma henholdsvis.

Immunhistokemi (IHC )

efter gennemgang af H 1, 25% positive celler; 2, 25% -50% positive celler; 3, 50% positive celler); intensiteten af ​​positiv farvning, kvaliteter 1-3 (1, svag positiv farvning, normalt gul, 2, stærk positiv farvning, normalt brun, 3, meget stærk positiv farvning, sædvanligvis dyb brun til sort). Det endelige immun farvning score blev beregnet som antallet × intensitet.

Immunfluorescensfarvning

Glassene blev deparaffinised i xylen og rehydreret i gradueret ethanol indtil destilleret vand. Derefter antigen-genvinding blev udført ved mikrobølgebehandling i EDTA-buffer (1 mmol, pH 8,0). Objektglassene blev derefter behandlet med 3% H

2O

2 i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS, både primære antistoffer, kanin anti-P-Smad3C /Sneglen og muse-anti-α-SMA /kollagen I, blev påført ved 4 ° C natten over. Derefter, sekundære antistoffer, Alexa633-kanin-anti-muse-immunoglobulin G og Alexa488-æsel-anti-kanin-immunoglobulin G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland), blev anvendt i 30 minutter ved stuetemperatur. Prøverne blev monteret ved hjælp af Dako-Cytomation Fluorescent Mounting Medium. Glassene blev inspiceret og billeder blev taget på en konfokal mikroskop (Leica, Heidelberg). Sektioner uden primære antistoffer blev anvendt som negative kontroller.

Real time PCR

Det totale RNA blev oprenset fra gastriske væv med Pure High RNA-isolering kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Tyskland) ifølge til fabrikantens protokol, og koncentrationen blev målt spektrofotometrisk. cDNA blev syntetiseret fra 1 pg RNA med Transcriptor First Strand cDNA-syntese kit (Roche Diagnostics). Kvantitativ realtids-PCR blev udført med en ABIPrism 7700 Detektionssekvensen systemet (Applied Biosystems) under anvendelse af en TaqMan universal PCR Master Mix nr AmpErase UNG (del nr. 4.324.018). Følgende genekspression assays blev anvendt: Smad2 (fremad: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; omvendt: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (fremad: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; omvendt: GAAGGCGAACTCACACAGC) og peptidylprolyl isomerase A (housekeeping-gen; del nr Mm02342429_g1..). Alle reagenser blev købt fra Applied Biosystems. Prøver blev kørt tredobbelt under følgende betingelser: indledende denaturering i 2 minutter ved 50 ° C og i 10 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 40 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 1 minut ved 60 ° C. Niveauerne af genekspression i hver prøve blev bestemt med den sammenlignende tærskel cyklus metode.

Statistisk analyse

At evaluere sammenhæng mellem udvalgte immunologiske markører og tumor parametre, blev udført Kendall-tau rang korrelationsanalyse under anvendelse SAS-version 9.2 (Cary, NC, USA). En

s

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant