Abstrakt
Feltet af kræftforskning og behandling har gjort betydelige fremskridt, men vi er langt fra at have helt sikre, effektive og specifikke behandlinger, der er målrettet kræftceller og skåne de sunde væv. Naturlige forbindelser kan reducere problemerne i forbindelse med kræftbehandling. I øjeblikket er mange planteprodukter, der anvendes til behandling af kræft. I denne undersøgelse rohitukin, en naturlig forekommende chromon alkaloid udvundet
Dysoxylum binectariferum
, blev undersøgt for cytotoksiske egenskaber mod knopskydende gær samt mod lungekræft (A549) -celler. Vi forsøgte at specifikt at studere rohitukin i
S
.
cerevisiae
i forbindelse med MAPK veje som gær sandsynligvis repræsenterer den eksperimentelle model, hvor organisationen og regulering af MAPK veje forstås bedst. MAPK er evolutionært bevaret proteinkinaser, der overfører ekstracellulære signaler til maskinen styrer vigtige cellulære processer som vækst, migration, differentiering, celledeling og apoptose. Vi sigter mod at gennemføre hypotese drevet studier i retning af at målrette den vigtige netværk af cellulær kommunikation, en kritisk proces, der får galt i kræft. Anvender mutant stammer af genetisk modelsystem
Saccharomyces cerevisiae
.
S
.
cerevisiae
koder fem MAPK’er involveret i kontrol af distinkte cellulære reaktioner såsom vækst, differentiering, migration og apoptose. Vores undersøgelse involverer gen knockouts af
Slt2
Hog1
som er funktionelle homologer af menneskelig ERK5 og pattedyr p38 MAPK hhv. Vi udførte cytotoksicitet assay for at vurdere virkningen af rohitukin på cellelevedygtighed og endvidere bestemmes virkningerne af lægemidlet på generering af reaktive oxygenarter, induktion af apoptose og ekspression af
Slt2
Hog1
genet ved mRNA-niveauet i nærvær af lægemiddel. Resultaterne af denne undersøgelse viser en differentiel effekt i aktiviteten af lægemiddel mellem WT,
Slt2
og
Hog1
gendeletion stamme, som angiver inddragelse af MAPK-vejen. Endvidere undersøgte vi rohitukin inducerede cytotoksiske virkninger i lungekræft celler og stimuleret de produktioner af ROS efter udsættelse for 24 timer. Resultater fra western blotting tyder på, at rohitukin udløste apoptose i A549-cellelinje gennem opregulering af p53, caspase9 og nedregulering af Bcl-2-protein. Omfanget af denne undersøgelse er at forstå den mekanisme for anticancer aktivitet af rohitukin at øge repertoiret af lægemidler mod cancer, så problem skabt af fremkomsten af resistens over for standard anticancer-forbindelser kan afhjælpes
Henvisning:. Safia, Kamil M, Jadiya P, Sheikh S, Haque E, Nazir A, et al. (2015) chromonen Alkaloid, rohitukin, giver Anti-Cancer aktivitet via modulerende apoptoseveje i A549 Cell Line og gær mitogen aktiveret protein kinase (MAPK) Pathway. PLoS ONE 10 (9): e0137991. doi: 10,1371 /journal.pone.0137991
Redaktør: Muzamil Ahmad, Indian Institute of Integrative Medicine, INDIEN
Modtaget: 13. april, 2015; Accepteret: August 24, 2015; Udgivet: 25 September, 2015
Copyright: © 2015 Safia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. forfatterne er finansieret af Integral University og University Grant Kommissionens Indien. Ms Safia er taknemmelig for University Grants Kommissionen (UGC), Indiens regering for Maulana Azad National Fellowship, (F1-17.1 /2011 /MANF-MUS-UTT-5405). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
stadig udvikling lidelse for kræft er stigende sine udfordringer på forskere og klinikere som sygdommen fortsætter med at pålægge enorm mængde sundhed byrde på en ødelæggende globalt plan. Betydelig forståelse af dens mekanistiske stikord er opnået gennem forskningsindsats, der nu bevist, at denne lidelse finder en stærk årsag i ændret kommunikationen mellem og i celler [1]. Hidtil effektive ikke-kirurgiske retsmidler mod sygdommen omfatter kemoterapi og stråling baseret behandlingsregimer. Men en række potentielle anti-cancer behandlinger, baseret på molekyler fra naturlig oprindelse, har udvist løfte i behandling af kræft, mens udøve minimale uønskede effekter (anæmi, kvalme og hårtab) og modvirke den udfordring resistens [2]. Foruden bivirkning og medikamentresistens, omkostningerne ved kemoterapi stof er også meget høj sammenlignet med den naturlige forbindelse fra de medicinske planter
rohitukin (C16H19NO5;. 5, 7-dihydroxy- 8- (3- hydroxy-1-methyl-4-piperidinyl) -2-methyl- 4H-chromen-4-on), isoleret fra
Amoora rohituka
,
Dysoxylum binectariferum
Schumanniophyton problematicum
, er kendt for at have anti-inflammatorisk, anti-implantering, anti-fertilitet, antiproliferativ og immunmodulerende egenskaber [3]. Men anticancer virkningsmekanisme rohitukin er ikke kendt, og som pr vores forståelse for første gang det er blevet evalueret i genetisk model system spirende gær samt i lunge kræftceller. Hundredvis af gær gener udviser et link til menneskelige sygdomsgener som næsten 30% af berygtede gener involveret i humane sygdomme har gær ortologer [4]. Det er interessant at bemærke, at 47% af gærgenerne kan med held humaniseres [5].
S
.
cerevisiae
hjælper også at afsløre vigtige aspekter af mange sygdomme såsom neurofibromatosis typen l, tyktarmskræft [6].
Vi forsøgte at specifikt at studere rohitukin i
S
.
cerevisiae
i forbindelse med MAPK veje som gær repræsenterer den eksperimentelle model, hvor organisationen og regulering af MAPK veje forstås bedst [7]. MAPK er evolutionært bevaret proteinkinaser, der overfører ekstracellulære signaler til maskinen styrer vigtige cellulære processer som vækst, migration, differentiering, celledeling og apoptose. Derfor er mutation i nogen af kinaser af disse veje er direkte forbundet med kræft [8]. Det er dermed klogt at fokusere yderligere forskningsindsats i retning af at designe mekanisme-baserede anti-cancer forbindelser, der virker på specifikke molekylære mål forbundet med ætiologien af sygdommen [9]. Derfor kinasekaskade viser hidtil ukendte muligheder for udvikling af nye cancerterapier designet til at være mindre toksiske end konventionelle kemoterapeutiske lægemidler [10]. Undersøgelserne blev udført under anvendelse af genetisk modelsystem
Saccharomyces cerevisiae
som det har været udnyttes med til at belyse anticancerterapi i association med udsættelse for 5-fluoruracil [11]. Gær er også værdsat som en slående model for anticancer narkotika forskning [12], da det har vist sig nyttigt i at afdække de cellulære mål af forskellige lægemidler, herunder ædle anti-cancer stof KP1019 [13]. Den spirende gær har fem typer af MAPK herunder: Fus3, Kss1, Smk1, Hog1 og Slt2. Slt2 er MAPK af cellevæggen integritet pathway og funktionel homolog af humant ERK5, der aktiveres som reaktion på vækstfaktorer og stress betingelser [14]. Hog1 er funktionel homolog af pattedyr p38 MAPK og er især aktiveres som reaktion på osmotisk stress [15].
Undersøgelserne er rapporteret heri, gøre brug af den genetiske model systemet
S
.
cerevisiae
mod decifrere virkningerne af rohitukin på alle vigtige proces med cellulær kommunikation medieret af MAP-kinase pathway, dermed påvirke cellulær overlevelse og død via apoptose. Undersøgelsen undersøger også virkningen af rohitukin på apoptose inden human lungecancer-cellelinje og udforsker de mulige mekanismer, der er involveret via undersøgelser om vigtige modulatorer af processen.
Materialer og metoder
Udvinding af rohitukin
rohitukin blev isoleret fra stammen af
Dysoxylum binectariferum
som tidligere [16] beskrevet. Kort fortalt blev lufttørret stilk bark af planten ekstraheres med 95% ethanol og derefter koncentreret ved reduceret tryk. Det er yderligere fraktioneret i fire fraktioner (chloroform, opløselig n-butanol, n-hexan og uopløseligt n-butanol fraktion). Fra chloroform fraktion, en kendt alkaloid rohitukin {5,7-dihydroxy-2-methyl-8- [4- (3-hydroxy-1-methyl) piperidinyl] -4H-1-benzopyran-4-on)} blev isoleret ved gentagen søjlekromatografi over silicagel og yderligere oprensning ved HPLCLC- 20AD anvendelse af methanol opløsningsmiddel 55:45 volumen /volumen, strømningshastighed 1,0 ml /min. Karakteriseringen af forbindelse blev udført ved anvendelse IR, NMR, masse, derivatisering og sammenligning med tilgængelige litteratur. Renheden af rohitukin var 99,6% og udbyttet var 1%.
Gær kultur og vedligeholdelse
I nærværende undersøgelse, vildtypestammen BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) og knockout stamme af
Slt2
Hog1
gen (gave fra Dr. A. Chakrabarti og Dr. RC Meena fra Defence Institut for Fysiologi og allierede Sciences, DRDO, Indien) var ansat. Gærcellerne blev dyrket i YPD medium (1% gærekstrakt, 2% bactopepton, 2% glucose) som pr tidligere beskrevet [17].
Bestemmelse af mindste inhiberende koncentration
Minimum metode inhiberende koncentration (MIC) af lægemiddel blev bestemt både spektrofotometrisk (ved at måle OD ved 600 nm under anvendelse af flere brønde mikropladelæser: Multi Skan, Thermo Scientific) og visuelt. Rohitukin blev opløst i dimethylsulfoxid. MIC for rohitukin blev bestemt ved at afbilde O.D. ved 600 nm versus koncentrationer af lægemiddel (20 ug /ml til 100 ug /ml) [18]. Koncentrationen ved MIC af lægemidlet blev anvendt i alle forsøg.
Evaluering af vækstinhibering ved spotting assay
Efter lægemiddelbehandling vækstinhibering af gærceller blev vurderet ved spotting assay. Celler blev dyrket på standard gærekstrakt-pepton-dextrose (YPD) medier. For spotting assays blev 5-gange serielle fortyndinger i YPD medium fremstillet ud fra eksponentielt voksende kultur af de forskellige stammer. 2 pi af hver fortynding blev derefter spottet på YPD plade i fravær og nærvær af lægemiddel [19] .De vækst forskelle blev registreret efter inkubering af pladerne i 24 timer ved 30 ° C.
Påvisning af reaktive oxygenarter (ROS ) i spirende gær
påvisning af reaktive ilt arter blev udført ved at ansætte 2 ‘7’ Dichlorofluoresceindiacetate (H2-DCF-dA;. Cat No.-D399, Invitrogen) farvning som tidligere beskrevet med nogle ændringer [ ,,,0],20]. Kort fortalt blev niveauer af ROS målt efter 24 timers narkotikabehandling ved at tilføje 0,5 uM af H2-DCF-DA til celler i 15 min i mørke. Celler blev vasket tre gange med 1X PBS. Fluorescens mikroskopi blev udført ved anvendelse af et Zeiss Axioplan-2 mikroskop under anvendelse af en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 520 nm. ROS produktion blev kvantificeret ved hjælp af billede J software (Billede J, National Institutes of Health, og Bethesda, MD). I alt 50 celler fra hver gruppe blev kvantificeret for fluorescensintensitet og statistisk signifikans blev beregnet i forhold til ubehandlede kontrolgruppe.
Estimering af mitokondrie indhold ansætte MitoTracker Deep Red farvning
For at kontrollere effekten af lægemiddel på mitokondrie indhold blev Mito Tracker Deep Red-farvning (kat. nr-22426, Invitrogen) udført som beskrevet tidligere med nogle modifikationer [20]. Kort fortalt blev 100 pi gærceller inkuberet med 100 nM Mito Tracker plet i 50 min ved 30 ° C i mørke efterfulgt af tre gange vask i 1X PBS. Billeddannelse af celler blev udført ved anvendelse af fluorescens mikroskop med en excitationsbølgelængde på 637 nm og en emissionsbølgelængde på 660 nm. Fluorescens intensiteten af mitokondrie indhold blev kvantificeret ved hjælp af Image-J-software.
Assay for apoptotisk celledød ved hjælp Acridin Orange (AO) farvning
Acridin Orange farvning blev gjort for at kontrollere induktion af tidlig fase apoptose . Acridinorange (Hi-medie- 116) blev opløst i PBS (pH = 7). En 100 pi volumen af gærceller blev farvet med 1 pi på 2,5 mg /ml AO at få arbejdskoncentration på 25 ug /ml. Farvning blev udført i 30 minutter i mørke, og cellerne blev vasket med PBS [21]. Billeddannelse af farvede celler blev udført under anvendelse af fluorescens mikroskop med en excitationsbølgelængde på 502 nm og en emissionsbølgelængde på 520 nm. Fluorescensintensitet af farvede celler blev kvantificeret af Image J software.
Assay for at studere DNA fragmentation
DNA fragmentering blev bestemt ved Nuc Blå levende celler Stain (R37605 Life Technology Corporation) i overensstemmelse med producentens instruktioner . Billeddannelse af farvede celler blev udført ved fluorescens mikroskop med en excitationsbølgelængde på 352 nm og en emissionsbølgelængde på 460 nm og fluorescensintensiteten af farvede celler blev kvantificeret af Image J software.
semikvantitativ Revers transkription-PCR for analyse af mRNA-niveauer af
Slt2
Hog1
gen i nærvær af rohitukin
Totalt RNA blev ekstraheret og revers transkriberet under anvendelse Vend tilbage Aid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas Life Sciences, Cat- K1622). cDNA blev amplificeret under anvendelse af specifikke primere, der er opført i tabel 1 og PCR-produkter blev separeret på 1,5% agarosegel og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning.
Protein-ligand-interaktion, der anvender beregningsværktøjer
3-dimensional (3D) struktur p38 og ERK5 bruges til docking undersøgelse blev hentet fra Protein databank med FBF iD’er: 1WFC og 4IC8 hhv. Strukturen af ligand (rohitukin) (CID: 13.422.573) blev åbnet fra ‘pubchem sammensatte «. Brug af Autodock værktøjer Essential brintatomer, Kollman united atom typen afgifter, og solvatisering parametre blev tilføjet. Affinity (gitter) kort over 60 × 60 × 60 Å gitterpunkter og 0,375 Å afstand blev genereret ved hjælp af Autogrid program til at målrette gitter koordinater i nærhed med det aktive site af mål. Følgelig er de værdier af x, y og z-koordinater, der anvendes til at målrette Hog1 og ERK5 aktive site var 18,783, 35,698, 30,394 for Hog1 og 15,928, -17,057, 1,101 for ERK5 henholdsvis. Docking simulationer blev udført ved hjælp af Lamarcks teorier genetiske algoritme (LGA) og Solis Væder lokal søgemetode. Ti forskellige kørsler blev udført for hver docking. De endelige tal blev genereret med hjælp fra Discovery Studio Visualizer (Accelrys).
Cell Culture
A549-celler (human lungecancer cellelinie) blev opnået fra Nationalt Center for Cell Sciences (NCC’erne) Pune, Indien, og dyrket i DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle Media) F-12 (1: 1) (HiMedia AL187A) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 0,2% natriumbicarbonat og 1% antibiotisk og antimykotisk opløsning. Kulturer blev opretholdt ved 37 ° C og 5% CO2 og 95% fugtig atmosfære.
MTT assay
MTT (HiMedia-TC191) Analysen er baseret på reduktion af MTT af mitokondrie-dehydrogenase til en lilla formazanprodukt, giver en indikation af mitokondrie integritet, hvilket tolkes som vurdering af levedygtighed procent celle [22]. Kort beskrevet blev celler podet i 96-brønds vævskulturplader (10
4 celler /brønd) i komplet DMEM F-12-medium, efterfulgt af inkubation i 5% CO2, 95% atmosfære i 24 timer ved 37 ° C. Efter 24 timer eksponering af lægemiddel (10 uM-60 uM), MTT (5 mg /ml stamopløsning i PBS) blev tilsat (10 ml /brønd i 100 ml cellesuspension), og pladerne blev inkuberet i 4 timer. Efter inkubering blev reaktionsblandingen omhyggeligt taget ud og 200 pi dimethylsulfoxid (DMSO) blev tilsat til hver brønd, indholdet blev blandet godt ved pipettering op og ned adskillige gange. Pladerne blev holdt på rocker ryster i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter aflæst ved 550 nm under anvendelse af flere brønde mikropladelæser (Multi Skan, Thermo Scientific). Ubehandlede celler blev kørt under identiske betingelser og tjente som basal kontrol. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange og standardafvigelser blev afledt fra tre uafhængige forsøg.
Bestemmelse af reaktive oxygenarter (ROS) i lungecancerceller
ROS-generering blev estimeret ved anvendelse af 2 ‘, 7’ -diclorodihydrofluorescein di-acetat (H2-DCF-dA;. Cat No.-D399, Invitrogen) som beskrevet tidligere [23]. Kort fortalt celler podet i sort plade med 96 brønde ved en densitet på 10
4 celler /brønd blev inkuberet med 1 mM H2-DCF-DA; i 30 minutter ved 37 ° C efterfulgt af inkubation med forskellige koncentrationer af lægemiddel i 24 timer. Målingen af ROS blev udført i løbet af perioden behandling ved 485 nm excitation og 535 nm emissionsbølgelængder. ROS generation blev også bekræftet ved fluorescens mikrograf af cellulære ROS. Kort beskrevet blev celler udpladet i 48-brønds vævsdyrkningsplade og behandlet med 1 mM H2-DCF-DA; i 30 minutter efterfulgt af inkubation med forskellige koncentrationer af rohitukin i 24 timer ved 37 ° C. Fluorescensbilleder blev taget med et Zeiss Axioplan-2 mikroskop under anvendelse af FITC filter under 20X objektiv.
Isolering af samlet cellulært protein fra A549-celler
rohitukin behandlede og ubehandlede celler blev pelleteret, vasket med kold PBS og lyseret i RIPA lysebuffer indeholdende 1 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM NaF, 1 mM Na
3VO4, 1 mM PMSF og 1 ug /ml leupeptin [24]. Cellelysatet blev forsigtigt omhvirvlet i 30 sekunder efter 1 times inkubering i lysepuffer. Supernatanten blev opsamlet ved centrifugering ved 14.000 x g i 15 minutter og opbevaret i portioner ved -20 ° C. Proteinindhold blev kvantificeret under anvendelse af Bradford protein assay.
Western blot analyse Afsløring Apoptose-relaterede proteiner
Cellelysater blev denatureret og tyve mikrogram af proteinet blev separeret på 12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Det blev elektro-overført til PVDF-membran. Membranerne blev blokeret ved stuetemperatur med 5% skummetmælk i Tris-bufret saltvand (TBS) med 0,05% Tween-20 (TBS-T) i 2 timer. Efter vask med TBS-T membraner blev inkuberet med de primære antistoffer mod p53 (1: 3000), caspase9 (1: 3000), Bcl-2 (1: 5000) og β-actin (1: 4000) for natten over ved 4 ° C. Efter vask blev membranen inkuberet med HRP-konjugeret sekundært antistof (anti-kanin eller anti-mus, 1: 10000, Invitrogen, USA) ved stuetemperatur i 1 time. Western blot-bånd blev påvist under anvendelse kemiluminescerende substrat (Millipore) ved anvendelse Chemidoc (GE). β-actin blev anvendt som intern kontrol for lige lastning og normalisering af protein. Protein Ladder (3B BlackBio Biotech-3B75) (3.5-245kDa) blev anvendt til at bestemme molekylvægten af proteinbåndene. Densitometri af båndene opnåede blev udført af NIH softwarebillede J-version 1.41 (USA).
Statistisk analyse
Alle resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM Statistisk signifikans mellem forskellige grupper blev udført under anvendelse af Students t-test ved anvendelse af Graph Pad prisme 5-softwaren. For
in vitro
undersøgelsens data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. og statistisk signifikans af resultaterne blev bestemt ved hjælp af en-vejs ANOVA af Tukeys multipel sammenligning test.
Resultater og Diskussion
ΔSlt2 og ΔHog1 stammer er overfølsomme over for rohitukin behandling
I denne undersøgelse, vi bestemt cytotoksicitet rohitukin i spirende gær og også undersøge, om MAP kinase veje er involveret i rohitukin celledød, så vi bestemt effekten af rohitukin på cellen levedygtighed ΔSlt2 og ΔHog1 stammer. Rohitukin viser cytotoksicitet mod alle typer af gærstammer. MIC
50 for rohitukin blev bestemt ved at afbilde O.D. ved 600 nm versus koncentrationer af lægemiddel. MIC
50 værdi for WT fandtes at være 80 pg /ml og for begge gen-knock-out-stammer viste sig at være 60 ug /ml. Alle eksperimenter blev udført ved dosis under MIC
50 værdi (40 pg /ml). Fig 1 viser, at rohitukin udøver cytotoksiske virkninger på gær. Selv om koncentrationen af rohitukin som dræber ca. 50% af gærceller er højere end IC
50 værdier rapporteret for cancerceller in vitro [25] dette resultat er ikke overraskende i betragtning, at gær ofte vise højere niveauer af resistens over for antineoplastiske midler [ ,,,0],26] det er sandsynligt, at tilstedeværelsen af gær cellevæg kan være obstruktion af lægemiddelindgang i celle og masser af eksport transportør, der vil forstyrre optagelsen af lægemidlet inde i cellen og gærceller er også meget effektiv til at reducere intracellulære koncentration af giftige små molekyler ved hjælp af et stort antal transportproteiner [27].
(a) gærceller levedygtighed ved forskellige koncentrationer af rohitukin efter 24 timers narkotikabehandling, 5-fold seriefortyndinger fra eksponentielt voksende kulturer af WT, ΔSlt2 og ΔHog1 stammer blev plettet på YPD-medium indeholdende 40 ug /ml, 80 ug /ml og 100 ug /ml af lægemiddel. (B) Procentdelen af overlevende celler i forhold til ubehandlede kontroller.
Resultaterne viste, at gen-knockout stammer var mere sensitive over for lægemidlet sammenlignet med WT-stammen på samme MIC (40 pg /ml) som angivet ved densitet af pletter i spotting assay for cellelevedygtighed (figur 1A) og ved OD ved 600 nm (fig 1B) Resultat af spotting assay bekræftede, at gærcellerne når behandlet med rohitukin mistede cellelevedygtighed i dosisafhængig måde. I tilfælde af WT celler kontrolplet blev scoret som 0, 40 pg /ml rohitukin behandlede celler plet blev mærket som 1, blev celler scoret som 2 ved 80 pg /ml lægemiddel og ved 100 ug /ml celler spot scoret som 3 efter 24 timers medicinsk behandling. For begge typer af gen-knockouts (Δslt2, Δhog1) stamme kontrolplet blev scoret som 0, 40 pg /ml lægemiddelbehandlede bedømte celler som 2, 80 pg /ml lægemiddelbehandlede celler scoret som 3 og 100 ug /ml lægemiddelbehandlede celler scoret som 4 efter 24 timers medicinsk behandling. ΔSlt2 stammen var overfølsom over for forskellige genotoksiske midler, der har forskellig virkemåde, herunder methylmetanosulfonate, UV-stråling og phleomycin [28]. Slt2 aktivering efter induktion af en enkelt DSB (dobbelt-strenget pause) i GAL1: HO-stammen, der har en specifik virkning på integriteten af DNA, der viser en ægte rolle for Slt2 i reaktion på genotoksisk stress [29]. Derfor bliver disse gener aktiveres i nærværelse af lægemiddel i WT-celler så det kunne være muligt, at ΔSlt2 og ΔHog1 stammer udviste overfølsomhed over for lægemidlet [30].
rohitukin udløser celledød ved at inducere oxidativt stress og reducere mitokondriel indhold i ΔSlt2 og ΔHog1 stammer
ROS-produktion blev målt til at analysere betydningen af ROS i gær celledød medieret af rohitukin. Vi fandt, at rohitukin inducerede betydelig mængde af ROS efter 24 timers lægemiddelbehandling i WT og i gen-knockout-stammer (Fig 2A). Kvantificering af fluorescensintensitet af H2-DCF-DA-farvning (Fig 2B) viste også, at rohitukin behandlet gærceller produceres relativt forøgede niveauer af ROS sammenlignet med ubehandlede celler, øge være 1,3 (P 0,001), 2,0 (P 0,001) og 1,7 (P 0,001) fold for WT, ΔSlt2 og ΔHog1 stammer henholdsvis efter rohitukin behandling sammenlignet med ubehandlede kontrolceller. Men ΔSlt2 og ΔHog1 stammer produceret mere ROS i forhold til WT celler efter behandling og øge være 1,4 (P 0,001) og 1,2 (P 0,001) fold for ΔSlt2 og ΔHog1 stammer henholdsvis i forhold til WT efter lægemiddelbehandling, hvilket yderligere styrker hypersensitivitet af begge mutantstammer til lægemiddel. Denne uoverensstemmelse kan skyldes fravær af MAPK, som vides at blive aktiveret af oxidativ stress. Derudover MAPK deficiente gærceller akkumulerer ROS i højere grad end WT celler under stationære fase [31]. MAP kinase veje påvirkes ikke kun af receptor ligand interaktioner, men også af forskellige stressfaktorer som oxidativt stress fremkaldt potentiel aktivering af MAPK veje. Almindeligvis steg ROS produktion i cellerne forårsager aktivering af MAPK’er men de mekanismer, hvorved ROS kan aktivere disse kinaser er uklare [32]. Disse mutanter kan være nedsat i autophagy vej, som er nødvendig for at forhindre overdreven ROS ophobning. Manglende evne til at forøge ekspressionen af respiratoriske kæde komponenter og ROS-fjernere sandsynligvis fører til ophobning af ROS i autofagi-defekte celler.
S
.
cerevisiae
Hog1 MAPK aktiveres som reaktion på høje osmolaritet og er nødvendig for celle overlevelse under disse betingelser [33]. Som svar på flere spændinger, Hog1p bliver phosphoryleret og translokerer til kernen. Hog1 null mutanter viste sig at være overfølsomme over for disse stress betingelser, som fører til Hog1p aktivering, især til ekstracellulære oxidationsmidler [34].
(a) DCFDA farvning (b) Grafisk fremstilling af Relativ dannelse af reaktive ilt arter (ROS) målt ved H2DCFDA farvning i WT og gen-knockout stammer af gær som kvantificeres ved hjælp af billede J software *** p 0,001 (c) Mitotracker Deep Red farvning (d) Grafisk repræsentation fluorescensintensitet af mitokondrie indhold af den spirende gær som kvantificeres ved hjælp af billede J software *** p. . 0.001
Vi har også kontrolleret hvorvidt rohitukin eksponering påvirker mitokondrisk indhold. Vi observerede, at mitokondriel indhold faldt i højere grad i ΔSlt2 og ΔHog1 stamme efter 24 timers rohitukin behandling men WT celler viste stigning i mitochondrier indhold efter lægemiddelbehandling (fig 2C). Kvantificering af fluorescensintensitet af mitokondrie indhold (Fig 2D) viste, at rohitukin behandlet WT-celler udviser en 1,6 (P 0,001) fold stigning henviser rohitukin behandlet ΔSlt2 og ΔHog1 stammer udviser 1,2 (P 0,001) og 2,0 (P 0,001) fold reduktion henholdsvis sammenlignet med deres ubehandlede kontrol. viste imidlertid, ΔSlt2 2.3 (P 0,001) og ΔHog1 stammen udstillet 2,2 (P 0,001) fold reduktion i forhold til WT i tilstedeværelse af narkotika
mitokondrier spiller også en meget vigtig rolle i reguleringen af mange mekanismer. kontrollerende celle overlevelse og død [35]. Ændringer i mitokondrier er relateret til aldring, nedsat syntese af mitokondrie proteiner og nedsat aktivitet af oxidative enzymer forårsager fald i mitokondrie ATP syntese [36]. MAP kinase pathways er involveret i den indre apoptose i nærværelse af isoorientin i humane hepatoblastoma cancerceller [37]. Flavopiridol (rohitukin derivat) forårsager celledød ved fald i mitochondriemembranpotential i humane leukæmiceller [38]. Flavopiridol forårsager også STI571 (Bcr /Abl kinase inhibitor) induceret apoptose og beskadigelse af mitokondrier og apoptose i BCR-ABL-positive humane leukæmiceller [39]. Derfor MAPK mutanter viser den øgede produktion af ROS, som måske sandsynlige årsag fører til mitokondrier dysfunktion.
rohitukin forårsager induktion af tidlig fase apoptose og DNA-skader i gær
Data fra AO farvning viste, at rohitukin forårsager induktion af apoptose i gen-knockout-stammer i sammenligning med WT-stamme efter 24 timers lægemiddelbehandling (fig 3A). Kvantificering af fluorescensintensitet af AO-farvning (Fig 3B) viste, at WT, ΔSlt2 og ΔHog1 pletter af gær udviser en 1,3 (p 0,001), 2,0 (p 0,001) og 1,7 (p 0,001) gange forøgelse henholdsvis efter lægemiddelbehandling som sammenlignet med deres ubehandlede kontrol. Imidlertid viste, ΔSlt2 stamme 1,7 (p 0,001) og ΔHog1 stamme udviste 1,2 (p 0,001). Fold stigning sammenlignet med WT-stammen, når de behandles med rohitukin
(a) A.O. farvning (b) Grafisk repræsentation fluorescensintensitet af apoptotisk død af Gærceller som kvantificeres ved hjælp af billede J software *** p 0,001 (c) DNA-skade afsløret af Nuc Blå levende celler Stain (d) Grafisk repræsentation for fluorescensintensitet af nukleinsyre af gærcellerne, som kvantificeret ved anvendelse Billede J software *** p 0,001.
Vi har også observeret DNA-fragmentering efter 24 timers medicinsk behandling ved MIC ved NucBlue Live-Cell Stain til DNA. Resultat af DNA-farvning (Fig 3C) viste tydeligt DNA fragmentation i WT og i begge typer af gen-knockout-stammer efter lægemiddelbehandling indikerer en apoptotisk fænotype. Vi kvantificerede billeder til fluorescensintensitet af DNA-farvning (Fig 3D). Der var 1,5 (p 0,001), 3,0 (p 0,001) og 3,9 (p 0,001) fold stigning i rohitukin behandlet WT, ΔSlt2 og ΔHog1 stamme henholdsvis sammenlignet med ubehandlet kontrol. Imidlertid viste, ΔSlt2 1,1 (p 0,001) og ΔHog1 stamme udviste 1,3 (p 0,001) fold stigning sammenlignet med rohitukin behandlede WT celler
DNA-fragmentering, et kendetegn for apoptose [40] blev observeret i. alle typer af gærstammer efter lægemiddelbehandling som set af DAPI-farvning. Valproat inducerer apoptose ved ROS generation og DNA-fragmentering uafhængig af Yca1p ved koncentrationer, der mildt påvirke udbredelsen af gær [41].
rohitukin interaktion påvirker ekspressionen af
Slt2
og
Hog1
gen i vildtypestammen
mRNA niveauer af
Slt2
Hog1
blev fundet til at være 3,7 og 2,8 gange forøget i henholdsvis WT stammen behandlet med rohitukin sammenlignet til den for kontrolgruppen (fig 4A). Men mRNA udtryk for
Slt2
gen i ΔHog1 stamme og udtryk for
Hog1
gen i ΔSlt2 stammen forblev un-påvirket efter rohitukin behandling. Figur 4B viser de fold ændringer i mRNA-niveauer inden for forskellige behandlingsgrupper normaliseret mod denne af kontrol. Den selektive stigning på Slt2 og Hog1 med vilde betingelser type og ikke i de udskæringer enten gen kan være et resultat af cross-samtaler mellem forskellige MAPK veje, som er meget almindelige [42]. Den overekspression af
Hog1
gen efter rohitukin behandling kan være afhængig af tilstedeværelsen af
Slt2
gen eller vice-versa.
Zymolase aktiverer både MAPK’er og Slt2 aktivering afhænger af Sho1 gren af HOG-vejen. Begge MAPK veje er afgørende for cellens overlevelse i tilstedeværelse af stress, fordi mutante stammer mangelfuld i forskellige komponenter i begge veje er overfølsomme over for zymolyase [43]. Således kan det være nødvendigt en sekventiel aktivering af to MAPK veje for cellulær tilpasning til stress tilstand og cellevæg skader efter rohitukin behandling.
Fra tidligere undersøgelser er det kendt, at Hydroxyurea behandling øger phosphorylering af Slt2 MAP kinase [28 ]. Slt2 er ansvarlig for cellevæggen integritet og aktiveres af cellevæggen skade, så det kan være den mulige årsag til overfølsomhed af slt2 mutant på lægemiddelbehandling. Nylige undersøgelser har impliceret rolle Hog1 MAPK ved mediering tolerance over for en række forskellige stressbetingelser herunder osmotisk, oxidativ, varme, arsen og citronsyre stress [44]. 0,01, ***
P
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.