PLoS ONE: Kræft Associated Aberrant Protein O-Glycosylering kan ændre Antigen Forarbejdning og Immune Response

Abstrakt

Afvigende glycosylering af muciner og andre ekstracellulære proteiner er en vigtig begivenhed i carcinogenese og de resulterende kræft forbundet glykaner er blevet foreslået som mål i cancer immunterapi. Vi vurderede rolle O-bundet GalNAc glycosylering på antigen optagelse, behandling, og præsentation på MHC klasse I og II-molekyler. Virkningen af ​​GaINAc O-glycosylering blev overvåget med en model baseret på ovalbumin (OVA) -MUC1 fusionspeptider (+/- glycosylering) fyldt på dendritiske celler co-dyrket med IL-2-secernerende OVA-peptid-specifikke T-celle-hybridomer. At evaluere

in vivo

svar på en cancer relateret tumorantigen, Balb /c eller B6.Cg (CB) -TG (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (HLA-A2 transgene) mus blev immuniseret med et ikke-glycosyleret eller GalNAc-glycosylerede MUC1-afledt peptid efterfulgt af sammenligning af T-celleproliferation, IFN-γ-frigivelse og antistofinduktion. GaINAc-glycosylering fremmes præsentation af OVA-MUC1 fusionspeptider ved MHC klasse II-molekyler og MUC1 antigen fremkaldte specifik Ab produktion og T-celleproliferation i både Balb /c og HLA-A2 transgene mus. I modsætning hertil GaINAc-glycosylering inhiberede præsentationen af ​​OVA-MUC1 fusionspeptider ved MHC klasse I og afskaffes MUC1 specifikke CD8 + T celle responser i HLA-A2 transgene mus. GalNAc glykosylering af MUC1 antigen letter derfor optagelse, MHC klasse II præsentation, og antistofrespons men kan blokere antigenet præsentation til CD8 + T-celler

Henvisning:. Madsen CB, Petersen C, Lavrsen K, Harndahl M, Buus S , Clausen H, et al. (2012) Cancer Associated Aberrant Protein O-Glycosylering kan ændre Antigen Forarbejdning og immunrespons. PLoS ONE 7 (11): e50139. doi: 10,1371 /journal.pone.0050139

Redaktør: Isaac Yang, UCLA, USA

Modtaget: May 1, 2012; Accepteret: 17 oktober 2012; Udgivet: 26 november, 2012 |

Copyright: © 2012 Madsen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af Novo Nordisk Fonden, dansk Sundhedsvidenskabelige Forskningsråd, dansk Cancer Research Foundation, de Agnes og Poul Friis Fond, den danske Kræftens Bekæmpelse, Københavns Universitet (Program of Excellence), EU-FP7, danske agentur for Videnskab og Teknologi og Innovation (FTP). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancervacciner lover godt for langvarig terapeutisk effekt [1]. Aktuelle eksperimentel cancervacciner sigter primært at fremkalde cellulær immunitet ved induktion af specifikke CD8 + T-celler [2] – [5]. Men flere og flere tegn viser, at værdien af ​​antistoffer i udryddelse tumor [6], [7]. Der er derfor en stigende interesse i at designe vacciner, som kan aktivere både CD4 + og CD8 + T-celler og derved samtidig fremkalde humoral og cellulær immunitet cancer [8]. Ændrede proteiner præsenteres på cancerceller er vigtige tumorantigener, der kan målrettes af vacciner og terapeutiske antistoffer. De fleste celleoverfladeproteiner er glycosylerede, og malign transformation af celler er altid ledsaget af ændringer af posttranslationelle modifikationer af proteiner [9]. Aberrant mucin-typen O-glycosylering repræsenterer en af ​​de mest rigelige posttranslationel cancer associerede ændringer skaber et bredt sæt af molekylære strukturer, som findes på overfladen af ​​cancerceller, men ikke på normale celler [9], [10]. Som et resultat, den specifikke mønster af cancer associeret korte glykanstrukturer på cancerassocierede proteiner producerer hidtil ukendte glycopeptid epitoper, der kan målrettes af immunsystemet [11], [12].

cancerassocieret glycaner påvirker kræft immunitet på flere måder. De afvigende glykaner er immunogen af ​​sig selv, og afkortede O-glycaner (TN: GalNAc-S /T; STN: NeuAcα2,6GalNAc-S /T, og T: Galβ1,3 GalNAc-S /T) er anerkendt som pan-carcinoma antigener, som cirkulerende antistoffer findes ved forhøjede niveauer i cancerpatienter. Afvigende glycaner kan også fremkalde nye epitoper på proteiner ved at forårsage konformationel ændring eller ved oprettelsen af ​​nye O-glycopeptid epitoper [13], [14]. Desuden kan cancerassocierede glycaner indgå i udformningen af ​​immunogene epitoper, som kan inducere

in vivo

anti-tumor immunrespons [15]. Et vigtigt grundlag for glycan induceret immunitet er, at afvigende glycaner kan binde lectin receptorer. For eksempel, makrofag galactose bindende lektin (MGL) -mediates optagelse af specifikke O-glycoproteiner i dendritiske celler [10], [16]. Faktisk dendritiske celler er de mest potente antigenpræsenterende celler for priming af naive CD8 + og CD4 + T-celler. De bærer en række kulhydrat receptorer af C-typen lectin familien (gennemgået i [17]) og har en unik evne til cross-tilstedeværende ekstracellulære antigener til CD8 + T-celler [18]. Den selektive optagelse af GalNAc-glycosyleret antigener (Tn-antigener) ved den fælles human og murin dendritisk celle (DC) C-type lectin MGL, [19], [20] gør det muligt at fremkalde kræft specifik glycopeptidforbindelser antistoffer i mus og mennesker gennem induktion af en CD4 + Th-celler [11], [13], [14], [21]. Sådan Tn-glycopeptid specifikke antistoffer medierer antistofafhængig cytotoksicitet [11], [12], [22], [23], og forekomsten af ​​naturlige glycopeptid specifikke antistoffer i cancerpatienter er foreslået at være forbundet med øget overlevelse [21]. I modsætning hertil meget få CD8 + T-celler rettet mod glycopeptidforbindelserne epitoper af ekstracellulære tumorantigener (f.eks mucin 1 (MUC1)) er blevet beskrevet [24], [25].

cancer associeret glycoprotein MUC1 er en vigtig model molekyle i cancer immunterapi og afvigende glycosyleres i de fleste adenocarcinomer [26]. Det ekstracellulære domæne af MUC1 består af 20-120 tandemgentagelser (VNTR), der hver indeholder 20 aminosyrer med 5 potentielle O-glycosyleringssteder [27]. Immunisering af B6.Cg (CB) -TG (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (HLA-A2 transgene mus) [28] og chimpanser [29] med ikke-glycosylerede MUC1-antigener har fremkaldt MUC1 peptidspecifik CD4 + og CD8 + T-cellereaktioner og flere CD8 + T-celleepitoper er blevet identificeret inden for de ekstracellulære og intracellulære domæner af MUC1 [28], [30] – [33]. I MUC1 transgene mus reaktionen på ikke-glycosyleret MUC1 peptid baserede vacciner har imidlertid været meget lav med små eller uopdaget CD4 + og CD8 + T-cellereaktioner [34], [35]. Ikke-glycosyleret MUC1 peptid konjugeret til den immunogene glycokonjugat mannan fremkaldte kraftige immunresponser herunder CD8 + T-celler [31]. Hos mennesker er de ikke-glycosylerede MUC1 peptidvacciner primært fremkaldt humorale og CD4 + T celle responser [36] – [38], mens virale og DC-baserede vacciner har også genereret cytotoksiske T-lymfocyt (CTL) reaktioner [39] – [44] . Induktionen af ​​CD8 + -T-celler blev kun observeret i få patienter eller efter flere runder af restimulering

in vitro

[39] – [44], men adskillige af vaccinerne har vist virkning, omend begrænsede [38 ] – [41], [44] – [57]. To virale vacciner, der udtrykker MUC1, enten i kombination med IL-2 (TG4010) [41], [48] – [51] eller i kombination med carcinoembryonisk antigen (PANVAC) [52], har vist klinisk virkning hos patienter med ikke små celle lunge og pancreascancer [39] – [41], [48] – [52]. Desuden har klinisk effekt også blevet demonstreret med den liposomale vaccine (BLP25) bestående af en 25-mer ikke-glycosyleret peptid fra MUC1 tandemgentagelsesregionen [53] – [57]. Interessant nok i et lille klinisk undersøgelse i det tidlige stadie brystcancerpatienter immuniseret med mannan-MUC1, vaccinen inducerede både humorale og T-celle responser til ikke-glycosyleret MUC1 og elimineret fornyet sygdom [45].

Mest tidligere vacciner har målrettet ikke-glykosyleret MUC1, selv om dette ikke kan være den mest kræft specifikke mål. Målretning cancer associeret glycopeptid epitoper i MUC1 såsom GaINAc-MUC1 [11], [12], [58] ville være gunstige, men biosyntese af MUC1 glycopeptid epitoper udtrykkes af tumorer er blevet hæmmet af mangel på relevante teknologier og høje omkostninger. Således er det i øjeblikket ikke klart, hvordan glycaner vil påvirke optagelsen, præsentation, indregning, og induktion af immunreaktioner på CD8 + T-celle epitoper. Selv om tilstedeværelsen af ​​glycaner kan have en positiv effekt på optagelsen af ​​glykosylerede antigener [19], [20], [59], glycaner kan kompromittere indtræden i immuno-proteasomet [60], proteasomalaktivitet spaltning, TAP-medieret translokation, og peptid indlades MHC klasse i molekyler [60], [61].

i denne undersøgelse har vi undersøgt konsekvensen af ​​MUC1 GaINAc-glycosylering på kendte CD8 + og CD4 + T-celle aktiverende antigener. Vi tog fordel af ovalbumin modelsystem under anvendelse OVA-MUC1 fusionspeptider indeholdende den immunodominante MHC klasse I (SIINFEKL) og MHC klasse II (ISQAVHAAHAEINEAGR) æg epitoper som udlæsning for antigen optagelse og forarbejdning. Epitoperne blev flankeret af GalNAc glycosylerede eller ikke-glycosylerede MUC1 afledte peptidsekvenser. Derudover undersøgte vi effekten af ​​GalNAc glycosylering af en fysiologisk tumorassocieret MUC1 glycopeptid vides at inducere CD4 + og CD8 + T-cellereaktioner. Dette peptid (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV) har tæt sekvenshomologi med tandemgentagelse af MUC1, men indeholder en HLA-A2-epitop mangler i tandemgentagelse. Vi præsenterer data tyder på, at GalNAc rester støtte antigenoptagelse og MHC klasse II præsentation til generering af en potent cancer-specifik antistofrespons, og blokere præsentation for CD8 + T-celler.

Resultater Salg

GalNAc- glycosylering Forbedrer CD4 + T-cellereaktioner

Vi undersøgte først rolle GaINAc-glycosylering på peptidantigen forarbejdning og peptidpræsentation på MHC klasse II-molekyler (figur 1). Den potente I-A

b bindende OVA-peptid blev fusioneret til et MUC1 afledte sekvens med og uden GaINAc-glycosylering (tabel 1) og blev fyldt på DC’er, som blev co-dyrket med ovalbumin peptid /MHC klasse II-komplekset specifikke T-celle-hybridomer. DC’er lastet med glycopeptider øget OVA specifikke CD4 + T-celle-hybridom respons på OVA afledt peptid sammenlignet med ikke-glycosyleret peptid, uanset hvor OVA-epitopen var placeret i peptidsekvensen (figur 1B). Peptider indeholdende fire GalNAc-rester inducerede en højere reaktion end peptider indeholdende to GalNAc-rester [62], [63] (figur 1B). Selv meget lave koncentrationer (30 nM) på glycopeptider stimulerede CD4 + T-celle-hybridoma, mens lave koncentrationer af det ikke-glycosylerede peptid inducerede ingen respons (data ikke vist).

A) O-glycan syntese overblik. B) IL-2-produktion fra OVA specifik CD4 + T-celle-hybridom (BO.97.10) co-dyrket med knoglemarv afledte DC’er pulset med to peptidvarianter med og uden 2 og 4 glycan rester (GalNAc). Fuld længde OVA anvendt som en positiv kontrol. Individuelt dyrkede T-celler og DCS havde en OD-værdien lig med baggrunden.

GaINAc Glycosylering Hæmmer Behandling og præsentation af et MHC klasse I Binding peptid

in vitro

den samme model blev anvendt til at undersøge indflydelsen af ​​GalNAc glycosylering på MHC klasse i præsentation.

In vitro

genereres, samt oprensede CD11c + milt DC’er, blev fyldt med GalNAc glycosylerede eller ikke-glycosylerede MUC1-SIINFEKL fusionspeptider (tabel 1). I modsætning til resultaterne opnået med MHC klasse II præsentation, GaINAc glycosylering af MUC1-SIINFEKL resulterede i lavere aktivering af SIINFEKL /H2-K

b specifikke T-celle-hybridomaer sammenlignet med ikke-glycosylerede peptider uanset oprindelse DC’er (Figur 2A-B). Vi næste testede hvordan placeringen af ​​glycan rester i forhold til MHC klasse I bindende epitop påvirkede CD8 + T-celle respons. DC’er blev stimuleret under anvendelse af fusionspeptider med SIINFEKL enten flankeret af glycosyleringssites eller lokaliseret til den C-terminale ende af peptidet. Fusionspeptider med terminal SIINFEKL havde en forøget T-celle hybridom respons sammenlignet med fusionspeptid med SIINFEKL lokaliseret inde i MUC1 gentagelse uanset om peptiderne blev glycosyleret eller ej. Flowcytometrisk analyse af SIINFEKL /H2-K

b kompleks på DC’er efter peptid behandling bekræftede lavere MHC klasse I præsentation af GalNAc-glycosyleret peptider sammenlignet med ikke-glycosylerede peptider (Figur 2C-E).

IL-2-produktion fra OVA specifikke CD8 + T-celle-hybridom (RF 33,70) samdyrket med knoglemarv afledte DC’er (A) eller CD11c + DC’er oprenset fra muse milt (B). DC’er blev pulset med to peptidvarianter med og uden 2 og 4 glycan rester (GalNAc). Fuld længde OVA blev anvendt som en positiv kontrol. Individuelt dyrkede T-celler og DC’er havde en OD-værdi på baggrunden. C, D) Overflade-ekspression ved flowcytometri af SIINFEKL i H2kb peptidbindende rille på DC’er efter pulsering med de to peptidvarianter (ikke-glycosyleret peptid (tynd lilla stiplet linie), peptid med 2 GalNAcs (tyk grøn linje), eller 4 GalNAcs (lyserød linje)). E) Overflade udtryk for SIINFEKL i H2kb peptid bindende rille på DC’er uden pulserende (blå linje) og efter pulserende med OVA kontrol (lilla linje). Grå histogrammer repræsenterer celler farvet kun med sekundært antistof.

GaINAc Glycosylering af et MUC afledt Antigen fremkalder Specifik IgG antistoffer og T-celle spredning

in vivo

amino -sekvens af den 24 mer syntetisk MUC1 peptid (degMUC1) ligner MUC1 tandemgentagelse imidlertid dets aminosyresekvens lidt ændret resulterer i en HLA-A2-epitop (ALGSTAPPV) [28]. DegMUC1 er derfor optimal til optagelse i human cancer vacciner, der sigter mod at fremkalde MUC1 specifikke CTL-responser. For at undersøge rollen af ​​GalNAc glycosylering

in vivo

for denne MUC1 modeltumorantigen, immuniserede vi Balb /c-mus og HLA-A2 transgene mus med degMUC1 med og uden GaINAc glycosylering. Balb /c-mus immuniseret med GaINAc-glycosyleret degMUC1 udviklet en stærk IgG-reaktion specifik for degMUC1, mens der ikke var nogen reaktion i mus immuniseret med det ikke-glycosylerede degMUC1 (figur 3A). Immuniseringer med KLH-konjugerede glycosylerede og ikke-glycosylerede degMUC1 resulterede i en IgG-respons i begge musestammer, selvom den glycosylerede variant resulterede i en mere fremtrædende respons (data ikke vist). Efter aftale med det humorale IgG reaktion, Balb /c mus immuniseret med GalNAc degMUC1 fremkaldte betydelig T-celleproliferation efter re-stimulation med enten GaINAc eller ikke-glykosylerede degMUC1 (P≤0,0004). Nr T-celleproliferation blev påvist i mus immuniseret med ikke-glycosyleret degMUC1 (figur 3B). Tilsvarende blev en højere proliferativt respons hos HLA-A2 transgene mus immuniseret med glykosyleret i forhold til ikke-glycosylerede degMUC1 verificerer den positive effekt af GaINAc glycosylering på CD4 + T-celle reaktivitet og humorale immunrespons (figur 3C). Som en kontrol tuberkulin oprenset proteinderivat (PPD) stimulering resulterede i lignende T-celleproliferation i begge grupper af HLA-A2 transgene mus.

A) Serum reaktivitet over for forskellige mucin glycoformer fra Balb /c-mus immuniseret med degMUC1 + /- GalNAc ved ELISA. Data er repræsentative for mindst 4 Balb /c-mus immuniseret med hvert antigen. (B) T-celleproliferation fra mus Balb /c-mus eller (C) HLA-A2 mus immuniseret med GalNAc degMUC1 (hvide bjælker) og ikke-glycosyleret degMUC1 (grå søjler) for hvert peptid, der anvendes til

in vitro

restimulering (100 ug /ml) som angivet på x-aksen. D) Lymfocytter fra immuniserede HLA-A2-mus pulseret med 9 mer degMUC1 peptid, ALGSTAPPV, med og uden glycosylering. DegMUC1 specifikke CD8 + T-celler blev valgt på basis af anti-CD8 Ab (x-aksen) og anti-IFNy Ab (y-akse) efter 4 timers Golgi stop-behandling. E) Spleen celler efter 24 dages re-stimulation med den ikke-glykosyleret ALGSTAPPV peptid. Alle T-celle data er genereret fra milt eller lymfeknuder fra mindst 4 mus, men i de fleste tilfælde 6 mus.

GaINAc Glycosylering af et MUC1 Afledt Antigen Block CD8 + T-celle respons

i vivo

Vi næste undersøgte CD8 + T-celle respons efter immunisering af HLA-A2 transgene mus med degMUC1 (+/- GaINAc glykosylering) efterfulgt af re-stimulation med degMUC1 9 mer CD8 + epitop ALGSTAPPV (+ /- GalNAc glycosylering). Kun de mus, der blev immuniseret og restimuleres med det ikke-glycosylerede degMUC1 peptid genereret IFN-γ producerende, ALGSTAPPV specifik, CD8 + T-celler, mens ingen reaktion hos mus immuniseret med GalNAc glycosylerede degMUC1 (figur 3D). T-celler fra immuniserede mus blev ekspanderet ved re-stimulation

in vitro

i i alt 24 dage med ALGSTAPPV bekræfter, at kun de mus immuniseret med de ikke-glycosylerede degMUC1 reagerede på re-stimulation med ALGSTAPPV (figur 3E) . Dernæst analyserede vi stabilitet og affiniteten af ​​HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV kompleks med og uden GaINAc glycosylering. HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV Komplekset havde en halveringstid på 19 timer og en affinitet på 100 nM, hvorimod HLA-A * 0201-ALGST [GalNAc] APPV Komplekset havde en halveringstid på 11 timer med en affinitet af 300 nM. Således ALGST [GaINAc] APPV er stadig en solid mellemliggende bindemiddel og bør være i stand til at fremkalde en CD8 + T-celle respons baseret på MHC bindingsdata.

High Density GaINAc Glycosylering Øger Optagelse af MUC1 og MUC2 afledte peptider men inhiberer MHC klasse i Presentation

Densitet af glycosylering kan påvirke optagelsen medieret af lectin-receptorer, såsom MGL. Derfor vi spekuleret på, at manglen på CD8 + T-celle responser mod GalNAc degMUC1 peptider kan være forårsaget af lav optagelse af korte GaINAc modificerede MUC1 peptider. Selv et begrænset antal GalNAc-rester er nok til at fremkalde en potent I-Ab respons, kan det være utilstrækkelig til indlægget præsentation kræves for at inducere en H-2K

b respons. For at teste virkningen af ​​GalNAc densitet vi pulseret DC’er med GaINAc-glycosyleret biotinyleret 60 merMUC1-peptid, som omfatter tre MUC1 tandemgentagelser (60 merMUC1). Mens GalNAc inkorporering ikke øgede optagelsen af ​​monomeren form af 60 merMUC1, forøget optagelse blev set, når kompleksdannelse blev induceret ved streptavidin (data ikke vist). Dernæst testede vi optagelse af fluorescerende perler overtrukket med MUC1 med og uden glycosylering. Perler overtrukket med GalNAc MUC1, som giver en meget høj tæthed af GaINAc MUC1, resulterede i en markant stigning i optagelse sammenlignet med ikke-glycosyleret MUC1 (figur 4A). Effekten af ​​flere GalNAc-rester på DC optagelse fik os til at teste, om syntetiske peptider indeholder flere GalNAc-rester kunne afhjælpe manglen på tværs præsentation af CD8 + T-celle epitoper observeret med de kortere MUC1 peptider. En MUC2 fusion peptid indeholdende multiple GalNAc glycosyleringer sites designet og

in vitro

glycosyleret at frembringe et peptid med og uden 9-10 GalNAc-rester lokaliseret i MUC2 sekvens. GalNAc MUC2 fusionspeptid blev let optages af DCS (figur 4B). Imidlertid GaINAc glycosylering stadig hæmmet overfladeekspression af SIINFEKL /H2-K

b komplekser og T-celle hybridom aktivering var lavere (figur 4C-D). Billeddannelse af internaliseret MUC2 fusionspeptid med og uden GalNAc bekræftet forøget optagelse af GaINAc-glycosyleret peptid ved DCS (Figur 4E-F). GalNAc MUC2 peptid overvejende co-lokaliseret med lysosomale markør LAMP-2, mens ikke-glycosyleret MUC2 fusionspeptid overvejende co-lokaliseret med tidlig endosomale markør EØS-1 (figur 4E-F, fig S1). Afslutningsvis GaINAc glycosylering forøger optagelsen, men forhindrer behandling af de to fusionspeptider indeholdende MHC klasse I bindende epitoper.

A) DC optagelse af uovertrukne fluorescerende kugler, MUC1-fluorescerende kugler, eller GalNAc MUC1 fluorescerende kugler. DC’er uden perler blev anvendt som reference. B) Optagelsen af ​​MUC2 fusionspeptidet +/- GaINAc blev vurderet ved flowcytometri efter 48 timers peptid pulserende. Ufarvede DCs (lilla fyldt) og DCS uden peptid belastning (grøn) blev anvendt som baggrund kontrol. C) Vurdering af overfladen ekspression ved flowcytometri af SIINFEKL i H2kb peptidbindende fordybning. DCs blev pulset med MUC2 fusionspeptidet (højeste koncentration fra D) med GalNAc (grøn linje) og uden GalNAc (lilla fyldte) 48 timer før farvning. D) IL-2-produktion fra SIINFEKL specifikke CD8 + T-celle-hybridom (RF 33,70) samdyrket med knoglemarvsceller afledte DC’er pulseret

in vitro

i to dage med MUC2 fusionspeptid både med og uden glycosylering i en koncentrationsgradient . Fuld længde OVA blev anvendt som en positiv kontrol. Repræsentative data fra mindst to uafhængige forsøg er vist. E, F) Konfokal afbildning af DC internaliseret GaINAc MUC2 fusion (E, grøn) og MUC2 fusion (F, grøn) co-farvet med endosomal markør EØS-1 (rød) og lysosomal markør LAMP-2 (rød).

diskussion

Cancer tilknyttede afvigende glykaner repræsenterer potente tumorantigener [11], [12]. Brug af MUC1 og ovalbumin som model molekyler præsenterer vi data tyder på, at GalNAc glycosylering forøger antigenoptagelse, MHC klasse II præsentation, og CD4 + T-celle-aktivering inducere potente antistofresponser. I modsætning hertil kan GaINAc glycosylering inhiberer MHC klasse I-antigen præsentation og aktivering af antigenspecifikke CD8 + -T-celler.

Det er klart, at GalNAc glycosylering potenserer antistofresponser og T-celleproliferation efter immunisering med en GalNAc modificeret MUC1 peptid ( degMUC1) (figur 3A). En forklaring herpå GalNAc induceret antistof respons

in vivo

vil sandsynligvis være stigningen i antigen-præsentation, og efter T-celle stimulation observeret ved GalNAc glykosylering af model peptid degMUC1 indeholdende et OVA afledt IA

b bindende peptid (figur 1). Dette er i overensstemmelse med vores tidligere fund af stærke IgG reaktioner på GalNAc MUC1 i humane MUC1 transgene mus [11], [12] og kræftpatienter [13], [14]. Desuden er det i overensstemmelse med forbedrede CD4 + T-celle responser på OVA konjugeret til GalNAc rester i andre undersøgelser [59]. Evnen af ​​GaINAc at bryde immunologisk tolerance og hjælpe dannelsen af ​​en CD4 + T-celle humorale immunrespons afhængige er af særlig betydning i cancerimmunterapi formål at generere IgG-antistoffer. Desuden har den specifikke induktion af CD4 + -T-celler blevet foreslået at føre til udryddelse tumor ved forsinket type hypersensitivitetsreaktioner [64] og for nylig cancerpatienter er blevet helbredt efter adoptiv overførsel af CD4 + T-celler med tumor-reaktivitet [65].

immunodominante H2-K

b bindende peptid SIINFEKL, udvundet af OVA, blev anvendt som udlæsning til MHC klasse i præsentation. Her, GaINAc glycosylering af flankerende MUC1 peptid hæmmede MHC klasse I-præsentation af SIINFEKL på DC’er samt aktiveringen af ​​en specifik CD8 + T-cellerespons (figur 2). I overensstemmelse med disse resultater, GaINAc glycosylering inhiberes induktionen af ​​CD8 + T-cellereaktioner

in vivo

efter immunisering af HLA-A2 transgene mus med et GaINAc glycosyleret degMUC1 peptid indeholdende HLA-A * 2:01 bindende epitop (ALGSTAPPV ) sammenlignet med den ikke-glycosylerede variant (figur 3D-E). Dette kunne til dels forklares ved den formindskede stabilitet af HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV kompleks, når peptidet er GaINAc-glykosyleret. Selv om HLA-A * 02:01 bindingsaffinitet og stabilitet af GaINAc-glycosylerede peptid let nedsat det synes stadig at binde ved et niveau, der er tilstrækkeligt til immunogenicitet. Således er vores observationer tyder alternative forklaringer. En mulighed er, glycopeptider ændrer DC-aktivering og derved ændre aktivering af T-celle. For at understøtte dette er det blevet vist, at selektive MUC1 glycoformer inducere T-celle-tolerance [66]. Men den inhibitoriske virkning sandsynligvis finder sted under forarbejdning, da mindre peptid /MHC-komplekser nået overfladen af ​​DC’er. Således kunne virkningen af ​​GalNAc på CD8 + T-celle respons skyldes hæmning af proteasomalaktivitet spaltning. Denne forklaring er også blevet bekræftet af biokemiske undersøgelser af spaltning af MUC1 afledte peptider ved oprensede immunoproteosomal enzymer [60]. I denne undersøgelse, glycosylering i både -VTS- og -GST- steder i MUC1 tandem gentagelsessekvens (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG) resulterede i total blok af antigen behandling, mens GalNAc glycosylering i kun én af disse steder inhiberede antigenprocesseringsveje. Dette ville forklare vores delvise præsentation af CD8 + epitopen, SIINFEKL, når kun to GalNAcs var til stede i SIINFEKL-MUC1 fusionspeptid, mens glycosylering med fire GalNAcs per gentagelse fører til en næsten total blok af præsentationen. Efter aftale med vores

in vitro

resultater, er det blevet påvist, at CD8 + T-cellefunktion er omvendt korreleret med omfanget af glycosylering af MUC1 proteinet anvendt til priming af CD8 + T-celler [67]. Dette støtter den opfattelse, at glycosylering kan frembyde problemer i CD8 + T-celle-induktion.

Øget antigenoptagelse af APC’er er af stor betydning ved bestemmelse T celle responser [19], [20]. Det er blevet påvist, at GalNAc MUC1 overtrukket på fluorescerende mikroperler internaliseres af humane DC’er gennem binding til makrofag galactose-typen C-type lectin (MGL) og leveret til HLA klasse 1- og 2 rum i DC [19], [20] . Det har også vist sig, at GalNAc konjugeret OVA proteinmål MGL og giver en bedre optagelse og CD8 + T-celle respons [59]. Dette er i modsætning til vores resultater med små peptidantigener. Glycosyleringen tæthed kan delvis forklare dette. Fra vores resultater er det klart, tæt glycosyleret 60 mer MUC1 i kompleks med streptavidin og coates på mikroperler inducerede markant øget optagelse (figur 4A). For at teste om indførelsen af ​​adskillige GalNAc-rester forøget CD8 + T-celleaktivering, skabte vi et tæt glycosyleret MUC2 fusionspeptid med en spaltelig linker mellem de to peptidelementer [68], [69]. MUC2 blev valgt, fordi den har flere glycosyleringssteder med meget højere densitet end MUC1 resulterer i et peptid med over dobbelt så mange GalNAc-rester på 25 aminosyresekvensen. Som forventet blev GaINAc MUC2 fusion optages mere effektivt end den ikke-glycosylerede modpart (figur 4B). Imidlertid var dette ikke afspejlet i aktivering af specifikke CD8 + T-celler eller peptid /MHC overflade ekspression (figur 4C-D). Formodentlig er de tætte GalNAc glycosylerings blokke CD8 + T-celle-aktivering, enten ved at inhibere antigen forarbejdning eller ved at rette immunogenet til ikke-MHC I rum. Støtte til dettes, konfokalt mikroskop billeddannelse påvist co-lokalisering af internaliseret GaINAc MUC2 fusionsprotein med LAMP-2. I modsætning hertil ikke-glycosyleret MUC2 co-lokaliseret med den tidlige endosomale markør EAA-1 (figur 4E-F, fig S1). Det skal dog bemærkes, at en robust induktion af GaINAc-MUC1 og MUC1 specifikke CTL’er er blevet rapporteret i murine undersøgelser under anvendelse en TLR-2 agonist adjuvans knyttet til en polio afledt T hjælper-epitop og et enkelt GaINAc glycosyleret tandemgentagelse MUC1 [70 ]. Graden og lokalisering af glykaner, inklusion af hjælper epitoper og rute for optagelse er af stor betydning for immunresponset.

Som konklusion vores data antyder, at afvigende GaINAc O-glycosylering kan inhibere dannelsen af ​​en kræft specifikke CD8 + T-celle respons på trods af øget antigen optagelse af udviklingslandene. Dette kunne være en potentiel faldgrube for design af MUC1 målretning cancervacciner. Oprettelsen af ​​fusionspeptider med to eller flere CD4 + og CD8 + T-celle-antigener, i hvilke der er indført specifik spaltning og processeringssteder, kan løse dette problem. Imidlertid kan sådanne fremgangsmåder vise sig vanskeligt, fordi inhibering af CD8 + T-cellereaktioner er blevet observeret, selv når GalNAc-rester blev separeret fra CD8 + T-celleepitop med en linkersekvens. Som konklusion kan GaINAc glycosylering af peptidantigener øge frembringelsen af ​​CD4 + T celle responser, men inhiberer CD8 + T-cellereaktioner.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Alle dyr eksperimenter blev godkendt af den lokale dyr facilitet og den danske Fødevarestyrelsen med godkendelsesnummeret: 2008 /561-1460. Dyrene blev monitoreret dagligt efter injektion for at afsløre eventuelle uønskede bivirkninger og aflivet ved cervikal dislokation ved slutningen af ​​eksperimentet.

Peptider Salg

MUC1 60 mer-peptid (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG

)

3 med og uden biotinylering (Bio) som tidligere beskrevet [19], MUC2 (ITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTP), MUC2 fusionspeptid (Biotin-PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTAAAAAAPSIINFEKL), degenererede (deg) MUC1 24 mer (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV), 9 meric peptid ALGSTAPPV og OVA-MUC1 fusion peptider (tabel 1) blev købt fra Schafer-N (Danmark) og glykosyleret

in vitro

anvendelse af rekombinante humane glycosyltransferaser GaINAc-T2, -T4 og -T11 som tidligere beskrevet [12]. Koncentrationer af alle peptider blev ækvilibreret ved HPLC standardkurver og nedbrydning af peptiderne i serum blev ubetydelige for den relevante 48 h periode (data ikke vist). KLH-konjugerede peptider blev fremstillet som tidligere beskrevet [11].

Måling Peptid-MHC-I affinitet og stabilitet

peptid-HLA-A * 0201-affinitet-målinger blev udført ved anvendelse af en homogen AlphaScreen baseret assay [71]. pMHC-I stabilitet blev målt ved hjælp af en homogen scintillationsproximitetstest assay [72]

cellelinier

Følgende OVA peptid /MHC komplekse specifikke hybridomer blev anvendt:. ISQAVHAAHAEINEAGR /IA

b kompleks specifikke T-celle hybridom BO-97,10 [73] var en slags gave fra John Kappler og Philippa Marrack og SIINFEKL /H-2K

b komplekse specifikke b-celle hybridoma 25- D1-16 [74] var en slags gave fra Ronald D Germain (NIH). SIINFEKL /H-2Kb-komplekset begrænset T-hybridoma RF33.70 [75] blev også anvendt. Alle celler blev holdt i RPMI 1640 med glutamax, 100 U /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin samt 10% FCS (standardmedium). Yderligere 5% berigelse supplement blev tilsat T-celle hybridomer. Berigelsen supplement indeholder: glucose, essentielle og ikke-essentielle aminosyrer, ethanolamin, Na.pyrovat, insulin, testosteron, 2-ME og linolsyre. For B-celle hybridom 5% FCS, 0,1% af SSR-3 og 5% af berigelse supplement blev tilsat.

Mus og immuniseringsprotokol

Alle mus blev holdt i stald- faciliteterne i SUND og Medical Sciences (Københavns Universitet). Alle forsøg er blevet godkendt af de danske myndigheder.