PLoS ONE: Kombinationsbehandling med MEK og AKT Inhibitors er mere effektiv end ét stof i Human Ikke-småcellet lungekræft In vitro og in vivo

Abstrakt

AZD6244 og MK2206 er målrettet små molekyler lægemidler, der hæmmer MEK og AKT hhv. Effekten af ​​denne kombination i lungekræft er ukendt. Vores tidligere arbejde viste betydningen af ​​aktiveret AKT i mediering modstand af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) til AZD6244. hypotese vi, at dobbelt hæmning af både downstream MEK og AKT veje ville fremkalde synergistisk antitumoraktivitet. I denne undersøgelse har vi vurderede effekten af ​​AZD6244 og MK2206 individuelt på et stort panel af lungekræft cellelinier. Derefter behandlede vi 28 humane lungecancer-cellelinjer med en kombination af AZD6244 og MK2206 ved klinisk gældende drug molforhold. The AZD6244-MK2206 kombinationsterapi resulterede i en synergistisk virkning på hæmningen af ​​lungekræft cellevækst sammenlignet med resultaterne af enkelt lægemiddel-behandling alene. MK2206 forbedret AZD6244-induceret Bim overekspression og apoptose i A549 og H157 celler. Når vi testede kombination af AZD6244 og MK2206 ved forhold af 08:01, 04:01, 02:01, og 01:08, fandt vi, at den synergistiske virkning af kombinationsbehandlingen var forholdet-afhængig. I forhold på 08:01, 04:01, og 02:01, lægemiddelkombinationen konsekvent demonstreret synergi, hvorimod faldende forholdet til 01:08 resulterede i et tab af synergi og frembragte en additiv eller antagonistisk virkning i de fleste cellelinjer. Desuden viste AZD6244-MK2206 kombinationsbehandling synergi i undertrykkelsen af ​​A549 og H157 xenograft tumor vækst og øget gennemsnitlig dyr overlevelsestid. Den AZD6244-MK2206 kombinationsbehandling medførte effektiv hæmning af både p-ERK og p-AKT-udtryk i tumorvæv. Desuden blev en væsentlig forøgelse af apoptose detekteret i tumorvæv fra mus behandlet med AZD6244-MK2206 sammenlignet med det fra den enkelt middel behandlede mus. Vores undersøgelse tyder på, at kombinationen af ​​AZD6244 og MK2206 har en væsentlig synergistisk virkning på tumorvækst

in vitro

in vivo

og fører til øget overlevelse satser i mus, som bærer meget aggressive humane lunge tumorer.

Henvisning: Meng J, Dai B, Fang B, Bekele BN, Bornmann WG, Sun D, ​​et al. (2010) Kombination Behandling med MEK og AKT Inhibitors er mere effektiv end ét stof i Human Ikke-småcellet lungekræft

In Vitro

In Vivo

. PLoS ONE 5 (11): e14124. doi: 10,1371 /journal.pone.0014124

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 7, 2010; Accepteret: 5. november 2010; Udgivet: November 29, 2010

Copyright: © 2010 Meng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes delvist af National Institutes of Health gennem MD Andersons Cancer center Support Grant CA-016.672 – Lung Program, flowcytometri og Cellular Imaging (FCCI) Core Facility og Forskning Animal Support Facility, et specialiseret program for forskning Excellence (SPORE) Tilskud CA-070.907 (J. Minna og J. Roth), en R01 Grant CA-124.951 (B. Fang) og Cohen-Reinach Family Charitable Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt og RAS /RAF /mitogenaktiveret proteinkinase (MEK) /ekstracellulært signal-reguleret kinase (ERK) veje, mægle spredning og overlevelse i humane lunge kræftceller og deler flere downstream molekyler, såsom FOXO3a [1], [2], Bad [3].

i øjeblikket et bredt udvalg af små molekyler tyrosinkinaseinhibitorer, der målretter signalveje er blevet udviklet caspase-9 , og to af disse midler er ved at blive evalueret i kliniske forsøg. AZD6244 er en allosterisk inhibitor af MEK1 /2 kinaser, som ikke konkurrerer med adenosintriphosphat (ATP) bindingsaktivitet [4]. Denne forbindelse binder til MEK1 /2 og inducerer flere konformationelle ændringer i ikke-phosphorylerede MEK1 /2 enzymer, inhibering deres katalytiske aktivitet, hvilket resulterer i en inhibering af ERK-aktivering og en blokade af signaltransduktionsveje. MK2206 er en meget selektiv ikke-ATP konkurrencedygtig allosterisk inhibitor af AKT med IC

50 i nM-området og har bred præklinisk antitumoraktivitet. Det er også i tidlige fase kliniske forsøg og evalueres i behandlingen af ​​patienter med lungecancer. Men den potentielle effekt af en kombination af AZD6244 og MK2206 i behandlingen af ​​lungecancer er ukendt. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningen af ​​kombinationen af ​​AZD6244 og MK2206 i at slå humane lunge cancercellelinier og fundet, at denne kombination var stærkt synergistisk

in vitro

og meget effektiv i behandlingen af ​​lungekræft xenotransplantater. Vi udforskede også den mekanisme for synergi for disse to forbindelser. Vores prækliniske resultater støtter kliniske undersøgelser af AZD6244 og MK2206 kombinationsbehandling hos patienter med lungecancer.

Materialer og metoder

Materialer

AZD6244 og MK2206, syntetiseret i Dr. William G. Bornmann laboratorium ved University of Texas MD Anderson Cancer center, blev opløst til koncentrationer på 25 mM og 20 mM, i dimethylsulfoxid og opbevaret ved -80 ° C. Antistoffer mod alt og phosphoryleret ERK og AKT blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Antistoffer mod Bim blev opnået fra Calbiochem (San Diego, CA). Proteaseinhibitorcocktail, β-actin antistof og sulforhodamin B blev opnået fra Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO). Proteinassay materialer blev indkøbt fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Deadend ™ Flurometic TUNEL System blev købt fra Promega (Madison, WI).

Cell kultur

Alle de menneskelige lungekræft cellelinier blev leveret af enten Dr. John V. Heymach på MD Anderson Cancer center eller Drs. Adi Gazdar og John D. Minna på The University of Texas Southwestern Medical Center på Dallas. Cellelinjerne blev opretholdt i RPMI 1640 eller høj-glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 ug /ml ampicillin og 0,1 mg /ml streptomycin; cellerne blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 og 95% luft.

Cellelevedygtighed assay

De inhibitoriske virkninger af AZD6244, MK2206, og kombination af AZD6244 og MK2206 på cellevækst blev bestemt ved hjælp af sulforhodamin B-assay som tidligere beskrevet [5]. Hvert forsøg blev udført i fire eksemplarer og gentaget mindst tre gange. Den relative cellelevedygtighed (%) blev beregnet ved hjælp af ligningen OD

T /OD

C × 100% (hvor OD

T repræsenterer absorbansen af ​​behandlingsgruppe og OD

C repræsenterer absorbansen af kontrolgruppen). Den mediane inhiberende koncentration (IC

50) værdier blev bestemt ved anvendelse CurveExpert 1.3 software og afbildet i dosisresponskurver.

Western blot-analyse

helcellelysater blev fremstillet ved vask af celler med phosphatpufret saltvand (PBS) og underkaste dem lysis med Laemmli prøvebuffer suppleret med proteaseinhibitorcocktail. Efter lysaterne blev sonikeret i 15 s blev proteinkoncentrationer kvantificeret under anvendelse af Bio-Rad protein assay kit. Ækvivalente mængder af hvert protein blev påsat, adskilt med 10% eller 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese, og derefter overført til Polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner ved 80 V i 2 timer. Membranerne blev blokeret i 1 time med 5% fedtfri tørmælk i PBS-buffer indeholdende 0,1% Tween-20 (PBST) og probet med fortyndet primært antistof ved 4 ° C natten over. Membranerne blev derefter vasket tre gange i PBST buffer og probet med infrarøde farvestofmærkede sekundære antistoffer; de immunoreaktive bånd blev visualiseret med Odyssey Imager (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Cell cyklus og apoptose analyser

Cellerne blev høstet ved trypsinisering, vasket to gange i koldt PBS, fikseret med iskold 70% methanol, og inkuberet ved 4 ° C natten over. Celler blev derefter vasket med PBS og inkuberet med 25 pg /ml propidiumiodid indeholdende 30 ug /ml ribonuklease i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler blev analyseret på en EPICS Profile II flowcytometer (Coulter Corp., Hialeah, FL) under anvendelse af Multicycle AV software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Forsøgene blev gentaget mindst tre gange.

Dyreforsøg

Alle Dyreforsøg blev udført efter godkendelse af MD Anderson institutionelle Review Board (11-03-09932) og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr offentliggjort af National Institutes of Health.

BALB /c nøgne mus blev købt fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Musene blev opstaldet i laminare flow kabinetter under specifikke patogenfrie forhold og blev brugt, da de var 6- til 8 uger gamle. I alt 3 × 10

6 H157 eller A549-celler blev podet subkutant i den højre dorsale flanker nøgne mus. Når tumorerne nåede en gennemsnitlig volumen på ca. 0,1 cm

3 blev musene tilfældigt opdelt i kontrol- og behandlingsgrupper (

n

= 5 dyr pr gruppe). For H157-bærende mus blev behandlingsgrupperne administreret 20 mg /kg AZD6244, 10 mg /kg MK2206, eller AZD6244-MK2206 kombination med 20 mg /kg-10 mg /kg, som alle var blevet solubiliseret i et medium indeholdende 0,5% hydroxypropylmethylcellulose og 0,1% polysorbat puffer. I A549-bærende mus blev behandlingsgrupperne indgives 24 mg /kg AZD6244, 6 mg /kg MK2206, eller AZD6244-MK2206 kombination på 24 mg /kg-6 mg /kg, som alle var blevet solubiliseret i et medium indeholdende 0,5% hydroxypropylmethylcellulose og 0,1% polysorbat puffer. Alle lægemidler blev opløst i 100 pi køretøj buffer for hver mus. Alle lægemidler administreret to gange dagligt ved oral sondeernæring. Kontrolgruppen modtog køretøjet puffer alene. Varigheden behandling var 20 d. Tumor størrelse, målt ved calipre, blev registreret hver 5 d. Tumorvolumenet blev beregnet, idet længden at være den længste diameter over tumoren og bredde til at være den tilsvarende vinkelret diameter, ved anvendelse af følgende formel: længde × bredde

2 × 0,52. Tumoren væksthæmning blev beregnet som 100% × (tumorstørrelse

behandlet /tumorstørrelse

kontrol) på hver måling dag. Tumorbærende mus fortsat behandling som angivet ovenfor efter 20 d. Mus fik lov til at leve op til deres naturlige død eller blev aflivet, når deres tumor volumen var større end 2000 mm

3. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev afbildet og analyseres statistisk. Dyrets kropsvægt blev målt og registreret hvert 5 d under behandlingen.

I den farmakodynamiske undersøgelse, tumorer blev etableret som beskrevet ovenfor og fik lov til at vokse til en størrelse på 0.5-0.8cm

3 før behandling startede. Mus med s.c. A549 tumorer blev derefter dagligt administreret køretøj, AZD6244, MK2206 eller AZD6244-MK2206 ved de samme koncentrationer nævnt ovenfor (

n

= 5 dyr pr gruppe) i 3 dage. Fire timer efter den sidste dosis blev dyrene aflivet og tumorer blev reseceret, fikseret med 4% paraformaldehyd og paraffinindlejret for immunhistokemi farvning og TUNEL-assay.

Immunhistokemi

Snittene blev afparaffiniseret i xylen og serielle fortyndinger ethanol. Antigenerne blev hentet og endogen peroxidase-aktivitet blev blokeret med 0,3% hydrogenperoxid i 10 min. Snittene blev derefter behandlet med 10% normalt gede eller hesteserum i 30 min. Efter inkubation natten over med primære antistoffer, herunder p-AKT (fortynding 1:100) og p-ERK (fortynding 1:100) blev sektionerne probet med biotinylerede sekundære antistoffer og derefter inkuberet med streptavidin-biotin-kompleks (Lab Vision, Fremont , CA). Snittene blev derefter farvet med en opløsning af 3,3-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB, Lab Vision, Fremont, CA), modfarvet med Mayers hæmatoxylin (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), dehydreret og monteret

TUNEL. assay

Snittene blev afparaffiniseret og TUNEL-assayet blev udført ved at følge producentens instruktioner for et kommercielt tilgængeligt kit (deadend ™ fluorometrisk TUNEL System) fra Promega. Apoptotiske celler udviser en stærk nuklear grøn fluorescens, som kunne påvises ved anvendelse af et standard fluorescein filter. Alle celler farvet med DAPI udviser en stærk blå nuklear fluorescens. Glassene blev observeret under fluorescens mikroskopi med relative apoptotiske celler bestemt ved at tælle TUNEL-positive celler i fem tilfældige felter (ved x 100 forstørrelse) for hver prøve.

Statistisk analyse

in vitro Salg cytotoksiske forsøg blev udført tredobbelt for hvert tidspunkt og koncentration. Betydningen af ​​

in vitro

data bestemt ved anvendelse af Student

t

test (2-halet). P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Genet mutationer af cellelinierne blev opnået fra online database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/). De korrelationer af

in vitro

reaktion på AZD6244 eller MK2206 (IC

50) og genmutationer blev vurderet ved hjælp af Wilcoxon test og Logistisk regression.

For

in vivo Salg undersøgelser blev tumorvolumener beregnet som middelværdi ± standardafvigelse. Wilcoxon rank sum test og Kruskal-Wallis testen blev anvendt til at sammenligne behandlingsforskelle. Spearman korrelationskoefficient blev anvendt til at estimere korrelationen mellem to kontinuerlige variabler. Behandlingsrum forskelle med hensyn til overlevelse blev vurderet via log-rank test. Alle tests var to-sidet. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistisk software SAS 9.1.3 og S-PLUS 8.0 blev anvendt til alle analyserne.

Resultater

Effekter af AZD6244 eller MK2206 Single-drug Behandling på Lung Cancer cellelinier

Før evaluering af virkningerne af kombinationsbehandlingen, testede vi antiproliferative effekt af AZD6244 og MK2206 som single-agent behandlinger på et panel af 47 humane lungekræft cellelinier (figur 1). Reaktionen på AZD6244 varierede meget, fra meget følsom (IC

50 0,2 uM) til særdeles resistente (IC

50 150 pM), blandt cellelinierne. Dosis respons vifte af MK2206 var mere konsekvent, med IC

50 spænder fra 0,4 uM til 25 uM. Vi fandt nogle cellelinjer var følsomme over for AZD6244 men resistent over for MK2206 (såsom Calu-6, HCC1171, og H1993), mens andre cellelinjer var resistente over for AZD6244 men følsom overfor MK2206 (såsom H522, H1395, og Calu-3) . Ingen sammenhæng mellem følsomheden over for disse to forbindelser blev observeret. Sammenligning af dosis-respons resultater og online genmutation database, blev ingen sammenhæng fundet mellem EGFR, KRAS, BRAF eller PI3K genmutationer og IC

50 af AZD6244 eller MK2206. Vi også ikke observere sammenhænge mellem overordnede EGFR /KRAS /BRAF genmutationer og IC

50 af AZD6244 eller overordnede EGFR /PI3K genmutationer og IC

50 af MK2206 (tabel 1 og 2).

De angivne cellelinier blev behandlet med forskellige koncentrationer af enten AZD6244 eller MK2206 i 96 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt ved anvendelse af sulforhodamin B, og IC

50 blev beregnet i overensstemmelse med den dosis-respons-kurve. Vejviser

Effekter af AZD6244-MK2206 kombination varierer blandt lungekræft cellelinier

fra de 47 cellelinier, valgte vi 28 at teste antitumorvirkninger af AZD6244 og MK2206 kombinationsterapi. Cellelinierne blev udtaget til en forskellig følsomhed over for et eller begge lægemidler. IC

50 var 5um for både AZD6244 og MK2206 for 21 af de 28 cellelinjer. For de øvrige cellelinjer IC

50 var 5um for AZD6244 eller MK2206 eller begge dele. For at bestemme om de antitumorvirkninger opnået med forskellige AZD6244 og MK2206 kombinationer var synergistiske, beregnede vi kombinationen indeks (Cl) ifølge Chou-Talalay metode under anvendelse Calculsyn software (Biosoft, Cambridge, UK). (CI 1,1, antagonisme, CI = 0,9-1,1, additiv effekt, CI = 0,2-0,9, synergisme, CI 0,2 stærk synergisme). Siden Chou-Talalay model kræver cytotoksiske midler, der skal anvendes ved et fast forhold dosis, valgte vi at bruge AZD6244 og MK2206 ved et 05:01 molforhold. Efter behandling med forskellige koncentrationer af AZD6244 (0,024 til 100 uM), MK2206 (0,005 til 20 uM) og AZD6244 /MK2206 (0,024 /0,005 til 100/20 uM), som er i det koncentrationsområde opnået i serum hos patienter, der fik oral AZD6244 og MK2206 blev kombinationen (Cl), målt på hver cellelinie. I 67% af cellelinierne, herunder H2023, H2347, HCC827, og H23 er vist i figur 2, kombinationsbehandlingen frembragte en stærk synergistisk virkning. Den kombinerede behandling producerede en additiv eller antagonistisk virkning på 11% af cellelinier (tabel 3).

Lungekræft cellelinjer blev behandlet med forskellige koncentrationer af AZD6244 (0,024 til 100 uM), MK2206 (0.005- 20 uM) og AZD6244 /MK2206 (0,024 /0.005-100 /20 uM) i 96 timer. Dosis-effekt kurver af kombinationen og alene hver agent præsenteres til sammenligning. Repræsentative cellelinjer, der demonstrerede de stærke synergistiske virkninger af kombinationsbehandlingen er vist.

synergistiske virkning af AZD6244-MK2006 kombinationsterapi er forholdet-afhængig

De faste stof nøgletal blev udvidet til 7 cellelinier (H1792, H157, A549, H515, H1693, H1703 og H3122), der var følsomme over for kombinationen af ​​AZD6244 og MK2206 til 08:01, 04:01, 02:01, 01:02, 1: 4, og 01:08. Vi fandt, at konsekvent synergisme resulterede da 8:1, 04:01 og 2:1 nøgletal blev brugt (figur 2, tabel 4), mens faldende AZD6244:MK2206 forholdet til 01:08 resulterede i et tab af synergi og produceret en additiv eller antagonistisk virkning i de fleste cellelinjer (tabel 4). Vi fandt også, at hver cellelinie havde sin egen optimale lægemiddel-forhold. For eksempel viste H1703 det højeste niveau af synergisme på et AZD6244:MK2206 forhold på 08:01; H1693 og A549 var højest ved 04:01 (figur 3A, venstre); og H157 var højest ved 02:01 (figur 3A, højre).

(A) A549 og H157 blev behandlet med AZD6244, MK2206, eller en kombination af disse to forbindelser ved de angivne koncentrationer i 48 timer. (B) Protein prøver blev høstet og AKT, p-AKT, ERK, p-ERK og Bim udtryk blev detekteret med Western blot-analyse. (C) Celler blev trypsinbehandlet og fikseret, og cellecyklussen blev målt med flowcytometri. Tallene angiver procentdele af apoptotiske sub-G

1-fase celler. Data repræsenterer en af ​​tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

Kolonner

, middelværdi;

bar

, SD *,

P

. . 0,05, sammenlignet med de enkelte behandlinger agent

MK2206 øger AZD6244-induceret apoptose

for at afgøre, om MK2206 havde en effekt på AZD6244-induceret apoptose, testede vi udtryk for AKT, p-AKT, ERK, p-ERK, og Bim og kvantificeres apoptotiske celler efter behandling med individuelle og kombinerede agenter. AZD6244 vides at opregulere ekspression af Bim, en eneste BH3-proteiner, hvilket medfører en mitokondrie-aktivering og apoptose, medieret af FOXO3a [6]. Derudover kan AKT også phosphorylere FOXO3a, og inhibering af AKT kan forbedre FOXO3a aktivering ved dephosphorylering. Vi bemærkede, at behandling med AZD6244 alene førte til en forholdsvis moderat overekspression af Bim ved 48 timer. Selvom vi ikke registrerer en tydelig ændring i Bim udtryk efter behandling med MK2206, da MK2206 blev kombineret med AZD6244, Bim udtryk steget til et højere niveau end det, induceret af AZD6244 alene (figur 3B). Vi fandt også, at 2-lægemiddelkombination resulterede i mere apoptotiske celler end enten enkelt-medikament-behandling alene. Når kombineret med MK2206, AZD6244 apoptose steg fra 14,4% til 29,8% i A549-cellelinien og fra 6,0% til 27,0% i H157 cellelinien (

P

0,05, figur 3C). Disse resultater indikerer, at MK2206 reelt forbedret AZD6244-induceret aktivering af mitokondrie apoptose.

Synergieffekt

in vivo

Svar på AZD6244-MK2206 kombinationsbehandling

in vivo

blev evalueret i subkutane tumorer genereret ved injektion af A549 eller H157 celler i flankerne af nøgne Balb /c-mus. Mus med etablerede flanke tumorer i lige store volumener blev behandlet med køretøj, en enkelt AZD6244 administration, en enkelt MK2206 administration, eller AZD6244-MK2206 kombination. I både A549 og H157 subkutan xenograft musemodeller, mus, der fik en kombination af AZD6244 og MK2206 viste en signifikant reduceret gennemsnitlig tumor volumen (135 ± 120 og 188 ± 107 mm

3) sammenlignet med mus, der modtager AZD6244 alene (848 ± 302 og 669 ± 154 mm

3), MK2206 alene (1497 ± 380 og 858 ± 125 mm

3), eller kontrol behandling (2666 ± 275 og 1437 ± 217 mm

3) ved dag 20 (

P

0,01 for alle tre sammenligninger, figur 4A). Dette resultat indikerer, at undertrykkelse af AKT med MK2206 øgede A549 og H157 cellernes følsomhed over for AZD6244

in vivo

. Desuden fandt vi, at dyr overlevelsestider var længere i de grupper, der fik en kombination 2-drug end i de grupper, der fik en enkelt agent forbindelser eller kontrolbehandling (figur 4B). Den mediane overlevelsestid for dyr behandlet med AZD6244-MK2206 kombination steget markant (

P

0,01, figur 4B). I A549 xenograft model, mus behandlet med AZD6244-MK2206 havde en median overlevelsestid på 50 d, mens dem behandlet med AZD6244 alene, MK2206 alene, og vehikelkontrol havde median overlevelse på 32 d, 23 d og 17 d, henholdsvis (

P

0,01 for alle tre sammenligninger). Vi havde lignende resultater i H157 xenograft model: de median overlevelse for kombinationsbehandlingen markant forøget til 45 d mens AZD6244-alone, MK2206-alone, og kontrol behandlinger var 33,5 d, 33 d, og 26,5 d, henholdsvis (

s

0,01 for alle tre sammenligninger). Desuden 20% af H157 tumorbærende mus og 40% af A549 tumorbærende mus, der modtog kombinationsbehandling overlevede forbi 55 d og havde ikke tumorer ved det endelige observation. Endvidere blev ikke fundet nogen signifikante forskelle i musenes kropsvægt mellem de fire grupper efter 20 d behandling, og der var ingen tydelige toksiciteter fra lægemiddelkombinationen (data ikke vist). Tilsammen tyder disse resultater på, at kombinationen af ​​AZD6244 og MK2206 har en synergistisk terapeutisk virkning på human lungecancer cellevækst i et panel af NSCLC cellelinier

in vitro

, og i A549 og H157 cellelinier

i vivo

.

flanke tumorer blev etableret i nøgne mus og behandlet med vehikel, AZD6244, MK2206, eller en kombination AZD6244-MK2206 terapi oralt to gange om dagen ved angivne doser. (A) Tumor mængder. Samlet forskelle mellem behandlinger var statistisk signifikant (

P

0,001; Kruskal-Wallis test). Vi observerede statistisk signifikante tid-for-behandling virkninger, når man sammenligner Kontrol vs A (

P

0,05); Kontrol vs M (

P

0,05); Kontrol vs A + M (

P

0,05); A vs M (

P

= 0,05); A vs A + M (

P

= 0,05) og M vs A + M (

P

0,05) for A549; Resultaterne var ens for H157 bortset fra, at A vs M ikke var statistisk signifikant. (B) Overlevelsestider. Samlet forskelle mellem behandlinger var statistisk signifikant (

P

0,001; Log RankTest).

Target graduering i A549 xenograft musemodel

I den farmakodynamiske undersøgelse , fire timer efter den sidste dosis på dag 3 blev dyrene aflivet, og tumorerne væv blev udskåret og analyseret for p-ERK og p-AKT ved immunohistokemisk farvning. Inhibering af p-ERK ekspression blev observeret i tumorer i mus behandlet med AZD6244 alene eller AZD6244-MK2206 kombination. Inhibering af p-AKT blev set i tumorer i mus behandlet med MK2206 alene eller AZD6244-MK2206 kombination (figur 5A). Resultaterne viste, at p-ERK og p-AKT effektivt blev hæmmet med AZD6244 og MK2206

in vivo

. Kombinationen af ​​AZD6244 og MK2206 kan også hæmme målene effektivt. Den TUNEL-analysen viste, at MK2206 forbedret AZD6244-induceret apoptose signifikant (

P

0,05). Fra 2,6% til 11,2% i xenograft tumorvæv (figur 5B)

De xerograft musemodeller var behandlet med vehikelkontrol, AZD6244 (24 mg /kg), MK2206 (6 mg /kg) eller AZD6244-MK2206 (24 mg /kg-6 mg /kg) kombination i 3 dage. Fire timer efter den sidste dosis, blev tumorerne resektion, fikseret og paraffinindlejret. (A) Snittene blev analyseret ved immunohistokemi under anvendelse af p-ERK og p-AKT antistoffer og de repræsentative fotografier i tumorsnit er vist. (B) Snittene blev underkastet TUNEL og DAPI-farvning. De relative apoptotiske celler blev bestemt ved tælling TUNEL-positive celler i fem tilfældige felter (ved 100 ganges forstørrelse) for hver prøve.

Kolonner

, middelværdi;

bar

, SD. *,

P

0,05, sammenlignet med de enkelte behandlinger agent. De repræsentative fotografier i tumor sektioner er vist.

Diskussion

I denne undersøgelse vi rapportere, at kombinationsbehandlingen af ​​MEK-inhibitor AZD6244 og AKT-inhibitor MK2206 kan fremkalde dramatiske synergistisk hæmning af tumorvækst

in vitro

in vivo

. Tidligere undersøgelser har observeret, at resistens over for AZD6244 i lungecancerceller medieres af AKT-aktivering [5], [7]. Tilbagekoblingssløjfen af ​​RAS /RAF /MEK /ERK og PI3K /AKT pathways fik os til at hypotesen, at undertrykkelse af disse to veje kan overvinde modstanden mod AZD6244 og virker synergistisk til at inhibere væksten af ​​lungekræft. I denne undersøgelse viste vi, at monoterapi behandling med enten AZD6244 eller MK2206 har en beskeden inhiberende virkning på lungekræft cellelinier. Fordi visse genmutationer kan være impliceret i respons på disse stoffer, vi også tjekket mutationsstatus af BRAF, KRAS, EGFR og PI3K i disse cellelinjer. BRAF V600E mutation er blevet rapporteret at være korreleret med sensitivitet over for MEK-inhibitorer [8], [9] og er blevet anvendt som et vigtigt kriterium for at rekruttere patienter i en klinisk undersøgelse af MEK-inhibitorer i melanom-patienter. KRAS, BRAF /KRAS, og LKB /KRAS mutation (e) er korreleret med følsomhed over for MEK-inhibitorer i ovariecancer [10], kolorektal cancer [11], og NSCLC [12], hhv. Men vi ikke registrere en indlysende sammenhæng mellem mutations udtryk for EGFR, BRAF, PI3KI eller KRAS og følsomhed over for AZD6244 eller MK2206 i lungekræft linjer vi testede. Dette kan skyldes de forskellige virkninger af mutationerne i specifikke histologiske typer af cancer eller i-cellelinje specifikke pathways. For eksempel, for bryst- og lungecancer, genekspression forbundet med differentiel følsomhed for AZD6244 inkluderet mange gener, der ikke var i fælles for begge histologier [13]. En anden mulig forklaring på forskellen på vore resultater og tidligere undersøgelser kan skyldes forskellige frekvenser af genmutationer i forskellige typer cancer. For eksempel er BRAF muteret i mange cancertyper, herunder malignt melanom (27-70%), papillær thyroidcancer (36-53%), ovariecancer (ca. 30%), og kolorektal cancer (5-22%). Men BRAF mutationer opdages kun 1-2% af patienter med lungecancer. Det ville være vanskeligt at vise statistisk signifikante med sådanne lavfrekvente begivenheder.

Vores undersøgelse viste, at den dobbelte agent AZD6244-MK2206 kombinationsbehandling udviste en synergistisk effekt på tumorvækst i forhold til enten agent alene. Som en enkelt-agent terapi, AZD6244 var ineffektive mod nogle lungekræft cellelinier (såsom Calu-1, H460, og H661). Men når den kombineres med MK2206, disse resistente cellelinier var, følsomme for kombinationsbehandling. Ifølge Chou-Talalay metoder [14], brugte vi et fast stof i forhold til at teste for en synergistisk effekt. I kliniske forsøg, vil kombinationsbehandlingen gives til patienter i gentagne 28-d cyklusser. Den planlagte startdosis af MK2206 er 45 mg /kg hver anden dag (den højeste gang hver anden dag dosis af MK2206 vil være 45 mg /kg) eller 90 mg /kg én gang om ugen og stigende til så meget som 250 mg /kg én gang om ugen ; den planlagte startdosis af AZD6244 er 75 mg /kg to gange dagligt (https://clinicaltrials.gov/). Vi valgte en narkotika-forhold på 5:01 AZD6244:MK2206 som er i dette interval for vores indledende undersøgelse

in vitro

. Vores resultater viste, at AZD6244:MK2206 kan inducere synergistiske virkninger mellem 89% cellelinier. For at opnå en mere kvantitativ analyse, vi udvidet narkotika nøgletal til at identificere den mest effektive område og den optimale synergistisk forhold. Vi fandt, at disse to lægemidler viste konsekvent synergistiske virkninger på 8:01, 4:01, og 2:1 forhold mellem AZD6244 til MK2206, mens faldende dette forhold til 1:08 resulterede i et tab af synergi og tilstedeværelsen af ​​kun additive virkninger eller endda antagonisme i de fleste cellelinjer. Vi derefter udvalgt to KRAS muterede cellelinjer, A549 og H157, for yderligere at undersøge virkningen af ​​AZD6244-MK2206 kombination

in vivo

. Tumorvæksten blev inhiberet signifikant med kombinationsbehandlingen i forhold til monoterapi behandling. De farmakodynamiske virkninger hos A549 xerografts viste, at ekspressionsniveauet af p-ERK og p-AKT blev undertrykt tilstrækkeligt med AZD6244 og MK2206 hhv. Kombinationen af ​​AZD6244 og MK2206 hæmmede både p-ERK og p-AKT effektivt. TUNEL-assay viste, at kombinationsbehandlingen inducerede meget mere tumorcelle apoptose end individuelle lægemidler. Disse resultater antyder kraftigt, at AZD6244 og MK2206 synergistisk inducerer apoptose ved dobbelt inhibering af ERK og AKT phosphorylering.

Tidligere undersøgelser har vist, at uanset om anticancer lægemiddelkombinationer interagerer synergistisk eller antagonistisk kan afhænge af forholdet mellem de kombinerede midler [15 ], [16]. Manglende kontrol lægemiddelforhold grund af ukoordinerede mekanismer eller farmakokinetik kan derfor føre til medikamentresistens hvis tumorcellerne eksponeres for antagonistiske lægemiddelforhold. Det er muligt, at de præcise forhold beskrevet

in vitro

muligvis ikke opnås i tumoren på en patient på grund af den differentielle fordeling og metabolisme af disse to forbindelser. Vi fandt imidlertid, at de synergistiske virkninger foregået over en bred vifte af lægemiddelkoncentrationer gør det sandsynligt, at en terapeutisk effekt opnås.

I vores mekanistiske og

in vivo

studier, vi brugte A549 og H157 cellelinjer fordi de begge havn KRAS-mutationer. Mutationer i KRAS er blevet fundet i 20% til 30% af lungecancere og menes at spille en central rolle i denne malignitet [17]. Tilstedeværelsen af ​​en muteret KRAS-genet er efter sigende forbundet med primær resistens over for alle målrettede behandlinger [18].