PLoS ONE: Induktion af kræft stamceller Ejendomme i Colon Cancer Cells af Definerede Faktorer

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) anses for at være ansvarlig for den dystre prognose af kræftpatienter. Men lidt om de molekylære mekanismer bag anskaffelse og vedligeholdelse af CSC ejendomme i kræftceller på grund af deres sjældenhed i kliniske prøver. Vi inducerede heri CSC ejendomme i kræftceller ved hjælp af definerede faktorer. Vi introducerede retroviralt et sæt definerede faktorer (

OCT3 /4

,

SOX2

KLF4

) i humane colon cancerceller, efterfulgt af dyrkning med konventionel serum-holdigt medium , ikke humane embryonale stamceller medium. Vi derefter evalueret CSC egenskaber i cellerne. De tyktarmskræft celler transduceret med de tre faktorer viste signifikant forbedret CSC egenskaber i form af markøren genekspression, sfære dannelse, kemoresistens og tumorgenicitet. Vi har udpeget cellerne med CSC egenskaber fremkaldt af de faktorer, en undergruppe af de transducerede celler, som inducerede CSCS (iCSCs). Desuden har vi etableret en ny teknologi til at isolere og indsamle iCSCs baseret på forskellene i graden af ​​farvestoffet-effluxing aktivitetsforøgelse. De xenotransplantater afledt fra vores iCSCs var ikke teratomer. Især i modsætning til tumorerne fra de parentale cancerceller, de ICSC-baserede tumorer efterlignede faktiske humane coloncancer væv i form af deres immunologiske resultater, som viste colon afstamning differentiering. Desuden har vi bekræftet, at fænotyper af vores iCSCs var reproducerbare i serietransplantation eksperimenter. Ved at introducere definerede faktorer, genereret vi iCSCs med afstamning specificitet direkte fra kræftceller, ikke

via

en induceret pluripotente stamcelle tilstand. Den ny metode gør det muligt at opnå rigelige materialer CSCS, der ikke kun har forbedret tumorgenicitet, men også evnen til at differentiere at rekapitulere en bestemt type kræft væv. Vores metode kan være af stor værdi for fuldt ud at forstå CSCS og udvikle nye behandlingsformer rettet mod CSCS

Henvisning:. Oshima N, Yamada Y, Nagayama S, Kawada K, Hasegawa S, Okabe H, et al. (2014) Induktion af kræft stamceller Ejendomme i Colon Cancer Cells af Definerede Faktorer. PLoS ONE 9 (7): e101735. doi: 10,1371 /journal.pone.0101735

Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Februar 3, 2014 Accepteret: 10 juni 2014; Udgivet: 9 jul 2014

Copyright: © 2014 Oshima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse var blevet gjort muligt takket være Balzan-prisen til Shinya Yamanaka (https://www.balzan.org/en/about-us/balzan-prize-milan), og støttet af Forsknings- bistandsmidler fra Shinryokukai General Incorporated Association (https: //www.shinryokukai.com/) (TA), som er en ikke for profit sammenslutning af tidligere Kobe University school of medicin og tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning fra Japan Society for fremme af Science (JSP’er; http: //www.jsps.go.jp/english/index.html): 10J06242 (til NO), og ingen var JSP’er stipendiater. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet, og det ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Konkurrerende interesser: NEJ og TA er medlemmer uden løn på Shinryoku-Kai General Incorporated Association, som er en ikke for profit sammenslutning af tidligere Kobe University school of Medicine. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft stamceller (CSCS) er blevet foreslået at være ansvarlig for den dårlige prognose af patienter med forskellige kræftformer på grund af deres egenskaber og adfærd, såsom højere terapeutisk modstand og tilbagefald [1] – [3]. Derfor er CSCS betragtes som en potentiel terapeutisk mål. At etablere nye behandlinger rettet mod CSCS, er det vigtigt at belyse de molekylære mekanismer bag købet af stemness i CSCS. Men disse er stadig uklart, fordi CSCS er en sjælden population af celler i kræft væv, og sjældenhed af CSCS gør det vanskeligt at identificere og samle dem.

Således genererer CSCS

in vitro

fra cancerceller og undersøgelse af deres egenskaber anses for at være en nyttig metode til løsning af dette problem. Adskillige undersøgelser [4] – [6] rapporterede, at celler med nogle CSC egenskaber såsom forbedret tumorigenicitet var inducerbare. de imidlertid ikke henvise til, om cellerne har differentiering evne til at rekapitulere specifikke typer af kræft væv. Derfor er det stadig uklart, om det er muligt at generere CSCS der netop svarer til primære cancer stamceller.

Med hensyn til erhvervelse af stemness, i genereringen af ​​inducerede pluripotente stamceller (iPSCs), blev det konstateret, at den ektopiske udtryk af kun tre eller fire transkriptionsfaktorer (

OCT3 /4

,

SOX2

og

KLF4

med eller uden

C-MYC

) kan inducere embryonale stamcelle egenskaber i somatiske celler når der anvendes ESC dyrkningsbetingelser [7], [8]. Disse gener kan også direkte inducere neurale stamceller (NSC) egenskaber i somatiske celler under anvendelse af neuro-sfære dyrkningsbetingelser [9]. Således er disse gener har evnen til at inducere forskellige typer af stemness i somatiske celler, afhængigt af dyrkningsbetingelser. Derfor har vi en hypotese, at disse gener også kan fremkalde CSC ejendomme i kræftceller.

I den aktuelle undersøgelse, vi transducerede

OCT3 /4

,

SOX2

KLF4

i humane coloncancer celler under forældrenes celle dyrkningsbetingelser og analyseret de transducerede celler i form af deres CSC egenskaber

in vitro

in vivo

. Derfor kunne sæt af tre gener fremkalde CSC ejendomme i en delmængde af kolon kræftceller, og vi var i stand til at indsamle cellerne med inducerede CSC ejendomme på grundlag af deres forskel i farve-efflux aktivitet. De indsamlede celler viste colon afstamning specificitet

in vitro

in vivo

. De inducerede CSCS genereres ved hjælp af denne metode kan bidrage til at undersøge de molekylære mekanismer bag anskaffelse og vedligeholdelse af CSC ejendomme i kræftceller og udvikle terapi CSC-targeting.

Materialer og metoder

Cellelinjer og Cell Culture

Humane kolorektale cancer cellelinjer (SW480 og DLD-1) blev leveret fra Cell Resource center for Biomedical Research, Tohoku Universitet. Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Carlsbad CA, USA) og penicillin (100 enheder /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (Life Technologies), og anvendt i tidlig passage til forsøgene.

RNA-isolering og kvantitativ revers-transkriptase polymerasekædereaktion

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy Plus Mini Kit ( QIAGEN, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. En 1 ug portion af total RNA blev revers transkriberet under anvendelse af en Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche, Basel, Schweiz) ifølge producentens protokoller. Kvantitativ revers-transkriptase polymerasekædereaktion (QRT-PCR) blev udført med den FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche) og blev analyseret med Step-One realtids-PCR-systemet (Life Technologies). Primersekvenserne er vist i tabel S1

Flowcytometri

En enkelt cellesuspension fra dyrkede celler blev immunfarvet med et muse-anti-humant CD133-antistof (Klon:. AC133, Miltenyi Biotec, Auburn CA , USA), muse-anti-humant CD44-antistof (Klon: G44-26, Becton, Dickinson and Company [BD], Franklin Lakes NJ, USA) eller muse-anti-humant ABCG2 antistof (Klon: 5D3, BioLegend, San Diego CA, USA). Efter at være blevet vasket, blev cellerne resuspenderet med PBS indeholdende 2% FBS, og døde celler blev mærket med 2 ug /ml propidiumiodid (PI, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA). Enkeltcellesuspensioner fra paraformaldehyd-fikserede celler blev permeabiliseret med 0,2% Triton-X (Sigma), og blev immunfarvet med et muse-anti-humant CD26-antistof (Klon: M-A261, BD) og kanin-anti-humant LGR5 (Klon: EPR3065Y , Abcam, Cambridge MA, USA). I alle af flowcytometri (FCM) eksperimenter blev isotypen antistoffer svarende til hvert antistof anvendt som kontroller. Prøverne blev analyseret ved en FACS Aria II instrument (BD).

Western blotting

Cellerne blev lyseret med M-PER pattedyrprotein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific, Rockford IL, USA ). Cellelysaterne blev underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Efter den elektroforetiske overførsel af proteinerne, immunoblotting med et muse-anti-humant ALDH antistof (Klon: 44 /ALDH, BD), efterfulgt af en peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof, blev udført. For at bestemme den kemiluminescens, LAS 4000-systemet (Fuji film, Tokyo, Japan) blev anvendt.

Cell Cycle Analysis

Cellerne blev fikseret med 70% ethanol i PBS ved 4 ° C natten over. Cellerne blev behandlet med ribonuklease at fordøje RNA og farvet med 50 ug /ml PI. Cellerne blev analyseret ved flowcytometri (FACS Aria II).

5-FU-kemoresistens analyse

cellelevedygtighed efter 5-fluorouracil (5-FU, Kyowa Kirin, Tokyo, Japan) eksponering blev målt ved WST-8 kolorimetrisk assay (Cell Counting Kit-8, Dojindo, Kumamoto, Japan). I alt 5 × 10

3-celler blev podet i 96-brønds plader på dag 10, og mediet blev erstattet med DMEM indeholdende 1 eller 50 ug /ml af 5-FU 24 timer efter podning. Efter inkubation i 48 timer blev absorbansen ved 450 nm målt ved anvendelse af en mikrotiterpladelæser. Cellen levedygtighed blev beregnet som forholdet mellem absorbansværdier for den samme prøve inkuberes i DMEM uden 5-FU i 48 timer.

Sphere Formation Assay

Cellerne blev overført til Ultra Low Attachment plader (Corning Incorporated, Corning, New York, USA) i serumfrit DMEM indeholdende 10 ng /ml bFGF (Wako, Osaka, Japan), 10 ug /ml human insulin (CSTI, Miyagi, Japan), 100 ug /ml humant transferrin (Roche) og 100 ug /ml BSA (Nacalai Tesque), og inkuberet ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator i 10 dage.

Dye efflux Activity Analysis

En farvestof efflux aktivitetsanalyse blev udført ifølge tidligere beskrevne fremgangsmåder [10] – [12] med nogle modifikationer. Cellerne blev høstet i DMEM indeholdende 2% FBS og 1 mM HEPES (Sigma-Aldrich). Cellerne blev inkuberet i DMEM indeholdende 2% FBS og 1 mM HEPES med Hoechst33342 (Life Technologies) ved 5 ug /ml med eller uden samtidig administration af verapamil (Sigma-Aldrich) ved 50 eller 250 uM i 90 minutter ved 37 ° C, og blev forsigtigt vendt hver 30. minut. Efter inkubation blev cellerne resuspenderet i PBS indeholdende 2% FBS og 1 mM HEPES (Sigma-Aldrich). Cellerne blev modfarvet med 2 ug /ml PI til at mærke døde celler, og blev ført gennem en 35 um mesh filter, holde dem på is til flowcytometri og sortering. Celler blev analyseret og sorteret efter en FACS Aria II. Hoechst farvestof var ophidset med en UV-laser (355 nm), og fluorescensen blev målt med både en 670/50 filter (Hoechst Red) og et 450/50 filter (Hoechst Blå).

In vivo Tumorigenicitet Undersøgelse

i alt 1 × 10

6, 3 × 10

5 eller 1 × 10

5 celler i 100 ul serum-frit PBS blev injiceret subkutant i begge dorsale flanker af en immundeficient nøgen mus (KSN /Slc mus, SLC, Shizuoka, Japan). Tumorvolumenet blev beregnet ved formlen 0,5 × L × W

2 (L: længde, W: bredde). Forsøgene blev gennemgået og godkendt af Det Dyreetiske og forskningsudvalget, Kyoto University (Permit nummer: 11537, 12237, 13217), og gennemføres i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Serial Transplantation

For de serielle transplantation eksperimenter, sorteret celler dyrket i ni-16 dage (første kultur) efter sortering, så i alt 3 × 10

6 celler blev subkutant injiceret i immundefekte nøgne mus. De tumorer (første tumorer) blev skåret ud, når de nåede en diameter på over 10 mm og blev patologisk analyseret. Det udskårne tumorer blev også enzymatisk dissocieret til enkelt-cellesuspensioner ved en gentleMACS Dissociator og human tumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec), ifølge fabrikantens protokoller. De dissocierede celler blev injiceret subkutant i nøgne mus efter dyrkning i seks til ti dage (anden kultur), og blev analyseret ved FCM baseret på deres farvestof efflux aktivitet på dag seks til tolv efter dissociation. Proceduren blev gentaget tre gange, indtil den fjerde dyrkede celler fra dissociation af det tredje sæt af tumorer blev opnået.

Immunhistokemi

formalinfikserede, paraffinindlejrede sektioner afledt af xenotransplantater blev farvet med anti-human cytokeratin 20 (CK20) monoklonalt muse-antistof (Klon: Ks20.8, fortynding 1:25 Dako, Glostrup, Danmark), anti-human cytokeratin 7 (CK7) kanin-monoklonalt antistof (Klon: SP52, koncentration; 0,536 ug /ml, Roche) eller anti-humant caudal typen homeobox 2 (CDX2) monoklonalt muse-antistof (Klon: AMT28, fortynding 1:500, Leica Biosystems, Wetzlar, Tyskland) ved avidin-biotin immunoperoxidase metode. Microwave antigen-genvinding blev udført. For immuncytokemi blev de dyrkede celler, som blev fikseret med 4% paraformaldehyd, farvet med anti-CK20 antistof (Klon: Ks20.8, fortynding 1:100) eller anti-CDX2 antistof (Klon: CDX2-88, forud fortyndet, Abcam) , og modfarvet med Hoechst33342 (Life Technologies) at identificere alle kerner.

Resultater

transduktion af

OCT3 /4

,

SOX2

KLF4

ind i en coloncancercellelinie

Vi transduceret

OCT3 /4, SOX2, KLF4

, eller en blanding af de tre (herefter OSK) i SW480 human colon cancer cell line hjælp retrovirusvektorer [7] (se Methods S1), og også en Mock vektor (tom vektor) blev anvendt som kontrol. Disse celler blev derefter betegnet O-SW480, S-SW480, K-SW480, OSK-SW480 og M-SW480 hhv. De parentale celler blev også betegnet Wt-SW480. I denne undersøgelse blev cellerne dyrket i DMEM indeholdende 10% FBS og evalueret på dag 10 efter transduktion (fig. S1A). Vi bekræftede retroviral transduktion og mRNA-ekspression af transducerede gener (Fig. S1B og S1c). I M-SW480 celler,

KLF4

blev endogent udtrykt, mens

OCT3 /4

og

SOX2

ikke blev opdaget. Skelnelige morfologiske ændringer blev observeret i hver af de linier, der blev tilskrevet deres transducerede gen (er) (fig. S1D).

Ekspression af tidligere rapporterede markører relateret til kolon CSCS og intestinale stamceller i transduceret-SW480 celler

for at vurdere stamcelle status de transducerede celler, vi evaluerede ekspressionsniveauerne af tidligere rapporteret kandidat markørgener, omend kontrovers [13], [14], af kolon CSCS og tarm stamceller, såsom som

CD133

[15], [16],

CD44

[17], [18],

CD26

[19],

ALDH1

[ ,,,0],20],

ABCG2

[21] og

LGR5

[22] af QRT-PCR (fig. 1A). Blandt cellelinjerne, kun OSK-SW480 celler var signifikant øget mRNA ekspressionsniveauer af alle generne i forhold til M-SW480-celler (n = 3).

(A) QRT-PCR af tidligere rapporterede markører relaterede til kolon CSCS og tarm stamceller i de transducerede SW480 celler. Alle markørerne blev opreguleret i OSK-SW480-celler. De mRNA Ekspressionsniveauerne blev normaliseret til de af

GAPDH

. De relative ekspressionsniveauer sammenlignet med de for M-SW480 er vist. (B) Protein- ekspressionsniveauer af CSC markører i de transducerede SW480-celler som bestemt ved en flowcytometrisk (FCM) analyse. Data fra tre uafhængige forsøg viste, at antallet af CD133-, CD44-høj-, CD26- og ABCG2-positive celler blev øget markant i de OSK-SW480 celler. De repræsentative dot plots af hver markør er vist i figur S2. (C) Proteinet ekspression af ALDH1 i de transducerede SW480-celler bestemt ved en Western blot-analyse. Panelet viser repræsentative data fra tre uafhængige forsøg. (D) Den celledeling

in vitro

. I alt 3 × 10

5-celler blev udpladet på seks-brønds plader på dag syv og blev talt på dag 11. Antallet af OSK-SW480-celler var lavere end for M-SW480-celler (n = 3). (E) Cellerne i G1 /0 fase blev detekteret ved en FCM-analyse på dag 11. Procentdelen af ​​celler i G1 /0 fase væsentligt forøget i O-, K- og OSK-SW480-celler (n = 3) . (F) 5-FU-chemoresitance analyse. Levedygtighed OSK-SW480-celler i nærvær af 5-FU var signifikant højere end for M-SW480-celler på både 50 pg /ml koncentrationer af 5-FU 1 og (n = 3). Levedygtigheden af ​​de M-SW480-celler ved hver koncentration blev sat til 100%. Fejlsøjlerne angiver standardafvigelsen: SD. * P 0,05, ** P. 0,01, Dunnetts test

Dernæst vi evaluerede protein ekspressionsniveauerne af markørerne (Fig 1b, 1c og S2.). FCM-analyse viste, at de OSK-SW480-celler havde signifikant forøget protein ekspressionsniveauer af CD133, CD26 og ABCG2. De fleste af de transducerede celler udtrykte CD44, men antallet af celler, der udtrykker et højere niveau af CD44 blev forøget omkring to gange i OSK-SW480-celler sammenlignet med M-SW480-celler (n = 3) (fig. 1B og S2). OSK-SW480 celler viste en tendens til at have en øget ekspressionsniveau af LGR5, men dette var ikke statistisk signifikant (fig. 1B og S2) (n = 3). En Western blot-analyse viste, at ekspressionsniveauet af ALDH1 blev forøget kun i OSK-SW480-celler (fig. 1C). Disse resultater antydede, at OSK har evnen til at fremkalde CSC signaturer i en delmængde af SW480 celler.

spredning og cellecyklus i transducerede SW480 celler

Vi næste vurderet væksten af ​​cellerne

i vitro

. Antallet af OSK-SW480-celler ved 96 timer efter podning 3 × 10

5-celler var signifikant lavere end den for M-SW480-celler (p 0,01, n = 3) (Fig 1D.). Jo længere observation viste også ensartede resultater (fig. S3). For at undersøge, om de transducerede gener påvirket cellecyklussen, udførte vi en cellecyklusanalyse af FCM med DNA-farvning under anvendelse af propidiumiodid (fig. 1E). Procentdelen af ​​celler i G1 /0 fase var omkring 10% højere i O-, K- og OSK-SW480 kulturer end det færdige M-SW480-celler (n = 3).

Følsomhed over for kemoterapeutiske midler

for at undersøge anticancerlægemidlet følsomhed af cellerne, sammenlignede vi overlevelsesprocenten for cellerne efter behandling med 1 eller 50 ug /ml af 5-FU i 48 timer ved WST-8 kolorimetrisk assay (fig. 1F). I OSK-SW480 celler, overlevelsesraten var omkring 20% ​​højere end de M-SW480 celler ved begge koncentrationer af 5-FU (n = 3). Dette resultat antydede, at OSK-SW480-celler indeholdt cellerne erhvervede kemoresistens til 5-FU.

Sphere formation assay

Det er tidligere blevet rapporteret, at CSCS havde en højere evne til at danne sfæroider under dyrkningsbetingelser i lav tilknytning retter og serum-frit medium [2], [16]. For at undersøge kugle-dannende evne vore transducerede celler, udførte vi en kugle formation assay (fig. 2A). I M-SW480 celler, vi næppe observeret nogen sfæroider. I modsætning hertil i O-, K- og OSK-SW480 kulturer, observerede vi en tydeligvis øget antal sfæroiderne (gennemsnit: 47, 23 og 50, henholdsvis n = 3), hvilket indikerer, at

OCT3 /4, KLF4

OSK bidrog til den klumpformet dannelse i en delmængde af SW480 celler.

(a) klumpformet dannelse assay. I alt 1 × 10

4-celler blev udpladet på lave vedhæftede retter på dag 10 og dyrket med serum-frit medium i 10 dage. I O-, K- og OSK-SW480 kulturer, blev antallet af sfæroider markant øget i forhold til, at af de M-SW480 celler. Fejlsøjlerne angiver SD (n = 3). Scale barer: 100 um. (B) Den tumorigenicitet af cellerne efter implantation i det subkutane områder af immundefekte nøgne mus. I alt 1 × 10

6 celler (venstre panel) eller 3 × 10

5-celler (højre panel) blev subkutant injiceret i begge flanker af immundefekte nøgne mus på dag 10. Volumenet af tumorerne afledt af K- og OSK-SW480-celler var naturligvis højere end for de Wt-, m-, o- og S-SW480-celler til både antallet af injicerede celler. De røde søjler angiver median tumor volumen. ** P 0,01, NS:. Ikke signifikant, Dunnetts test (undtagen med †: U-test)

Tumorigenicitet

in vivo

For at undersøge tumorgenicitet af de transducerede celler, subkutant vi transplanterede 1 × 10

6 eller 3 × 10

5 celler i immundefekte nøgne mus i det dorsale område på begge sider, og så har vi målt forekomsten og mængden af ​​tumorer efter fire uger for 1 × 10

6 celler og otte uger for 3 × 10

5 celler efter transplantation, (fig. 2B). Et resumé af tumor forekomst er vist i tabel 1. K- og OSK-SW480 celler genereret tumorer i 100% af de steder, mens de øvrige linjer genererede tumorer i 75% og 25% af tilfældene for cellen antallet af 1 × 10

6 og 3 × 10

5 celler. Vi observerede en betydeligt højere volumen af ​​tumorer i K-og OSK-SW480 celle-injicerede mus sammenlignet med dem injiceret med andre linjer, både celle mængder, nemlig 1 × 10

6 og 3 × 10

5 celler (fig. 2B).

samlet indikerer disse data, at OSK tilstrækkeligt inducerede alle de tidligere rapporterede CSC ejendomme vi undersøgte

in vitro

in vivo

, hvorimod ingen enkelt gen var tilstrækkelig til at inducere alle disse egenskaber. Vi har udpeget cellerne med CSC egenskaber i OSK-SW480 kulturer inducerede CSCS (iCSCs).

efflux aktivitet for Hoechst33342

I tidligere rapporter [2], [10], [12 ], [23], [24], FCM hjælp Hoechst33342 mærkning med verapamil (VM), som er en ATP-bindende kassette (ABC) transporter inhibitor, var en effektiv måde at berige forskellige typer af stamceller-lignende celler, herunder cancerceller . I denne analyse blev det anset, at de stamceller-lignende celler (såkaldte Side Befolkning celler) blev ikke mærket af Hoechst33342 uden VM, men var mærket af Hoechst33342 med administrationen af ​​VM.

Vi bekræftede eksistensen af 5 ug /ml Hoechst33342-effluxing celler, som forsvandt med samtidig administration af 50 uM VM i M-SW480 kultur (fig. 3A). Vi sætter en port, hvor befolkningen var medtaget, og betegnes cellerne i porten i fraværet af VM som “V0-celler” (fig. 3A, venstre panel), efterfulgt af en analyse af andre linjer. Antallet af V0-celler steg markant i O- og OSK-SW480 kulturer (3,9% og 5,0%, henholdsvis) i sammenligning med M-SW480 kultur (2,6%) (fig. 3A, højre panel). Især unikke celler, som blev uden mærkning af Hoechst33342 selv med tilstedeværelsen af ​​50 uM VM, var åbenbar under de OSK-SW480 kulturer. Vi betegnes disse celler som “V50-celler” (fig. 3A, venstre panel). Behandling med 250 pM af VM resulterede i forsvinden af ​​cellerne i porten, hvilket indikerer, at V50-celler var følsomme til 250 uM af VM (fig. 3B, venstre panel). Tilsammen disse data viste, at vi fået en ny samlerobjekt cellepopulation:. V50-celler med en yderst potent farvestof-efflux aktivitet induceret i OSK-SW480 kulturer

(A) De OSK-SW480 celler omfattede en population af celler umærket af 5 ug /ml Hoechst33342 med co-administration af 50 uM verapamil (VM). Vi har udpeget cellerne uden mærkning af Hoechst33342 uden VM og med 50 uM VM som V0-celler og V50-celler. Det venstre panel viser repræsentative dot plots af mærkede og umærkede celler på dag 10 efter transduktion. Højre panel viser resultaterne af tre uafhængige forsøg. Den V0 subpopulation blev øget i O- og OSK-SW480 celler. V50-celler blev naturligvis set i OSK-SW480 kulturer. Fejlsøjlerne angiver SD (n = 3). * P 0,05, ** P 0,01, Dunnetts test. (B) Dye efflux aktivitet ved dag 10 (venstre felt) og dag 28 (højre panel) efter transduktion. V50-celler forsvundet under behandlingen med samtidig administration af 250 uM VM selv i OSK-SW480 celler. Andelen af ​​OSK-V50 celler faldt med tiden.

Bekræftelse med en anden coloncancercellelinie

For at bekræfte de aktuelle resultater, vi undersøgte en anden tyktarmskræft cellelinje, DLD- 1, i nogle eksperimenter, herunder evalueringer af celle vækst

in vitro

, tumorgenicitet

in vivo

og Hoechst33342 effluxing egenskaber (fig. S4). I DLD-1-celler, vækstraten af ​​OSK-DLD-1-celler var lavere end den Wt- (parental) og Mock-DLD-1 celler (p 0,01, n = 3) (fig S4A.) . Den tumorigenicitet på 1 × 10

5 celler var højere i OSK-DLD-1 celler i forhold til Wt- og Mock-DLD-1 celler (Fig. S4b, tabel S2). V50-celler blev også set i OSK-DLD-1, men ikke i Mock-DLD-1, kulturer (fig. S4C).

Indsamling af iCSCs fra OSK-SW480

for at undersøge, om CSC egenskaber induceret i OSK-SW480 kulturer henføres til V50-celler, vi sorteret og analyseret V50-celler og ikke-V50-cellerne i nærvær af 50 uM VM i OSK-SW480 celler, og V0- celler og ikke-V0-celler i fravær af VM og ikke-V50-celler i nærvær af 50 uM af VM i M-SW480 kulturer. Disse celler blev betegnet OSK-V50, OSK-nonV50, M-V0, M-nonV0 og M-nonV50 henholdsvis.

Efter sortering af en fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) på dag 10, alle linjer var efterfølgende dyrket i 10 dage i DMEM indeholdende 10% FBS. De OSK-V50 celler udviste morfologi svarende til den karakteristisk observeret i de OSK-SW480-celler på dag 10 (fig. 4A, fig. S1D). I modsætning hertil OSK-nonV50 celler udviste morfologi ligner den i den M-V0, M-nonV0 og M-nonV50 celler (Fig. 4A). Cellen vækstrate af OSK-V50 celler var signifikant lavere end for de andre linjer (p 0,01, n = 3) (Fig 4B.), Hvilket resulterer i nedsat andel (-0,1%) af V-50 celler på 28 dage efter transduktion under den nuværende kultur tilstand (fig. 3B, højre panel).

de V50-celler i OSK-SW480 (OSK-V50) celler blev sorteret ved FACS. Ikke-V0-, V0- og ikke-V50-celler i M-SW480-celler (M-nonV0, M-V0 og M-nonV50 henholdsvis) og ikke-V50-celler i OSK-SW480-celler (OSK-nonV50 ) blev ligeledes sorteret og anvendt som kontroller. Disse celler blev alle efterfølgende dyrket. (A) De morfologier af celler dyrket i 10 dage efter sortering. Morfologien af ​​OSK-V50-celler var den samme som karakteristisk observeret i OSK-SW480-celler (fig. S1D, foret cirkel). I modsætning hertil morfologien af ​​OSK-nonV50 celler var svarende til den i M-V0, M-nonV0 og M-nonV50 celler. Scale barer: 100 um. (B) Den celledeling

in vitro

. I alt 3 x 10

5 celler dyrket i 14 til 18 dage efter sortering blev udsået og talt 96 timer senere. Antallet af celler var signifikant lavere i OSK-V50 celler end i alle de andre linjer. Fejlsøjlerne angiver SD (n = 3). ** P 0,01, Scheff test. (C) Tumorigenicitet af cellerne i immunsvækkede mus. I alt 3 × 10

5 eller 1 × 10

5 celler blev subkutant injiceret i immundeficiente nøgne mus på dag 18 efter sortering. Tumorvolumen og forekomsten blev målt otte uger efter injektion. Kun OSK-V50 celler genereret åbenlyse tumorer til både de injicerede celle numre, mens ingen tumorer blev opnået fra M-nonV0, M-V0, M-nonV50 og OSK-nonV50 celler. Forekomsten af ​​tumordannelse af OSK-V50 celler var 4/4 for både injicerede celle numre. De røde søjler angiver median tumor volumen.

tumorigenicitet af OSK-V50 celler i immundefekte mus var selvfølgelig højere med hensyn til størrelse og forekomst af tumorer end de andre cellelinjer, herunder OSK-nonV50 celler (fig. 4C).

samlet set disse data viser, at OSK-V50 celler udviste CSC egenskaber, men at OSK-nonV50 celler ikke gjorde det, hvilket indikerer, at CSC egenskaber induceret i OSK-SW480 celler kan henføres til V50-celle population.

Colon afstamning differentiering af OSK-V50 celler

in vitro

OSK-V50 celler samt M- V0-celler var positive for CDX2, en master regulator af intestinal epitheldifferentiering [25], og CK20, et colon differentieringsmarkør [26], ved immunofarvning (fig. 5A). Således OSK-V50 celler opretholdt colon afstamning fænotype og differentiering evne

in vitro

(fig. 5A).

(A) Immuncytokemi for CDX2 og CK20 protein. OSK-V50-celler var positive for CDX2 og CK20 samt M-V0 celler. Cellerne blev modfarvet med Hoechst33342. Scale barer: 100 um. (B) Den fænotypiske mangfoldighed i morfologi og mobilitet af derivater af OSK-V50 celler. Fotografier er time-lapse billeder af M-V0 og OSK-V50 celler. De sorterede celler blev efterfølgende dyrket i fem dage og derefter observeret hver sjette time for 42 timer. Time-lapse billeddannelse viste, at der var en højere diversitet i både morfologi og mobilitet i OSK-V50-celler (nederste panel) sammenlignet med M-V0 celler (øvre panel). Original forstørrelse, × 20. Film af M-V0 og OSK-V50 celler er vist i Video S1 og video S2 henholdsvis.

fænotypisk diversitet i derivater af OSK-V50

Generering heterogenitet i kræft væv er en af ​​de bemærkelsesværdige CSC egenskaber [1] – [3]. For at undersøge denne egenskab i vores isolerede celler, vi efterfølgende analyseret 23 dage efter sortering (fig. S5). De OSK-V50-celler, i modsætning til alle andre celler, kunne producere V50-celler og samt diverse forskellige delmængder af celler i form af graden af ​​Hoechst-effluxing funktion (fig. S5).

Vi næste udført

in vitro

time-lapse imaging af M-V0 og OSK-V50 celler for 42 timer (fig. 5B, Methods S1). De M-V0 celler bestod af små rund- og spindel-formede celler, og dannede kolonier bestående af celler med klare kanter. De OSK-V50 celler bestod af celler med forskellige morfologier, såsom polygonal-, rund-, cuboidal-, spindle- og flade-formede celler, som ændrede deres morfologier med tiden, og dannede flade monteret kolonier bestående af celler med uklare kanter . Endvidere OSK-V50 celler udviste højere celle mobilitet end M-V0 celler (Fig. 5B, videoer S1 og S2). Disse resultater tyder på, at OSK-V50 celler kan producere en højere diversitet, hvad angår morfologi og mobilitet i forhold til M-V0 celler.

Colon afstamning differentiering af OSK-V50 celler

in vivo

Vi næste histologisk vurdering tumorerne afledt af M-SW480 og OSK-V50 celler i immundefekte mus (fig. 6).