PLoS ONE: MIR-224 Mål 3’UTR af type 1 5′-iodothyronin deiodinase Muligvis Bidrag til Tissue Hypothyroidisme i Renal Cancer

Abstrakt

Type 1 iodothyronin deiodinase (DIØ1) katalyserer omdannelsen af ​​prohormone thyroxin til det aktive thyroidhormon 3,3 ‘, 5-triiodthyronin (T3), vigtig regulator af celleproliferation og differentiering. DIØ1 udtryk er reduceret i den mest almindelige form for nyre neoplasi, klar celle renalcellecarcinom (ccRCC). MikroRNA’er er små, ikke-kodende RNA, der regulerer genekspression på posttranskriptionel niveauer. Formålet med denne undersøgelse var at analysere potentialet regulering af DIØ1 udtryk ved microRNA i ccRCC. Bioinformatik analyse viste, at 3’UTR af den humane

DIØ1

gentranskriptet indeholder MIR-224 og MIR-383 målsteder, som er konserveret på tværs pattedyrarter. Semi-kvantitativ real-time PCR blev anvendt til at analysere ekspressionen af ​​MIR-224 og MIR-383 i 32 prøver af ccRCC tumorer (T) og i 32 matchet kontrol (C) prøver. Vi observerede statistisk signifikant (p = 0,0002) mere end fire gange stigning i MIR-224-ekspression og næsten to gange stigning i MIR-383-ekspression i prøver T sammenlignet med prøver C. Tumor specifikke ændringer i ekspression af MIR-224 negativt korreleret med ændringer i DIØ1 udtryk og intracellulær T3 koncentration. Transfektion af HeLa-cellelinje med MIR-224 og MIR-383 undertrykte aktivitet af en luciferase reporter indeholdende 3’UTR af

DIØ1

. Dette blev afskaffet, da konstruktioner muteret på miR-224 og miR-383 målstederne blev brugt i stedet, hvilket indikerer, at miR-224 og miR-383 direkte binder til

DIØ1

3’UTR. Endelig induceret ekspression af miR-224 i Caki-2 celler resulterede i signifikant (p 0,01) reduktion af

DIØ1

mRNA. Denne undersøgelse giver en roman miRNA-medieret reguleringsmekanisme af

DIØ1

udtryk i ccRCC

Henvisning:. Boguslawska J, Wojcicka A, Piekielko-Witkowska A, Master A, Nauman A (2011) MiR -224 Mål 3’UTR af type 1 5′-iodothyronin deiodinase Muligvis Bidrag til Tissue Hypothyroidisme i nyrekræft. PLoS ONE 6 (9): e24541. doi: 10,1371 /journal.pone.0024541

Redaktør: Marian Ludgate, Cardiff University, England

Modtaget: 12. maj 2011; Accepteret: August 12, 2011; Udgivet 2. september, 2011

Copyright: © 2011 Boguslawska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af den polske stat udvalg for Scientific Research Grants (NN 401 071 939, NN 401 0386 37), og Medical Centre of Postgraduate Uddannelse Grant (501-2-1-24-06 /08) (til AN). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Thyreoideahormoner: 3,5,3′-L-triiodothyronine (T3) og thyroxin (T4), spiller en vigtig rolle for vækst, udvikling, differentiering og regulering af metaboliske veje i celler. Menneskelig type 1 iodothyronin deiodinase (DIØ1), produkt af

DIØ1

gen katalyserer to typer deiodination reaktion, en ydre ring (5′-deiodination – 5’d) og en indre ring (5-deiodination – 5D). Disse processer resulterer henholdsvis i aktiveringen og inaktiveringen af ​​skjoldbruskkirtelhormoner (1). DIØ1 er en selenoenzyme udtrykt primært i lever, nyre, thyroid, og hypofyse. Tidligere rapporter har vist, at ekspression af dette enzym er forstyrret i forskellige typer af cancer. For eksempel,

DIØ1

mRNA og aktivitet er faldet i papillær skjoldbruskkirtlen carcinom (2-5) og steg i follikulært adenom og follikulært skjoldbruskkirtlen karcinom (2). I tidligere værker viste vi nedsat ekspression af

DIØ1

mRNA og aktivitet (6), og forstyrret alternativ splejsning af

DIØ1

præ-mRNA i klar celle renalcellecarcinom (ccRCC) (7).

DIØ1

ekspression er også blevet foreslået som en differentieringsmarkør af cancerceller (8, 9).

ccRCC repræsenterer den mest almindelige nyrecancer histologi, der repræsenterer 75% af primær malignitet i nyrerne ( 10, 11). Den almindeligt anvendte behandling er kirurgisk resektion mens kemo- og strålebehandling forbliver ineffektive. Ingen af ​​de adskillige foreslåede molekylære markører er blevet godkendt til klinisk anvendelse (10).

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodende RNA’er der styrer generne ekspression ved helt eller delvist komplementært binding til 3′-utranslaterede region af mål-mRNA (12, 13) bevirker nedbrydning af mRNA’et eller mere almindeligt, blokering oversættelse (14-16). Tidligere undersøgelser har vist, at miRNA spiller vigtige roller i essentielle processer, såsom differentiering, proliferation og apoptose (17, 18). I øjeblikket nye resultater viste, at miRNA er involveret i kræft patogenese. Hyppige ændringer af miRNA ekspression er blevet fundet i en række humane maligniteter såsom skjoldbruskkirtlen (19), lunge (20), pancreas (21), colon (22), bryst (23), leveren (24), prostata (25) eller andre faste tumorer (26, 27). Forskellige undersøgelser har identificeret paneler af microRNA, der udtrykkes differentielt mellem normalt nyrevæv og tumor eller mellem histologiske undertyper af renal tumor (28-33). MicroRNA udtryk profilering har vist forskellige kliniske anvendelser til diagnose, prognose og prædiktive formål (34, 35). Adskillige miRNA funktion som onkogener eller tumorsuppressorer, og flere gener kodende for miRNA er placeret i genomiske regioner, der er involveret i cancere (36).

Vores tidligere resultater (6) vist, at DIØ1 aktivitet dårligt korrelerer med dets mRNA niveau hos raske nyrevævet. Denne observation tyder på betydelig posttranskriptionel regulering af

DIØ1

udtryk, der kunne være medieret af miRNA. Derfor er formålet med dette arbejde var at undersøge potentialet

DIØ1

regulering af miRNA og at afgøre, om deregulering af DIØ1 i ccRCC kan skyldes ændrede handlinger miRNA.

Resultater

Computational forudsigelse af miRNA binding til

DIØ1

3’UTR

for at identificere de formodede miRNA målretning af 3’UTR af

DIØ1

mRNA, vi brugte beregningsmæssige programmer, Targetscan, PicTar, miRBase og MIRANDA. De 1087 nukleotider i 3’UTR af

DIØ1

blev screenet for komplementaritet til frø sekvenser af kendte miRNA. Kun miRNA identificeret ved mindst to af fire uafhængige bioinformatik fremgangsmåder blev overvejet til yderligere analyse. Vi identificerede 7 potentielle miRNA rettet 3’UTR af menneskelig

DIØ1

(tabel 1): miR-224, miR-383, miR-610, miR-659, miR-637, miR-1202 og miR- 1266.

miR-224 og miR-383 er overudtrykt i ccRCC

i indledende undersøgelser, ved hjælp af semi kvantitativ real-time PCR (SQ-PCR), vi bestemt den relative ekspression af 7 kandidat miRNA i ccRCC og parrede match kontrolprøver fra 32 patienter, der anvender universel primer UniAmpHindIII (37) med sekvenshomologi med udhæng af primere, der anvendes i revers transkription og miRNA-specifikke primere (sekvenser er vist i Supplerende data i tabel S2). Vi observerede forskellige udtryk for miR-224 og miR-383, mens ekspressionen af ​​de fem andre ansøgerlande miRNA: MIR-610, MIR-637, mir-659, har miR-1202 og miR-1266 ikke signifikant forskellig mellem ccRCC og kontrol væv (Figur S1, Supplemental data).

induceret ekspression af miR-224 og miR-383 i ccRCC blev bekræftet i en bestemt TaqMan microRNA analyse. Disse undersøgelser afslørede statistisk signifikante (p = 0,0002) i løbet fire gange stigning i ekspressionen af ​​MIR-224 og næsten to gange stigning (p = 0,0236) i ekspressionen af ​​MIR-383, i prøver T sammenlignet med kontrolprøver C (figur 1 ). Gennemsnitlig fold skift af miR-224 og miR-383 blev analyseret i forskellige tumor sorteringer men ikke afhænge af differentiering kvalitet af tumor prøve. Imidlertid betyder gange ændring af MIR-224 tendens til at falde, når differentieringsfaktorer kvaliteter steg fra G1 til G3 (figur 1).

A. Øget miR-224-ekspression i ccRCC tumorprøver (T) sammenlignet med kontrolprøver (C). Udtrykket er vist i procent af kontrol C. B. Mean fold T: C ændring af ekspression af MIR-224 224 i prøver opdelt efter tumor differentiering kvaliteter (G1, G2, G3). C. Øget MIR-383 ekspression i ccRCC tumorprøver (T) sammenlignet med kontrolprøver (C). Udtrykket er vist i procent af kontrol C. D. Mean fold T: C ændring af ekspression af MIR-383 224 i prøver opdelt efter tumor differentiering kvaliteter (G1, G2, G3). Data er givet som middel ± SEM n = 32 for T, n = 32 for C (i A og C), n = 11 for G1, n = 11 for G2, n = 10 for G3 (i B og D). Statistisk analyse blev udført under anvendelse af parrede

t

-test til at sammenligne prøver C og T (i A og C) eller ANOVA til sammenligning G1, G2, og G3 prøver (i B og D) * p 0,05, * ** p. . 0.001

således blev forstyrret udtryk for miR-224 og miR-383 i ccRCC bekræftet af to forskellige analytiske tilgange

miR-224 negativt korrelerer med DIØ1 og T3 niveauer i ccRCC

SQ-PCR-analyse afslørede 2,7 gange nedregulering af

DIØ1

mRNA i 32 parrede tumor og kontrol vævsprøver (p = 0,0009), hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere rapporter ( 6) (figur 2). Som vist i figur 2, blev der observeret statistisk signifikant negativ korrelation mellem miR-224 og

DIØ1

mRNA tumor-specifikke ændringer udtryksformer (Spearman r

s = -0,556 ved p = 0,001). I modsætning hertil blev der ikke korrelation observeret for miR-383 og

DIØ1

. Desuden Western-blot-analyse udført på elleve parrede prøver af ccRCC og normal nyrevæv afslørede tabet af DIØ1 protein (figur 2B).

A. Angivelse af

DIØ1

mRNA i vævsprøver. n = 32 for T og n = 32 for C. Udtrykket er vist i procent af kontrol C. Plottet viser medianværdier med 95% CI, da data ikke var normalt fordelt. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Wilcoxon parret test til sammenligning prøve C og T. *** P 0,001. B. Western-blot af DIØ1 udført på par-matchet kontrol-ccRCC prøver. p-actin-ekspression blev anvendt som en intern kontrol. Fire repræsentative kontrol (C) og tumor (T) prøver er vist. C og D. Scatter plots af T: C forhold på

DIØ1

mRNA

versus

T: C miR-224 (C) og T: C miR-383 (D) udtryk nøgletal. Ikke-parametrisk Spearman rang korrelation analyse blev udført på data fra 32 par af kontrol- og tumor- vævsprøver. p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. E og F. scatter plots af T3 koncentration T: C-forhold versus T: C miR-224 (E) og miR-383 (F) udtryk nøgletal. Pearson korrelation analyse blev udført på data fra 11 par af kontrol- og tumor- vævsprøver. p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

DIØ1 er en regulator af thyreoideahormon biotilgængelighed.. I vores seneste undersøgelse fandt vi, at T3-koncentrationen blev reduceret i ccRCC tumorer sammenlignet med par matchede kontroller. For at kontrollere om miR-224-medieret nedregulering af DIØ1 påvirker DIØ1 aktivitet produkt, T3, vi analyserede sammenhængen mellem tumor-specifikke ændringer af miR-224 og T3 niveauer. T3 niveau blev analyseret i 11 parvist sammensat ccRCC og kontrolprøver der blev anvendt til DIØ1 Western-blot-analyse. T3-koncentrationen blev vurderet som tidligere (37) beskrevet. Vi fandt en statistisk signifikant (Pearson r = -0,624, p = 0,04) negativ korrelation mellem T: C forhold mellem miR-224 og intratumoral T3 (Fig. 2). miR-383 ændringer gjorde heller korrelerer med T3.

Sænket intratumorale T3 koncentrationer kan medføre ikke blot fra nedsat udtryk for DIØ1 men også fra øget aktivitet af type 3 deiodinase (DIØ3), som er en skjoldbruskkirtel hormon inaktiverer enzymet. Brug Q-PCR, vi analyserede udtryk for DIØ3 mRNA i 11 par-matchede ccRCC og kontrolprøver. DIØ3 mRNA kunne ikke påvises i alle de analyserede prøver (resultater ikke vist). Vi bekræftede således, at faldet intratumorale T3 koncentrationer skyldes sænket DIØ1 udtryk.

Transfektion med miR-224 reducerer ekspressionen af ​​endogene

DIØ1

For at bestemme den funktionelle effekt af miR -224 og mIR-383 på endogene

DIØ1

mRNA blev Caki-2-celler transficeret med præ-mIR-224, præ-mIR-383 (microRNA forstadier), anti-mIR-224, anti-miR- 383 (microRNA-hæmmere), eller scrambled kontrol. Vellykket transfektion blev bekræftet i SQ PCR-analyse af en stor induktion af miR-224 og miR-383 efter transfektion med microRNA prækursorer og signifikant fald i miRNA udtryk, når hæmmere blev brugt (figur 3).

A. Ekspression af

DIØ1

mRNA i Caki-2-cellelinien. Celler blev transficeret med 37,5 pmol præ-Mirs, anti-Mirs eller krypteret pre-miR (negativ kontrol); efter 48 h totalt RNA blev ekstraheret til efterfølgende SQ-PCR-analyse af

DIØ1

niveau. Udtrykket er vist i procent af kontrol (celler transficeret med scrambled microRNA). Data er givet som middelværdi ± SEM. Data blev analyseret ved ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. ** P 0,01. B og C. Niveauet af MIR-224 (B) og MIR-383 (C) i celler transficeret med præ-Mirs eller anti-Mirs. Data er præsenteret som procent af kontrol (celler transficeret med scrambled microRNA). Data er givet som middelværdi ± SEM Værdier for miRNA blev normaliseret til U6-gen. Data blev analyseret ved ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. *** P. 0,001

mRNA niveauer af

DIØ1

blev målt ved SQ-PCR og en betydelig reduktion (56%, p 0,01) i

DIØ1

transkript niveau blev observeret efter indførelsen af ​​præ-mIR-224. præ-MIR-383 havde ikke denne virkning (figur 3). Transfektion af Caki-2-celler med anti-MIR-224 resulterede i forøgelse af

DIØ1

udtryk, med 45%, p 0,01, sammenlignet med scrambled kontrol. Vi har ikke overholder denne overekspression når celler blev transficeret med anti-miR-383 (figur 3).

Disse data viser, at endogene

DIØ1

mRNA-ekspression i Caki-2 celler moduleres af miR -224.

3’UTR af

DIØ1

er et direkte mål for miR-224 og miR-383

Computational analyse af

DIØ1

3 ‘UTR med TargetScan5.1 afslørede to formodede bindingssteder for miR-224 og miR-383, som ligger ved nukleotider 1788-1794 og 898-904 af

DIØ1

udskrift (NM_00792.5), (figur S2 i Supplerende data). Disse to steder blev konserveret på tværs pattedyrarter. For at undersøge den direkte interaktion mellem MIR-224, MIR-383 og

DIØ1

transkript vi klonet 3’UTR af

DIØ1

nedstrøms for luciferasereportergenet i pGL3-kontrol vektor – (DIO1-3’UTR). Kontrol plasmid, hvori DIØ1 3’UTR blev indsat i en omvendt orientering (DIØ1-rev3’UTR) blev også konstrueret. Samtidig skabte vi to ekstra reporter konstruerer, hvor regionerne bevaret målretning var specifikt muteret, at afskaffe binding af miRNA (figur 4). HeLa-cellelinie, der udviser lav endogen ekspression af

DIØ1

blev anvendt til transfektionseksperimenter. Cellerne blev cotransficeret med opnåede konstruktioner og forløbere for microRNA: pre-miR-224, præ-miR-383 eller kontrol (krypteret miRNA). I HeLa-celler forbigående transficeret med

DIØ1

-3’UTR konstruktion og miRNA forstadier, en signifikant hæmning af luciferaseaktivitet blev observeret. Både MIR-224 og MIR-383 forårsagede fald i luciferaseaktivitet med omkring 45% og 25%, sammenlignet med kontrollen scrambled miRNA. Både før miRNA undladt at udøve en betydelig indflydelse på

DIØ1

-rev3’UTR og den tomme pGL3-Control vektor (figur 4).

A.

DIØ1

3’UTR klonet nedstrøms for luciferase i pGL3-Control vector. Den vildtype og muteret 3’UTR af

DIØ1

med frø-regionen (fed) og basesubstitutioner (stor skrift og understreget) afskaffelse binding af en bestemt miRNA (verificeret

i silico

) nedenfor præsenteres. To typer 3’UTR mutanter blev konstrueret:

DIØ1

-3’UTR224mut og

DIØ1

-3’UTR383mut. B. Dual luciferase assay. Den relative luciferaseaktivitet af konstruktioner med 3’UTR af

DIØ1

:

DIØ1

-3’UTR,

DIØ1

-rev3’UTR,

DIØ1

-3’UTR224mut,

DIØ1

-3’UTR383mut og pGL3-Control i overværelse af præ-miRNA eller krypteret pre-miRNA (negativ kontrol). Data er udtrykt som middelværdier ± SEM og er vist i procent af kontrol (celler transficeret med scrambled microRNA). Hver søjle repræsenterer værdier fra tre uafhængige forsøg, målt i triplikater. Den relative aktivitet af Firefly luciferase ekspression blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Data blev analyseret ved ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. . ** P 0,01

luciferaseaktiviteten af ​​reporter konstruerer:

DIØ1

-3’UTR224mut og

DIØ1

-3’UTR383mut, hvor målrettet sites anerkendt af microRNA var muteret, var upåvirket ved transfektion med præ-mIR-224 eller præ-mIR-383, (figur 4). Denne observation bekræftede specificiteten af ​​virkningen af ​​begge microRNA’er som mutation i anerkendelse site skal forhindre miRNA binding til 3’UTR. Hvad er mere vigtigt, har mutation i anerkendelse stedet for en microRNA ikke påvirke binding af den anden analyserede miRNA. Luciferaseaktiviteten i celler transficeret med

DIØ1

-3’UTR383mut blev hæmmet med 40% efter præ-miR-224 kommer, mens transfektion med

DIØ1

-3’UTR224mut og præ-miR- 383 resulterede i ~23% fald i luciferaseaktivitet (figur 4).

samlet set viser disse data, at 3’UTR af

DIØ1

indeholder specifikke bindingssteder for microRNA miR-224 og miR-383.

diskussion

i dette studie har vi vist for første gang, at type 1 iodothyronin deiodinase udskrift er en direkte funktionel mål for microRNA miR-224. Binding af miR-224 til

DIØ1

3’UTR resultater i nedregulering af endogen

DIØ1

udtryk i renale cancerceller. Desuden

DIØ1

3’UTR indeholder specifikke konserverede bindingssteder for miR-224 og miR-383, som vist i luciferase reporter assays. Begge microRNA er markant overudtrykt i klar celle nyrekræft og eventuelt tegner sig for tab af

DIØ1

udtryk i tumor. Dette er blevet støttet af den negative korrelation mellem tumor-specifikke ændringer i miR-224 og

DIØ1

mRNA-niveauer og tab af DIØ1 protein i ccRCC prøver. Desuden tumor-specifikke ændringer i koncentrationen af ​​produkt af DIØ1 aktivitet, T3, korrelerer negativt med ændringer af miR-224 udtryk. Disse resultater giver et stærkt bevis for en ny mekanisme for

DIØ1

regulering.

De mekanismer, der regulerer

DIØ1

udtryk er dårligt forstået. I vores tidligere undersøgelser observerede vi manglende sammenhæng mellem DIØ1 protein og mRNA niveau ccRCC (6), der foreslog den mulige inddragelse af posttranskriptionel mekanismer, såsom microRNA-afhængig regulering. I den foreliggende undersøgelse observerede vi næsten 3 gange reduktion af

DIØ1

mRNA-ekspression mens DIØ1 protein blev tabt i tumorprøver. En interessant observation gjort i den foreliggende undersøgelse er, at ekspressionen af ​​MIR-224 har tendens til at ændre sig med tumor differentieringsfaktorer kvaliteter og er højest i G1 og lavest i G3 (fig. 2). Selv om disse ændringer mellem de respektive tumor differentiering kvaliteter er ikke statistisk signifikante, de kan muligvis foreslå, at som tumor fremskridt virkningen af ​​miR-224 på

DIØ1

udtryk sænker og måske andre posttranskriptionel mekanismer er involveret. Som vi tidligere har vist, anden mekanisme bidrager til nedsat DIØ1 ekspression i ccRCC er dens forstyrret alternativ splejsning resulterer muligvis fra ændringer i ekspression af splejsningsfaktorer (7, 38). I forsøg udført i Caki-2-celler, havde MIR-383 ikke påvirker ekspressionen af ​​endogene DIØ1. Dette kan tyde på, at miR-383 virker på et posttranskriptionel niveau, der forårsager oversættelse blokering snarere end nedbrydning af

DIØ1

mRNA. Den anden mulighed er, at de andre faktorer (herunder miR-224) kan udøve stærkere effekt på DIØ1 udtryk i ccRCC. Denne ide understøttes af resultaterne af luciferease eksperimenter, hvor inducerede MIR-383-ekspression resulterede i kun 25% reduktion af luciferase aktivitet sammenlignet med virkningen af ​​MIR-224 som forårsagede 45% nedregulering af ekspression. Luciferase eksperimenter bekræfter hypotesen om, at bindingen af ​​miR-383 til

DIØ1

3’UTR resultater i oversættelse blokering, som luciferaseaktivitet er en direkte konsekvens af de faktiske luciferase protein niveauer.

Siden ændret udtryk for miR-224 og miR-383 blev observeret i tumorer af væv, der udtrykker type 1 iodothyronin deiodinase det tyder på, at disse tumorer kan også præsentere forstyrret udtryk for

DIØ1

. Faktisk, i papillære skjoldbruskkirtelkræft, ekspression af MIR-224 blev signifikant forhøjet (39), mens vore undersøgelser viste, at i denne cancer, ekspression af

DIØ1

reduceres (3). Omvendt i brystkræft, er miR-383 tabt (40), mens

DIØ1

udtryk øger (41). Hvorvidt forringet udtryk for

DIØ1

virkelig skyldes ændrede miR-224 og MIR-383 niveauer i disse kræftformer skal evalueres ved separate undersøgelser.

Betydningen af ​​vores resultater kommer fra den rolle, DIØ1 i cellulær fysiologi. DIØ1 er et enzym der regulerer biotilgængelighed af skjoldbruskkirtelhormoner. For nylig blev det foreslået, at DIØ1 ikke bidrager til cirkulerende T3 niveau, men snarere fungerer som en ådselsæder enzym involveret i iodid genbrug (42). Dog kan den mulighed, at DIØ1 bidrager til lokalt syntetiseret T3 i DIØ1 udtrykker væv ikke udelukkes, da det tidligere blev foreslået (43, 37). Således kan microRNA regulerer DIØ1 udtryk i ccRCC har potentiale indflydelse på intratumorale thyroideahormonniveauerne. Således som vi demonstrere i den foreliggende undersøgelse, tumor-specifikke ændringer i intracellulær T3 koncentration korrelerer med ændringer af miR-224-ekspression. Interessant nok i vores seneste undersøgelse fandt vi, at udskrift af thyreoideahormon receptor beta gen (

THRB

) er også et mål for microRNA-afhængig regulering (37). miR-204 er overudtrykt i ccRCC og resultater ved samtidig nedregulering af

THRB

udtryk. Disse resultater sammen med resultaterne af den foreliggende undersøgelse tyder på, at microRNA muligvis kan bidrage til væv hypothyroidisme i ccRCC resulterer i nedregulering af vigtige gener af thyreoideahormon vej,

THRB

og

DIØ1

og følgelig , hvilket fører til reduktionen af ​​intratumorale T3 niveau. Dette er en vigtig observation, idet flere undersøgelser vist, at THRB kan fungere som en tumorsuppressor og at hypothyroidisme kan påvirke tumorvækst (44-48). Således kan microRNA-afhængig regulering af intracellulær skjoldbruskkirtlen tilstand muligvis har potentiale til at påvirke neoplastisk proces. Interessant, kan dette være en mere generelt fænomen i tumorer med forstyrret udtryk for

DIØ1

THRB

. I vores nylige undersøgelse flere microRNA der blev opreguleret i papillære skjoldbruskkirteltumorer (PTC) blev vist til direkte målrette THRB transkript resulterer i signifikant nedregulering af dets ekspression (49). Det ville være interessant at undersøge, om ekspressionen af ​​microRNA rettet mod

DIØ1

også forstyrret i PTC tumorer. Vores tidligere undersøgelser viste, at tab af DIØ1 ekspression i PTC er ledsaget af manglende sammenhæng mellem mRNA og proteinekspression (3). Dette tyder på mulig posttranskriptionel regulering herunder microRNA engagement. om svækket

DIØ1

udtryk i PTC resultater fra microRNA-medieret deregulering skal dog verificeres af yderligere undersøgelser.

Disturbed microRNA ekspression i ccRCC er allerede blevet rapporteret i andre undersøgelser. Interessant, blandt microRNA forskelligt udtrykt i kontrol- og tumorprøver miR-224 er gentagne gange blevet fundet af uafhængige undersøgelser (30, 33, 50). Dette antyder den mulige anvendelse af miR-224 som en markør differentiere ccRCC tumorer fra raske væv. Vedrørende MIR-383, blev det rapporteret som nedreguleret i hepatocellulært carcinom (51), bryst- og ovariecancer, melanom (40), akut myeloid leukæmi (52) og tumorer i centralnervesystemet (53). Således er vores arbejde er den første, som viser opregulering af miR-383 i kræft. Hvorvidt dette er en bestemt funktion af nyre neoplasi mangler at blive bekræftet af fremtidige eksperimenter. Begge microRNA, miR-224 og miR-383 menes at være impliceret i kontrol af proliferation eller apoptose. MIR-224 blev påvist at øge apoptotisk celledød og proliferation i hepatocellulært carcinom (54), medens overekspression af MIR-383 inhiberede proliferation af testikulære embryonale carcinomceller (55). Spørgsmålet om, hvorvidt miR-224 og miR-383 er involveret i ccRCC spredning venter fremtidige undersøgelser

Sammenfattende vi demonstreret, at

DIØ1

3’UTR er målrettet efter to microRNA:. MiR-224 og mIR-383. miR-224 medierer tab af DIØ1 i nyrekræft, hvilke resultater i nedsat intratumoral T3 koncentration. Disse resultater giver et stærkt bevis for en ny mekanisme regulerer ekspressionen af ​​type 1 iodothyronin deiodinase. Tidligere rapporter viste, at forstyrret udtryk for THRB, andet gen af ​​thyreoideahormon vej, observeret i ccRCC, også kan skyldes microRNA-afhængige deregulering. Sammen disse resultater tyder på, at den nye klasse af små, ikke-kodende RNA muligvis kan bidrage til intracellulær hypothyreose i ccRCC.

Materialer og metoder

Vævsprøver og cellelinier

Vævsprøver blev opnået med tilladelse fra bioetik Komité Medical Centre of Postgraduate Uddannelse i Warszawa fra patienter med klar celle renalcellecarcinom (32 patienter). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, der deltager i denne undersøgelse. Prøver blev opdelt i to grupper: tumorprøver (n = 32, T) og kontrolprøver (parret normalt væv fra den modsatte pol af den maligne nyre uden histologiske tegn på tumor; n = 32, C). Klar celle renalcellecarcinom blev diagnosticeret histologisk ifølge WHO kriterier (56). Tumorer blev inddelt i tre grupper afhængig af graden af ​​differentiering:. G1 (godt differentieret), G2 (mellemliggende kvalitet af differentiering), G3 (dårligt differentierede kræftformer)

Livmoderhalskræft (HeLa) og klar celle renal celle cancer (Caki-2) cellelinier anvendt i dette studie blev indkøbt fra American Type Culture Collection, (USA) og dyrket i henhold til ATCC-protokollen. Cellerne blev podet i 12 brønds-dyrkningsplader i densitet 5 × 10

4 (Caki-2) eller 1 x 10

5 (HeLa) celler /brønd 24 timer før transfektion.

luciferasereporteren Konstruktioner

1023 bp fragment af

DIØ1

blev opformeret ved anvendelse cDNA fra HeLa-cellelinje (primere

DIØ1

-3’UTR F og R, tabel S1, Supplemental data), klonet i Xbal-site umiddelbart nedstrøms for stopkodonen i pGL3-Control Firefly Luciferase reporter vektor (Promega, USA), sekventeret og benævnt

DIØ1

-3’UTR eller

DIØ1

– rev3’UTR, afhængigt af orienteringen af ​​det klonede insert. Den omvendt indsat

DIØ1

-rev3’UTR blev anvendt som negativ kontrol vektor. Site-directed mutagenese af miR-224 og miR-383 målområder: GTGACTT af miR-224 inden for nt 1788-1794 og TCTGATCT af miR-383 inden for nt 898-904 i

DIØ1

3’UTR var udført under anvendelse af Quick change-mutagenese (Stratagene, Tyskland). Primere Mut224 F /R og Mut383 F /R (tabel S1, Supplerende data) og

DIØ1

-3’UTR plasmid som skabelon blev anvendt. To konstruktioner:.

DIØ1

-3’UTR224mut og

DIØ1

-3’UTR383mut blev opnået

Sekventering reaktion blev udført ved hjælp BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA).

celler transfektion og luciferase assay

Caki-2-celler blev podet ved 0,5 x 10

5 celler pr 12-brønd skål og transficeret 24 timer senere under anvendelse af lipofectamin 2000 reagens (Invitrogen, USA) som beskrevet af producenten med 37,5 pmol af miRNA forstadier: pre-miR-224 og præ-miR-383 (pre-miR

™ miRNA Precursor Molecule, Ambion, USA), miRNA-hæmmere: anti -miR-224 og anti-miR-383 (anti-miR ™ miRNA Inhibitor Molecule, Ambion, USA) eller kontrol scrambled microRNA (Negativ microRNA kontrol, Ambion, USA). Celler blev høstet efter 48 h for RNA-ekstraktion.

miRNA forstadier er syntetiske RNA rækkehuse, der efterligner endogene miRNA, mens hæmmere har en sekvens komplementær til modne miRNA og funktion ved sekvestrering /nedværdigende endogene miRNA.

For reportergenassays blev HeLa-celler podet ved 1 x 10

5 i plader med 12 brønde og 24 timer senere, cotransficeret med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, USA). Hver cotransfektion reaktion indeholdt 100 ng pRL-TK vektor (Promega, USA), der udtrykker Renilla luciferase, 1 ug PGL-3’UTR vektorer og 37,5 pmol præ-Mirs eller krypteret microRNA. Efter 48 timer blev cellerne lyseret, og luciferaseaktivitet blev analyseret i dual-luciferase assay (Promega, USA) under anvendelse af en Synergy2 luminometer (BioTek, USA). Ildflueluciferase aktivitet blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. I alle eksperimenterne blev transfektion og luciferaseassays udført i triplikater.

RNA-isolering og revers transkription

Totalt cellulært RNA blev isoleret som tidligere beskrevet (37). Revers transkription blev udført under anvendelse RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Litauen). For revers transkription, blev 200 ng total RNA bruges med Random Hexamer primere eller specifikke stem-loop primere med 5′-overhæng (tabel S2, Supplerende data) for microRNA.

cDNA for miR-224 og miR- 383 blev også syntetiseret med specifikke miRNA primere fra TaqMan MicroRNA Analyser (Applied Biosystems, USA) og reagenser fra TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, USA).

SQ-PCR

DIØ1

ekspressionsanalyse i Caki-2-celler blev udført under anvendelse af DNA SYBR Green i Master (Roche Diagnostics, Germany) in triplo i overensstemmelse med producentens protokoller. SQ-PCR-reaktion blev udført under følgende betingelser: 95 ° C i 10 min, 45 cyklusser:. 95 ° C, 15 s; 57 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s, 68 ° C, 15 s; efterfulgt af smeltekurveanalyse: 95 ° C, 5 min .; 65 ° C, 1 min .; kontinuerlig læsning af fluorescens fra 65 ° C til 97 ° C med 0,11 ° C /s ramp rate og 5 erhvervelser pr hver ° C. Resultaterne blev normaliseret til ekspressionen af ​​18sRNA host-genet

RN18S1

.

DIØ1

DIØ3

ekspressionsanalyse i vævsprøver blev udført som tidligere (37) beskrevet. Sekvenserne af primerne er vist i tabel S1, (Supplemental data).