PLoS ONE: Hæmning af StearoylCoA desaturase-1 inaktiverer Acetyl-CoA-carboxylase og forringer spredning i cancerceller: rolle AMPK

Abstrakt

Kræftceller aktiverer biosyntesen af ​​mættede fedtsyrer (SFA) og monoumættede fedtsyrer (MUFA) for at opretholde en stigende efterspørgsel efter fosfolipider med passende acyl sammensætningen under celle replikation. Vi har tidligere vist, at en stabil knockdown af stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1), den vigtigste Δ9-desaturase, som omdanner SFA ind MUFA, i cancerceller nedsætter hastigheden af ​​lipogenese, reducerer proliferation og in vitro invasivitet og dramatisk svækker tumordannelse og vækst. Her rapporterer vi, at farmakologisk inhibering af SCD1 med en hidtil ukendt lille molekyle i cancerceller fremmet aktiveringen af ​​AMP-aktiveret kinase (AMPK) og den efterfølgende reduktion af acetylCoA-carboxylase-aktivitet, med en ledsagende inhibering af glucose-medieret lipogenese. Den farmakologiske hæmning af AMPK faldet yderligere spredning af SCD1-udtømte celler, hvorimod AMPK aktivering restaureret proliferation at kontrollere niveauer. Tilsætning af suprafysiologiske koncentrationer af glucose eller pyruvat, slutproduktet af glycolyse, ikke afhjælpe det lave proliferationshastighed af SCD1-ablateret cancerceller. Vore data antyder, at cancerceller kræver aktive SCD1 at styre hastigheden af ​​glucose-medieret lipogenese, og at når SCD1 aktivitet er nedsat celler nedregulerer SFA syntese via AMPK-medieret inaktivering af acetyl-CoA-carboxylase, hvilket forhindrer de skadelige virkninger af SFA akkumulering.

Henvisning: Scaglia N, Chisholm JW, Igal RA (2009) Hæmning af StearoylCoA desaturase-1 inaktiverer acetyl-CoA-carboxylase og forringer spredning i cancerceller: rolle AMPK. PLoS ONE 4 (8): e6812. doi: 10,1371 /journal.pone.0006812

Redaktør: Marcelo Bonini, National Institutes of Health (NIH) /National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS), USA

Modtaget: 5 maj 2009; Accepteret: 4. august 2009. I Udgivet: 27 August, 2009

Copyright: © 2009 Scaglia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Charles og Joanna Busch Foundation og SEBS /NJAES, Rutgers University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræftceller vise en radikalt ændret stofskifte, der fremmer deres fortsatte spredning. Som en del af den metaboliske skift mod makromolekylær syntese til støtte cellereplikation, cancerceller aktiverer biosyntesen af ​​mættede fedtsyrer (SFA) og monoumættede fedtsyrer (MUFA) for at opretholde en stigende efterspørgsel efter phospholipider af passende acyl sammensætning til membran biogenese. Således flere kritiske enzymer involveret i de novo-fedtsyresyntese er blevet vist, at være overudtrykt i ondartede celler: ATP-citratlyase, der kræves til produktion af cytosolisk acetylCoA [1], acetylCoA-carboxylase (ACC), det enzym, der katalyserer syntesen af malonylCoA, det første bindende trin i syntesen af ​​fedtsyrer [2], [3], og fedtsyresyntase (FAS), som syntetiserer SFA [2]. Betydningen af ​​fedtsyresyntese for cancercelleproliferation og overlevelse fremhæves af det faktum, at hæmning af nogen af ​​disse enzymer fører til stop i celleproliferation og forøget celledød [4] – [9]. Men på trods af overaktivering af tandem af biosyntetiske enzymer, der i sidste ende gør SFA, rigelige mængder MUFA findes typisk i cancerceller [10] – [13], hvilket tyder på, at biosyntesen af ​​MUFA er påkrævet for at sikre cancercelleproliferation og overlevelse.

Mammale stearoylCoA desaturaser (SCD) er mikrosomale enzymer, der katalyserer Δ9-desaturering mættet acylCoAs til dannelse monoumættede derivater [14]. Ekspressionen af ​​SCD1, den vigtigste SCD isoform, er steget i en række humane cancere, kemisk inducerede tumorer, såvel som i onkogen-transformerede celler [1], [13], [15] – [18]. Vi har vist, at SCD1 modulerer ikke kun indholdet af MUFA i cancerceller, men også den samlede proces af lipogenese [19]. Bemærkelsesværdigt, ablation af SCD1 ekspression reducerer cancercelleproliferation og in vitro invasivitet og dramatisk svækker tumordannelse og vækst [19], [20]. Vi har også fundet, at aktiv SCD1 kan være nødvendig for neoplastiske celler at overleve en lipotoxic stress siden SCD1 knockdown stigninger basal apoptose og sensibiliserer cellerne over for de cytotoksiske virkninger af overskydende SFA [19]. SCD1 er også blevet identificeret fra et siRNA biblioteket som et gen, hvis undertrykkelse svækker human cancer celle overlevelse, yderligere støtte en funktionel forbindelse mellem SCD1 og kræft cellevækst [21]. Trods dette voksende mængde af information, de indviklede mekanismer, hvormed SCD1 samtidigt modulerer lipid metabolisme og de biologiske funktioner i kræftceller er ikke kendt.

Processen med lipogenese i pattedyrceller reguleres af Akt og AMP- afhængig proteinkinase (AMPK), to store signalproteiner, der styrer flere kritiske biosyntetiske og kataboliske reaktioner. Akt er en kraftfuld inducer af glucose-medieret lipogenese i cancerceller, hovedsagelig regulere aktiviteten og transkription af flere enzymer af glykolyse og fedtsyresyntese [22], [23]. Som en del af en tilbagekoblingssløjfe, er aktiviteten af ​​Akt moduleret af niveauet af FAS og SCD1. Det blev observeret, at blokade af FAS aktivitet og ablation af SCD1 udtryk fald Akt phosphorylering og aktivitet i cancerceller [20], [24]. I modsætning hertil AMPK aktivering ved phosphorylering fremmer nedregulering af flere lipogene veje og aktiverer energiforbrugende levere reaktioner såsom fedtsyreoxidation [25]. En væsentlig målsætning af aktiveret AMPK er ACC. Efter phosphorylering af AMPK er ACC aktivitet aftog resulterer i inhibering af de novo-fedtsyrer syntese [26]. Den ledsagende reduktion af malonylCoA niveauer fremmer β-oxidation af fedtsyrer. SFA er også potente allosteriske inhibitorer af ACC, hvilket giver en negativ feedback loop for fedtsyrebiosyntese [27] – [29]. Vi hypotesen, at forhøjet SCD1, ved at konvertere SFA til MUFA, er i stand til at opretholde pathway fedtsyresyntese og lipogenese fuldt aktiveret. Denne betingelse favoriserer kræft cellevækst og proliferation, dermed reducere SCD1 aktivitet skulle forringe disse to biologiske processer

For nylig har flere serier af nye Δ9-desaturase selektive små molekyler hæmmere blevet offentliggjort [30] – [32]. . En af disse SCD inhibitorer, CVT-11127 (N- (2- (6- (3,4-dichlorbenzylamino) -2- (4-methoxyphenyl) -3-oxopyrido [2,3-b] pyrazin-4 (3H) -y) ethyl) acetamid), er en potent og specifik inhibitor af rotte mikrosomale og HepG2 celle Δ9-desaturering [30], og kan være en potentiel værdifuldt værktøj til at studere reguleringen af ​​cellulære metabolisme og signalveje ved SCD1 aktivitet.

i vores nuværende studier viser vi, at den akutte inhibering af SCD1 aktivitet med CVT-11127, samt den kroniske mangel på SCD1 af stabil gen knockdown, i væsentlig grad hæmmer de novo-fedtsyresyntese fra glucose i humane lunge carcinomceller. Vi rapporterer også, at farmakologisk inhibering af SCD-aktivitet drastisk reduceret cellulær proliferation i kræftceller, hvilket bekræfter, at SCD1 aktivitet er en afgørende forudsætning for cancercellevækst. Desuden observerede vi, at blokaden af ​​SCD1 aktiveret AMPK og inaktiveret ACC resulterer i nedsat lipogenese. I eksperimentelle betingelser der inducerer lipogenese, såsom stimulering af ACC med citrat og inhibering af AMPK, blev et yderligere fald i cellulær proliferation observeret i SCD1-deficiente celler. I modsætning hertil den farmakologiske aktivering af AMPK omvendt celleproliferation til kontrolniveauer. Som helhed, vores data tyder på, at nedregulering af fedtsyre-syntese, når SCD1 aktivitet er lav, kan være en adaptiv beskyttelsesmekanisme for at forhindre de skadelige virkninger af overskydende SFA når dens omdannelse til MUFA er nedsat. Desuden disse resultater fremhæve betydningen af ​​SCD1 i reguleringen af ​​neoplastisk proliferation og stofskifte.

Materialer og metoder

Materialer

A549 humane lunge adenocarcinom celler og WS-1 menneske fibroblaster blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). H1299 humane lungecancerceller og MCF-7 humane brystcancerceller blev generøst tilvejebragt af Dr C. S. Yang og dr Wendie Cohick, Rutgers University, NJ, hhv. Dulbeccos modifikation af Eagles medium (DMEM) med L-glutamin, MEM vitaminblanding og MEM-essentiel aminosyreopløsning var fra Mediatech Cellgro (Manassas, VA, USA). Minimum Essential Medium (MEM) indeholdende Earles salte og L-glutamin, glucose DMEM, phenolrødtfrit MEM, trypsin-EDTA-opløsning og Lipofectamine ™ 2000 transfektionsreagens blev indkøbt fra Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). Varmeinaktiveret føtalt bovint serum, krystalviolet, protease og phosphatase inhibitor cocktail 2, fedtsyrefrit okseserumalbumin, monoklonalt anti β-actin antistof, AICAR, coenzym A, ATP, NADH og dimethylsulfoxid (DMSO) var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Nitrocellulosemembran, HPLC kvalitet opløsningsmidler, phosphatpufret opløsning uden calcium og magnesium og andre cellekultur forsyninger blev opnået fra Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA). Anti phospho-AMPKα (Thr172) og phospho-ACC (Ser79) antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology Inc (Danvers, MA, USA). HRP-konjugeret anti mus og anti-kanin IgG var fra Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA, USA). D- [U-

14C] glucose, blev [1-

14C] stearinsyre og [1-

14C] natriumacetat indkøbt fra American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO, USA ). [Methyl-

3H] thymidin, [2-

3H] deoxyglucose og full-range regnbue molekylvægtmarkøren var fra GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ, USA). Lactat assaykit var fra Eton Biosystems Inc (San Diego, CA, USA). BCA Bradford protein assay kit og super signal West pico chemiluminescerende substrat var fra Pierce (Rockford, IL, USA). Forbindelse C var fra Calbiochem (San Diego, CA, USA).

Cellekultur

WS-1, A549 og MCF-7-celler blev dyrket i MEM og H1299, H460 og MDA-MB -231 celler blev dyrket i DMEM. Medier blev suppleret med 10% FBS, penicillin (100 U /ml), streptomycin (10 ug /ml), 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% MEM vitamin opløsning (vækstmedium). Celler blev dyrket ved 37 ° C, 5% CO

2, og 100% fugtighed.

Cell modeller af SCD1 inhibering

Et stabilt transficeret klonal population af A549-celler, der bærer en antisense-sekvens af det humane SCD1 gen (hSCDas) er tidligere blevet [20] beskrevne. Desuden blev farmakologisk inhibering af SCD-aktivitet vurderes med hidtil ukendte kemiske SCD-inhibitor, CVT-11127 (N- (2- (6- (3,4-dichlorbenzylamino) -2- (4-methoxyphenyl) -3-oxopyrido [2, 3-b] pyrazin-4 (3H) -yl) ethyl) acetamid), hvis syntese og struktur blev beskrevet andetsteds [30]. CVT-11127 blev anvendt i koncentrationer, hvor inhiberingen af ​​SCD1 var større end 95%. Den samlede inkubationstid med SCD-inhibitor var i det mindste til 24 h for give mulighed for en cellepopulation fordobling.

SCD-aktivitet og de novo-fedtsyresyntese

Δ9 desaturaseaktivitet i hele celler blev bestemt som tidligere beskrevet [19]. Kort fortalt blev subkonfluente cellemonolag inkuberet med den angivne koncentration af SCD inhibitor eller DMSO-vehikel i vækstmediet i 24 timer. Seks timer før høst blev cellerne pulseret med [

14C] stearinsyre (0,25 uCi /60 mm petriskål) i dyrkningsmedium indeholdende 0,5% bovint serumalbumin. Totalt cellulært lipider blev ekstraheret ifølge Bligh Dyer [33] og transesterificeret med BF

3 i methanol i 3 timer ved 64 ° C under nitrogenatmosfære. Methylesterne blev adskilt ved argentation tyndtlagskromatografi (TLC) ved at følge fremgangsmåden beskrevet af Wilson og Sargent [34], og under anvendelse af et opløsningsmiddel fase bestående af hexan: ethylether (90:10, efter volumen). De radioaktivt mærkede stearinsyre og oliesyre blev detekteret med en Storm scanner (Molecular Dynamics), og dens optiske densitet kvantificeret med ImageQuant software. For de novo-fedtsyresyntese blev cellerne inkuberet i 6 til 24 timer med [U-

14C] glucose eller i 24 timer med [

14C] natriumacetat i nærvær eller fravær af SCD-inhibitor. Cellulære lipider blev ekstraheret som beskrevet, og mængden af ​​[

14C] sporstof inkorporeret i lipider blev normaliseret til det cellulære indhold af celler dyrket i parallelle petriskåle protein. Portioner af [

14C] glucose-mærkede celle lipider blev esterificeret og niveauerne af radioaktivt mærket SFA og MUFA blev bestemt ved TLC som beskrevet ovenfor. Salg

Bestemmelse af glukoseoptagelse

prækonfluerende H1299-celler blev inkuberet med 1 uM CVT-11127 eller køretøjer glucose-deficient DMEM i 24 timer. Celle blev derefter pulset i 7 minutter med 0,5 pCi /skål [

3H] deoxyglucose i DMEM indeholdende 0,5% BSA, 25 uM HEPES og 100 uM glucose. Mærket medium blev hurtigt fjernet og resterende mærkning på monolagene blev fjernet ved tre gange vask med iskold PBS. Total radioaktivitet af celle- homogenater blev talt i en scintillationstæller og [

3H] DPM blev normaliseret til celle proteinindhold.

Totalt cellulært fedtsyresammensætning

totalt cellulært lipider fra A549 og H460 cancerceller behandlet med 10 pM eller 1 uM CVT-11127, hhv eller vehikel i 24 timer blev ekstraheret som beskrevet ovenfor. Heptadecansyre (C17: 0) blev tilsat som intern standard ved begyndelsen af ​​lipidet ekstraktionsprocessen. Transesterificering og methylering af fedtsyrer fra total lipider blev udført som beskrevet af Lepage og Roy [35]. Fedtsyremethylestere sammensætning blev bestemt ved gaskromatografi under anvendelse af en Varian 3800 GC (Varian Inc, Palo Alto, CA), udstyret med en DB-23-søjle (J W Scientific Inc., Folsom, CA) og FID. Fedtsyremethylestere identifikation og responsfaktorer blev bestemt ved hjælp af standard-blandinger (NuChek Prep Inc., Elysian, MN). Kromatografiske toppe blev identificeret ved sammenligning af deres retentionstider med de rene fedtsyreestere standarder og procent fordeling blev beregnet.

[

3H] thymidin-inkorporering i celle-DNA

Hastigheden af ​​DNA syntese blev bedømt ved bestemmelse af [

3H] thymidin-inkorporering i DNA efter pulsering af cellerne med det radiomærkede sporstof i 2 timer, efterfulgt af udfældning af totalt DNA og scintillationstælling som beskrevet [36]. Grupper af celler blev inkuberet med glucose DMEM suppleret med forskellige koncentrationer af glucose i 22 timer før tilsætningen af ​​[

3H] thymidin. I andre forsøg blev vækstmediet suppleret med 10 mM natriumpyruvat eller natriumcitrat i 22 timer. For SCD inhibering blev CVT-11127 i de angivne doser hvormed vækstmediet i 22 timer før den periode mærkning. I alle tilfælde er den samlede inkubationstid med metabolitter eller inhibitoren var 24 timer.

Bestemmelse af cellevækst kurver

Cellerne blev podet i 12 brønds plader (14.000 celler pr brønd). Fireogtyve timer senere blev monolagene skyllet med PBS og grupper af celler blev inkuberet med 0,5 eller 5,5 mM glucose i vækstmediet. Mediet blev udskiftet hver 48 timer derefter. Til nogle eksperimenter blev celler inkuberet i 24 timer og 48 timer med stigende koncentrationer af natriumoleat op til 100 uM. Cellulær proliferation blev vurderet ved krystalviolet farvning ifølge metoden beskrevet af Menna et al. [37], med modifikationer. Kort fortalt blev cellerne fikseret med methanol, farvet med 0,1% krystalviolet i destilleret vand og skylles tre gange med vand. Farvestoffet i de farvede celler blev solubiliseret i 10% methanol, 5% eddikesyre-opløsning og kvantificeres ved spektrofotometri ved 580 nm. Værdien af ​​en tom brønd blev trukket i hvert tilfælde. Værdierne på forskellige tidspunkter var normaliseret til data på 24 timer efter såning for at undgå forskelle forårsaget af forskelle i celleadhæsion effektivitet eller celledød.

Laktat måling

For at bestemme produktionen af ​​laktat , 9 × 10

4-celler blev podet i plader med 6 brønde og dyrket, indtil monolagene nåede 80% konfluens. Celler blev derefter skyllet med PBS og dyrket i 10% FBS, phenol-fri MEM med de angivne koncentrationer af SCD-inhibitor eller vehikel i 24 timer. For nogle bestemmelser blev cellerne undergår en blokade af SCD aktivitet inkuberet med 10 mM natriumcitrat i 24 timer. Indholdet af lactat i det konditionerede medium blev kvantificeret med en lactat-assay (Eton Biosciences Inc.) ifølge producentens anvisninger og normaliseret til det totale cellulære protein.

immunblotting

prækonfluerende celler blev behandlet som beskrevet, skyllet med iskold PBS, skrabet i koldt hypotonisk lysepuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, plus protease og phosphatase inhibitor cocktails) og sonikeret. Halvtreds mikrogram totale celleproteiner blev adskilt ved SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. Efter blokering blev membranerne inkuberet med polyklonalt kanin phospho-AMPKα (Thr172) og phospho-ACC (Ser79) natten over eller monoklonalt muse anti β-actin i 2 timer i 1:1,000 fortyndinger. Peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer blev anvendt i 1:10,000 fortyndinger. Proteiner på membranen blev påvist under anvendelse af en West pico kemiluminescensdetektion kit og kvantificeret med en ChemiDoc (BioRad) digitalt billede, der anvender en QuantityOne software. Alle analyser af proteinbånd densitet blev udført i den lineære del af mætningskurver og normaliseret til β-actin indhold af de samme prøver.

Bestemmelse af cellulært protein

Totalt cellulært proteinindhold var målt ved Bradford-metoden under anvendelse af BSA som en standard.

Statistisk analyse

Resultater fra et repræsentativt eksperiment med mindst 3 prøver pr forsøgsgruppe er vist som middelværdi ± S. D. Statistisk signifikans af dataene blev bestemt ved t-test.

Resultater

Farmakologisk hæmning af SCD aktivitet svækker spredning af kræftceller

Vi har tidligere rapporteret, at kronisk udtømning af SCD1 nedsætter hastigheden af ​​celleproliferation i onkogen-transformerede og cancerceller [19], [20]. For at evaluere den potentielle anvendelse af nyudviklede SCD-hæmmere som nye midler mod cancer, vi testede den potentielle vækst hæmmende effekt af CVT-11127, en roman små-molekyle hæmmer af SCD aktivitet på flere lungekræft-cellelinjer. Denne forbindelse viste sig at være en effektiv og desaturase-selektiv blokker af SCD-aktivitet i rotte lever mikrosomale præparationer og humane HepG2-celler [30]. Disse forfattere beskrev, at CVT-11127 ikke inhiberer aktiviteten af ​​rotte mikrosomal Δ5 og Δ6-desaturaser i koncentrationer op til 30 uM, hvilket viser, at CVT-11127 er selektiv for A9 desaturaser. Således har vi inkuberet A549, H1299 og H460-celler med stigende koncentrationer af SCD-inhibitor i 24 timer og fundet en progressivt fald i hastigheden for cellereplikation af cancerceller med hensyn til vehikel (DMSO) -behandlede celler (figur 1). H1299 celler viste ~55% og 65% fald i celleproliferation sats i nærvær af 1 uM og 5 uM CVT-11127 henholdsvis (figur 1A). A549-celler var mindre følsomme over for cellevækst inhibitoriske virkning af CVT-11127, idet disse celler reduceret deres replikation sats med 20% og 40% ved behandling med 5 uM og 10 uM CVT-11127, henholdsvis (figur 1b). Desuden proliferationshastigheden af ​​H460-celler behandlet med CVT-11127 var 60% lavere end vehikelbehandlede kontroller (figur 1C), hvilket indikerer, at disse celler er så følsomme over for antigrowth virkning af SCD inhibitor som H1299 celler.

A549 (A) og H1299 (B) celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af CVT-11127 (CVT) eller DMSO-vehikel i 24 timer som beskrevet, og celleproliferation blev bestemt ved Crystal violet assay. For en lignende analyse blev H460-celler (C) blev behandlet med 1 um CVT-11127 i 24 timer. Til bestemmelse af DNA-syntese, A549 (D) og H460 (E) celler blev inkuberet med 10 pM og 5 pM CVT-11127 eller vehikel i 24 timer og pulseres med [

3H] thymidin (1 uCi /skål) til 2 timer ved 37 ° C. Total [

3H] -mærket DNA blev udfældet, radioaktivitet blev kvantificeret i en scintillationstæller og normaliseret til proteinkoncentrationen. F, MCF-7 og MDA-MB-231 brystcancerceller, og WS-1 humane hudfibroblaster blev inkuberet med 10 pM CVT-11127 (CVT) eller DMSO-vehikel i 24 timer og celleproliferation blev vurderet ved krystalviolet farvning metode. E, H460-celler blev inkuberet i 48 timer med 1 pM CVT i nærvær af 1, 10, 50 og 100 uM natriumoleat kompleksbundet med BSA (1:02 BSA: fedtsyre-forhold). Celle inkuberet med DMSO-vehikel blev anset kontrolgruppen. Cellevækst blev estimeret ved krystalviolet farvning metode. Værdier repræsenterer middel ± standardafvigelse. af tredobbelte bestemmelser. *, P. 0,05 eller mindre vs kontrol ved Students t-test

inkubation med SCD-hæmmer resulterede også i en kraftig reduktion (-60%) i inkorporeringen af ​​[

3H ] thymidin i nyligt syntetiseret DNA, en tidlig markør for cellulær proliferation rate, i både A549 og H1299 cancercellelinier (figur 1D og E). For at kontrollere, at antigrowth virkning af SCD kemisk inhibitor ikke var celletype-specifik, MCF-7 og MDA-MB-231 brystcancerceller, såvel som i normale humane WS-1-fibroblaster, blev inkuberet med CVT-11127 i 24 timer og celleproliferation blev vurderet ved Crystal violet farvning (figur 1F). Det blev konstateret, at brystcancerceller blev ligeledes følsomme over for den cytostatiske virkning af lille molekyle SCD-inhibitor. Imidlertid blev proliferationen af ​​WS-1 normale hudfibroblaster ikke påvirket af behandlingen, hvilket tyder på, at den antigrowth virkning SCD blokade kan afhænge af hastigheden af ​​cellereplikation. Endvidere stigende koncentrationer af oleat i celledyrkningsmedium helt eller delvis vendt inhibering af celleproliferation i H460 celler inkuberet med den lille molekyle SCD-inhibitor (figur 1G). Lignende resultater blev opnået med H1299 celler (data ikke vist). Disse fund indikerer, at oliesyre væsentlige er nødvendig for fuldt aktiv replikation af cancerceller.

Som forventet blev vækstinhiberende virkning af CVT-11127 positivt korreleret med en signifikant inhibering af SCD aktivitet i lungecancerceller . Som vist i figur 2A-C, behandling af A549 og H1299-celler i 24 timer med 10 pM og 5 pM af CVT-11127 henholdsvis reduceret SCD-aktivitet mere end 95%, som analyseret ved produktionen af ​​[

14C ] oleinsyre fra dets radiomærket precursor, stearinsyre. Dette bekræfter, at CVT-11127 er meget effektiv til at undertrykke den meget høje SCD aktivitet findes i disse kræftceller.

Til bestemmelse af Δ9-blive grå aktivitet i kræftceller, A549 (A, B) og H1299 celler (A, C), blev behandlet i 24 timer med 10 pM og 5 pM CVT henholdsvis eller DMSO-vehikel. Seks timer før høstning blev cellerne pulseret med [

14C] 18: 0 (0,25 uCi /skål). Efter omdannelse til methylestere blev fedtsyrer adskilt på sølv nitrat-imprægneret TLC-plader. De radioaktive pletter, der svarer til SCD substrat og produkt ([

14C] 18:01), blev visualiseret med en Phosphor Imager (A) og kvantificeres ved densitometrisk analyse (B og C). Værdier repræsenterer middel ± standardafvigelse. af tredobbelte bestemmelser. *, P. 0,05 ved Students t-test

Som følge af reduktionen af ​​SCD1 aktivitet ved den lille molekyle inhibitor, fordelingen af ​​SFA og MUFA i totale cellulære lipider af A549-celler var betydeligt ændret (figur 3A og B). Forholdene MUFA til SFA i både n-7 og n-9-fedtsyre serie blev reduceret med 25% og 35% i henholdsvis celler behandlet i 24 timer med CVT-11127 i forhold til vehikelbehandlede kontroller. Desuden blev forholdet MUFA /SFA i H460 celler fundet formindsket med 47% (n-7MUFA /SFA) og 60% (n-9MUFA /SFA) i celler, der undergår en lignende behandling med CVT-11127 i forhold til DMSO-behandlede celler (figur 3C og D). Forstyrrelser i cellen MUFA-indhold ved inkuberinger med det lille molekyle inhibitor blev observeret så tidligt som 1 time efter behandling (data ikke vist). Disse observationer viser klart, at den samlede fedtacylkæde sammensætning af lipider i cancerceller er under kontrol af SCD1 aktivitet, selv når disse celler blev dyrket i medium med FBS, der indeholder betydelige mængder af MUFA.

A549-celler (A, B) og H460-celler (C, D) blev inkuberet med 10 pM og 1 uM CVT-11127 (CVT) henholdsvis eller DMSO i 24 timer. Cellulære lipider blev ekstraheret og fedtsyrer blev omdannet til deres methylester form ved transesterificering som beskrevet i Materialer og Metoder. Fedtsyremethylestere præparat blev vurderet ved gaschromatografi og procent fordeling af fedtsyrer blev beregnet. Værdierne udtrykker forholdet 18: 1n-9/18: 0 (A, C) og 16:01-n7 + 18: 1n-7/16: 0 (B, D), og repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse. 4-5 prøver. *, P. 0,01 eller mindre, ved Students t-test

Hæmning af SCD1 falder de novo lipid syntese af glukose

Kræftceller har ændret et sæt signalering og metaboliske veje til øge brugen af ​​glukose som vigtigste substrat for makromolekylære biosyntese og til energiformål-generering reaktioner [38]. Tidligere viste vi, at kronisk udtømning af SCD1 undertrykker den generelle forekomst af lipogenese [19], [20]. For at dissekere de mekanismer på metabolisk regulering af SCD1, undersøgte vi virkningen af ​​akut hæmning af SCD-aktivitet med det hidtil ukendte små molekyler CVT-11127 på lipogene veje. At dokumentere effekten af ​​akut SCD inaktivering på glucose-medieret lipid biosyntese, blev A549 og H1299-celler behandlet med SCD-inhibitor eller vehikel i 6 timer og 24 timer henholdsvis og dannelsen af ​​totale cellulære lipider fra [

14C] glucose var fast besluttet. Som vist i figur 4A og B, blev inkorporeringen af ​​radioaktivt mærket glukose til totalt cellulært lipider væsentligt forringet (30%) i SCD-inhibitor-behandlede H1299 og A549-celler i forhold til vehikelbehandlede kontroller. Som tidligere observeret [20], inkorporeringen af ​​radioaktivt mærket glukose til totallipider faldt med -20% i stabil SCD1-knockdown A549 (hSCDas) celler (figur 4C), hvilket bekræfter, at tilstedeværelsen af ​​en fuldt aktiv SCD1 er afgørende for at opretholde den fremskyndede glucose-medieret lipogenese i cancerceller. Ændringen i dannelsen af ​​[

14C] glucose-mærkede lipider blev ikke forårsaget af en mangelfuld optagelse af glukose, fordi vi ikke observeret nogen ændring i antallet af [

3H] deoxyglucose optagelse i celler behandlet med CVT eller køretøj ( figur 4D). Inkorporering af radioaktivt mærket glucose i fedtsyrer af cancercellelinier lipider blev reduceret ved behandling med CVT (figur 4E), hvilket antyder, at den abnorme dannelse af lipider i celler, der undergår inhibering af SCD1 kan være forårsaget af en defekt de novo fedtsyrebiosyntese. Som forventet blev produktionen af ​​glukose-mærket MUFA næsten helt undertrykt i H1299 celler med en blok i SCD-aktivitet (figur 4E, øverste panel). Endvidere den biokemiske ændringer i lipogenese i celler med kemiske blokade af SCD forekommer at være placeret nedstrøms dannelsen af ​​acetylCoA eftersom en reduceret dannelse af [

14C] acetat-mærkede lipider blev observeret i CVT-behandlede H1299-celler i henhold til køretøjets -behandlede kontroller (Figur 4F).

A549-celler (A) og H1299-celler (B) blev inkuberet med 10 pM og 1 uM CVT-11127 (CVT) og henholdsvis eller DMSO i 24 timer. Celler blev derefter pulseret med 1 uCi D- [U-

14C] glucose i op til 24 timer. C, A549-celler med en stabil knockdown i SCD1 ekspression (hSCDas) og mocktransfekterede kontrolceller blev underkastet en lignende inkubation med [

14C] glucose. Cellulære lipider blev ekstraheret og inkorporering af [

14C] glucose til totallipider blev kvantificeret ved scintillationstælling og normaliseret til proteinkoncentrationen. D, basal glukoseoptagelse blev analyseret i H1299 celler behandlet med 1 pM CVT eller køretøj i 24 timer ved at estimere optagelsen af ​​[

3H] deoxyglucose. E, H1299-celler blev inkuberet med [

14C] glucose i nærvær eller fravær af 1 uM CVT i 6 timer og niveauer af total [

14C] fedtsyrer samt radiomærket SFA og MUFA (øverste felt), blev bestemt ved argentation TLC som beskrevet i Materialer og metoder. F, hastigheden af ​​lipidsyntese i H1299-celler blev vurderet ved inkubation med 1 pM CVT eller køretøj, og 0,5 pCi /skål af [

14C] acetat i 24 timer. Lipider blev ekstraheret og radioaktivitet af totale lipider blev bestemt ved scintillationstælling. Værdier repræsenterer middel ± standardafvigelse. af tredobbelte bestemmelser. *, P. 0,05 eller mindre, ved Students t-test

Stimulering af glykolyse /lipogenese ikke vende den nedsat proliferation af SCD1-mangelfulde celler

Som beskrevet ovenfor, både akutte farmakologisk blokade af SCD aktivitet og stabil gen knockdown af SCD1 væsentlig grad ændre satserne for glukose-medieret lipogenese og celledeling. Vi antager, at en perturbation i aerob glycolyse kunne være den primære årsag til den nedsat proliferation og overlevelse af SCD1-deficiente celler ([19], [20] og figur 1). Vi derefter bestemmes hastigheden af ​​glykolysen i A549 og H1299 celler ved at vurdere niveauet af laktat i de konditionerede medier, en indikator for aerob glykolytisk sats i cancerceller [39], og fandt en stigning på 30-60% i celler undergår farmakologisk hæmning af SCD sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller (figur 5A). For at bekræfte, at en ændring i flux af glycolytiske metabolitter ikke var ansvarlig for den mangelfulde replikation af SCD1-ablateret celler, vi inkuberes cellerne i medium med et meget lavt (0,5 mM), normal (5,5 mm) eller høj (25 mm) niveauer af glucose og bestemmes hastigheden af ​​DNA-syntese og cellevækst. Som vist for andre cancercellelinjer, A549-celler viste streng glucose afhængighed for proliferation (figur 5B). Ved dyrkning i det væsentlige glucose-fri MEM (indeholdende -0,5 mM glucose fra 10% FBS-tilskud) i 24 timer, inkorporeringen af ​​radioaktivt mærket thymidin i DNA af SCD1-deficiente (hSCDas) og kontrolceller blev reduceret med 70%, når sammenlignet med celler, der vokser under standard dyrkningsbetingelser (5,5 mM glucose). Imidlertid faldt betydeligt, hastighed for DNA-syntese iagttaget i SCD1-poleres celler fortsatte uanset glucoseniveauet i dyrkningsmedierne.