PLoS ONE: The Human Bocavirus Er forbundet med nogle Lunge og kolorektal kræft og vedvarer i solide tumorer

Abstrakt

Menneskelig bocavirus er den anden autonome human parvovirus med antaget patogene potentiale. Andre parvovira vides at persistere og endda integreres i værtsgenomet, vinder bidrager til multi-trin udvikling af cancer. Human bocavirus fortsætter også i en ukendt procentdel af klinisk asymptomatiske patienter ud over dem med primær infektion. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at analysere betydningen for Human bocavirus i lunge og kolorektale cancere. Derfor blev formalinfikserede, paraffinindlejrede, arkiverede tumorprøver screenes for human bocavirus DNA ved PCR, Southern blotting og sekventering. Positive væv blev yderligere underkastet fluorescens in situ hybridiseringsanalyse til specifikt at påvise humant bocavirus DNA i de inficerede celler. I alt 11 af de 60 (18,3%) lunge og 9 af de 44 (20,5%) kolorektale tumorer testet positive for humant bocavirus DNA ved PCR og blev bekræftet ved sekventering og fluorescens in situ hybridisering analyse. Således humant bocavirus DNA er til stede i kerner af inficerede celler, i enten enkelte eller multiple kopier, og synes at danne concatemerer. Forekomsten af ​​disse menneskelige bocavirus DNA-strukturer understøtter eksistensen af ​​den postulerede σ- eller rullende-hårnål replikation mekanisme. Desuden fluorescens in situ hybridiserings- mønstrene inspireret den hypotese, at humane bocavirus DNA enten fortsætter som cccDNA eller er integreret i værtsgenomet. Dette fund tyder på, at denne virus indirekte kan bidrage til udviklingen af ​​nogle kolorektale og lungekræft, som gør andre DNA-vira, såsom humant hepatitis B-virus, eller kan spille en aktiv rolle i cancer ved at interagere med værtsgenomet.

Henvisning: Schildgen V, Malecki M, Tillmann RL, Brockmann M, Schildgen O (2013) The human Bocavirus Er forbundet med nogle Lunge og kolorektal kræft og vedvarer i solide tumorer. PLoS ONE 8 (6): e68020. doi: 10,1371 /journal.pone.0068020

Redaktør: Amit Kapoor, Columbia University, USA

Modtaget: 8. februar 2013; Accepteret: 24 maj 2013; Udgivet: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Schildgen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en ubegrænset forskningsbevilling fra Else Kröner-Fresenius Stiftung, Tyskland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Siden opdagelsen i 2005 af Tobias Allander [1] er der stigende tegn på, at de udbredte menneskelige bocavirus (HBoV) spiller en væsentlig rolle i luftvejsinfektioner (undertype 1) og i gastrointestinale infektioner (undertyper 2- 4) [2-6]. Derudover HBoV er den fjerde mest almindelige virus påvist i luftvejsinfektioner [7] og antages at være den anden parvovirus, der er i stand til at inficere mennesker med potentiale til at forårsage klinisk sygdom. Men er nu i tvivl baseret på en roman undersøgelse fra Storbritannien [8].

Tidligere vores gruppe identificerede DNA-sekvenser, der indeholder “head-to-tail” genom fragmenter forbundet med en nyligt sin rolle i gastrointestinale infektioner identificeret linker stretch. Efter offentliggørelsen blev den iagttagelse, at “head-to-tail” sekvenser forekomme HBoV undertype en bekræftet af Kapoor og kolleger, som identificerede disse strukturer som episomal kovalent lukket cirkulære (ccc) DNA i patienter inficeret med HBoV undertype 3 [9]. Kapoor og kolleger, samt grupper fra Kina [10,11] og USA [12], konkluderede, at disse cccDNA strukturer kan være virale genomer vedvarende i disse celler. Denne konklusion understøtter den hypotese, at HBoV kan forblive i den inficerede vært og kan eksistere i en asymptomatisk men produktiv tilstand, hvilket igen kunne forklare den relativt høje procentdel af asymptomatiske patienter, der bærer viruset.

Et andet eksempel på en DNA virus, der fortsætter i en kovalent lukket cirkulært struktur og inducerer vævsbeskadigelse er den menneskelige hepatitis B virus (HBV). I alle kroniske HBV-infektioner, cccDNA er til stede i leverceller, og dette cccDNA vedholdenhed inducerer kronisk inflammation, der ikke påvirker patientens tilstand i lang tid, men langsomt fører til leveren-fibrose, cirrhose, og endelig cancer i en bemærkelsesværdig procentdel af kronisk HBV-infektioner [13-17].

i betragtning af at andre parvovirus er i stand til at integrere i værtsgenomet [18], og det første kendte patogene human parvovirus, parvovirus B19, er forbundet med flere kræftformer, herunder lymfomer [ ,,,0],19], testikeltumorer [20], papillære og anaplastisk thyroidea karcinomer [21,22] og kroniske inflammatoriske sygdomme såsom Hashimoto thyreoiditis [23], kardiomyopati og myocarditis [24], forekommer muligt en lignende mekanisme for HBoV-associeret patogenese.

sygdommen forløb HBOV nærmeste pårørende, dvs. bovin parvovirus (BPV) og minut virus af hunde (MVC, CNMV, også kendt som CPV-1), resultaterne af en indledende infektion af luftvejen, efterfulgt af infektion af tarmen og efterfølgende udskillelse via luftvejene /intestinale vej [25]. De hypoteser, HBoV kan forblive i en hvilken som helst målorgan, og at disse berørte væv oplever langsigtet bør derfor testes skader.

Således har vi behandlet spørgsmålet om, hvorvidt HBoV analogt til hepatitis B-virus, kan påvises i tumorer. I betragtning af at patogenesen af ​​HBoV infektioner begynder i luftvejene og ender i mavetarmkanalen, analyserede vi ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tumorer og kolorektale tumorer. Begge er kræft, hvor tumor udvikling er dårligt forstået, og hvor en viral bidrag ikke er blevet udelukket hidtil [26-29].

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og ifølge en afstemning i Etisk Udvalg Private University of Witten-Herdecke (stemme nej. 73/2012). Denne afstemning er specielt godkendt til den aktuelle undersøgelse. På grund af den retrospektive natur og dobbelt-blindede patientprøver, der anvendes i undersøgelsen Etisk Udvalg konkluderede, at der ikke skriftligt informeret samtykke var påkrævet. Undersøgelsen kohorte bestod udelukkende af voksne patienter.

Patientprøver

Sixty formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) lunge tumor sektioner og 44 kolorektale tumorer blev tilfældigt udvalgt fra arkiverede prøver fra vores rutine klinisk laboratorium. Gennemsnitsalderen for patienterne var 69,21 år med en median på 71 år. Undersøgelsen blev udført med tilbagevirkende kraft. Ingen yderligere kliniske data, herunder terapi status, rygevaner, eller kræftbehandling, blev brugt, fordi disse oplysninger ville have haft nogen indflydelse på studiet resultat. Som kontroller blev tumor-fri væv fra området af hver tumor analyseret for HBoV når de forefindes. Yderligere 10 tumor-fri, sund lunge og colorektale vævsprøver blev analyseret for humant bocavirus DNA. Som yderligere kontrol, blev prøver fra 10 human papilloma virus (HPV) positive cervikale tumorer og 10 HPV negative cervikale tumorer samt 10 brysttumorer screenet for HBoV DNA. Alle kliniske prøver blev indsamlet i 2011 og 2012.

PCR og real-time PCR Analyser

DNA fra FFPE vævsprøver blev ekstraheret ved hjælp af Maxwell 16 FFPE væv kit (Promega, Mannheim, Tyskland) ifølge fabrikantens protokol. PCR og realtids-PCR blev udført som beskrevet tidligere [30,31].

Sequencing

Prøver, der testede positive ved real-time PCR for humane bocavirus blev underkastet konventionel PCR under anvendelse af primerne HBoV-LC-Ku-1 og HBoV-LC-Ku-2 [30,31]. PCR-amplificeret DNA blev sat på en 1,5% agarosegel i TAE-buffer og blev gel-ekstraheret inden sekventering. Gel ekstraktion blev udført ved hjælp af et Qiagen Gel-rensning (Qiagen, Hilden, Tyskland) strengt at følge indlægssedlen. For sekventering blev oprensede PCR-produkter forblandet med enten HBoV-LC-Ku-1 primer eller HBoV-LC-Ku-2 primer og sendt til Eurofins MWG (München, Tyskland) i kapillær Sanger sekventering. FASTA opnåede sekvenser blev underkastet sekvensanalyser og justering ved hjælp Vector NTI software 12,0 (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Sekventering blev udført for alle tumorer, der testede positive for HBoV ved PCR (n = 20).

FISH Analyser

Fisk analyser blev udført i det væsentlige som beskrevet for andre almindeligt testede biomarkører, såsom HER2neu og EML4-ALK, som tidligere offentliggjort [32], med den modifikation, at HBoV- og GAPDH-specifikke prober blev anvendt, sidstnævnte som en kontrol. Proberne blev designet til at hybridisere i nærheden af ​​de to terminale regioner i HBoV genom eller til både 5′-enden og 3′-enden af ​​kontrol-genet (GAPDH).

testmetode svarede til break-apart FISH tilgang, der anvendes til påvisning af EML4-alk. Når to prober binder i umiddelbar nærhed af hinanden, de røde og grønne signaler er tæt nok til at fremstå som en enkelt gul signal. Denne situation kan opstå, hvis de HBoV genomer forekomme som kovalent lukket cirkulært DNA, som beskrevet af Kapoor og medarbejdere [9]. I modsætning hertil distinkte signaler adskilt af mindst to signal længder viser, at prober hybridiseret ved forskellige steder, som i en lineær form af bocavirus genomet.

Proberne er anført i tabel 1. FISH blev udført som følger : FFPE tumorvæv, der omgiver tumor gratis væv og kontrol væv blev skåret i 3-um-tykke skiver og monteret på dias. Som kontroller, humane HepG2-celler blev dyrket på kammerobjektglas som tidligere beskrevet [33] og transficeret med den humane bocavirus plasmider p5TRHBoV [34] og PTA-RSV pCRII-TOPO plasmid indeholdende en delvis RSV N gensekvens) under anvendelse af lipofectamin (Invitrogen, . Karlsruhe, Tyskland)

Target

Fluorokrom

Emission

Sequence

T

M

Ændring

GAPDH StartRhodamine GreengreenTCTACGAGCCTTGCGGGCTCCGGGTCTTTGCAGTCGTATG (40) 75 ° C5′-RGR , 3′-RGRGAPDH StopRhodamine RedredCTGGGGACTGGCTTTCCCATAATTTCCTTTCAAGGTGGGG (40) 74,6 ° C5′-RRE, 3′-RREBoca hoved SRhodamine GreengreenTCAGACTGCATCCGGTCTCCGGCGAGTGAACATCTCTGGG (40) 75 ° C5′-RGR, 3′-RGRBoca Tail SRhodamine RedredGTTCCTCTCCAATGGACAAGWGGAAAGAAAAGGGTGACTG (40) 72.5 ° C5 ‘ -RRE, 3’-RRETable 1. Fisk anvendte prober til påvisning af HBoV og GAPDH-generne i FFPE lysbilleder af colorektale og lungetumorer.

Alle prober blev koblet til fluorochromer ved deres 3′- og 5′-ender, der kan forbedre fluorescenssignalerne. CSV Hent CSV

Slides blev behandlet i henhold til den ZytoLight SPEC ALK /EML4 TriCheck

TM sonde protokol (ZytoVision, Bremerhaven, Tyskland) i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Prober blev anvendt ved koncentrationer på 2:00 hver. Mikroskopiske analyser og dokumentation blev udført på et Zeiss Axioplan mikroskop ved hjælp af AxioVision 4.8 software (Zeiss, Jena, Tyskland). Alle HBoV positiv tumor prøver blev udsat for FISH analyser (n = 20).

Resultater

I alt 11 af de 60 (18,3%) lunge og ni af de 44 (20,5%) kolorektale testet positive for HBoV DNA ved konventionel slutpunkt PCR tumorer efterfulgt af gelelektroforese (data ikke vist) og ved qPCR (tabel 2). Slutpunktet og qPCR resultaterne var enige, det vil sige prøver, testet positive ved slutpunktet PCR var også positive ved real-time PCR og omvendt, mens prøver, der var negative med en metode forblev negativ af den anden analyse. Endvidere blev HBoV DNA ikke påvist i nogen af ​​kontrolgruppen prøver (10 brysttumorer, 10 HPV-positive cervikale tumorer og 10 HPV-negativ cervikale tumorer). Sekventering af PCR-produkterne og efterfølgende alignments bekræftede, at HBoV DNA blev amplificeret fra tumorprøver (figur 1a). Der var imidlertid ingen sammenhæng mellem HBoV kopi nummer og tumor scenen.

Patient nr

Sex

Tumor oprindelse

HBoV slutpunkt PCR

HBoV slutpunkt PCR fra tumor miljø

HBoV FISH

HBoV kopier /pg totalt DNA

Alignment-nr. (Figur 1)

CR1femaleappendixpositivenegativepositive120656CR2Malecaecumpositivenegativepositive284915CR3femalecaecumpositivenegativepositive885failed sequencingCR4Malecolonpositivenegativepositive125CR5Malecolonpositivenegativepositive14182CR6femalecolonpositivenegativepositive70failed sequencingCR7femalerectumpositivenegativepositive1710failed sequencingCR8Malerectumpositivenegativepositive65failed sequencingCR9femalerectumpositivenegativepositive1failed sequencingL1femalelungpositivenegativepositive9480413L2femalelungpositivenegativepositive156314L3Malelungpositivenegativepositive37L4Malelungpositivenegativepositive119594L5femalelungpositivenegativepositive33L6Malelungpositivenegativepositive3361L7femalelungpositivenegativepositive17285712L8femalelungpositivenegativepositive619012L9femalelungpositivenegativepositive25400011L10Malelungpositivenegativepositive163008L11femalelungpositivenegativepositive110379Table 2. Patienter, tumor typer og qPCR resultater fra tumorvæv

CR = kolorektal; L = Lung CSV Hent CSV

Som reference- sekvenser, blev følgende Genbank anvendt:. HBoV-1 = FJ858259 (Bonn-1 ) a. på linie PCR produktsekvenser opnået fra tumor vævsprøver. i alt 15 prøver havde nok DNA til stede efter PCR-amplifikation til direkte sekventering. sekvenser blev sprængt og opstilles med referencestammen Bonn-1. det er indlysende, at alle sekvenser var stærkt konserverede og matches referencesekvensen. tre sekvenser havde yderligere ikke-HBoV sekvens opstrøms for de justerede regioner (vist i figur 1b). b. Tilpasning af den opstrøms sekvens til stede i tre HBoV genomer isoleret fra tumorvæv. den opstrøms indsatte sekvens var observeret i tre prøver, der var uafhængigt DNA ekstraheret og analyseret ved PCR og sekventering i tre uafhængige kørsler, dermed udelukke en enkelt artefakt eller krydskontaminering begivenhed. Overraskende, de understregede sekvenser fuldt matchede den humane DNA-sekvens fra kromosom 5, reference- sekvenser AC008698.6 (

Homo sapiens

kromosom 5 klon CTB-70H11, baser 76.065-76.026) og AC025156.2 (

Homo sapiens

3 BAC RP11-494C5 fra Roswell Park Cancer Institute, baserer 130.245-130.284), hvilket indikerer, at HBoV er i stand til at rekombinere med sin vært.

I alle HBoV-positive patient tumorer (tabel 2) blev de sunde væv, der omgiver disse tumorer også testet for HBoV DNA ved PCR (n = 30; 2 tumorfri FFPE blokke fra området omkring hver HBoV-positive tumor). HBoV DNA blev ikke påvist i nogen af ​​de tumor fri vævsprøver undersøgt (to tilstødende FFPE blokke per patient, en på hver side af tumoren blok). Desuden blev der ikke HBoV DNA påvist i FFPE væv fra patienter uden lunge- eller kolorektale tumorer (10 raske kontrolpersoner lunger og 10 raske kontrol kolorektal væv). Femten isolater passeret Sanger sekventering kvalitetskontrol og afslørede højt konserveret HBoV-1 NP1 gensekvenser.

overraskende i tre tilfælde blev NP1 DNA-sekvens flankeret af en opstrøms sekvens, der indeholdt et konserveret del af humant kromosom 5 ( 1b). Da disse tre prøver blev underkastet uafhængig DNA-ekstraktion og PCR og sekventering kørsler, kan muligheden for, at denne observation skyldtes krydskontaminering mellem de tre prøver udelukkes.

Som det tidligere var vist, at HBoV kan forblive i en episomal DNA form, der kemisk defineret som en kovalent lukket cirkulært (ccc) DNA, vi undersøgte, i hvilken form HBoV DNA fortsætter i disse tumorprøver.

for at besvare dette spørgsmål, en fluorescens in situ hybridisering (FISH ) assay blev udviklet. Den humane HepG2-cellelinien blev transficeret med p5TRHBoV [34] plasmid, som indeholder en næsten fuld-længde kopi af HBoV genomet. Som kontroller, transficerede vi HepG2-celler med et plasmid indeholdende et delvist humant respiratorisk syncytialvirus (RSV) sekvens og mock-transficerede celler. Disse data er vist i figur 2a.

a. Rækker 1-3 viser væv farvet med HBoV-specifikke prober og DAPI; rækker 4-6 viser positive og negative kontroller. LEH og REH svarer til den venstre ende (5′-ende) og den højre ende (3′-ende) af det virale genom eller GAPDH-genet. Humane celler transficeret med plasmider med eller uden humane bocavirus genomer samt mock-transficerede celler blev anvendt som kontroller. Række 7 viser HepG2 celler farvet med prober specifikke for terminale sekvenser af GAPDH-genet. b. Udvidelsen af ​​det flettede billede af HepG2 celle dobbelt farves med sonder specifikke for det humane GAPDH gen. Denne figur viser, at afstanden mellem de to forskellige prober ved 5′-enden og 3′-enden er stor nok til at resultere i separate signaler (split signal). c. Flettede billeder af HBoV DNA positive væv, herunder en negativ kontrol væv.

FISH prober rettet mod regionerne nær den venstre ende hårnålen (LEH) og den højre ende hårnålen (REH) blev anvendt. Én probe blev mærket med en grøn fluorescerende farvestof, og den anden blev mærket med et rødt fluorescerende farvestof (tabel 1).

Transficerede cellekulturer analyseret ved fluorescensmikroskopi viste, at de anvendte prober til påvisning af HBoV genomisk DNA var yderst specifik; Kun de celler, som blev transfekteret med p5TRHBoV plasmid og hverken de mock transficerede celler eller celler transficeret med kontrol-plasmidet viste signaler (figur 2a, cellekultur). Disse forsøg blev udført tredobbelt.

I alle tumorprøver der testet positive ved PCR, HBoV blev også påvist ved FISH-analyse (n = 20, tabel 2). blev påvist multiple signaler per celle i 3 kolorektale tumorer og 4 lungetumorer, og blev påvist enkelt signaler i de resterende 6 kolorektal og 7 lung tumorprøver. Figur 2a viser billeder repræsenterer hver tumortype observeret i FISH analyser. HBoV DNA blev ikke påvist i de negative kontrolprøver. blev påvist HBoV-FISH signaler fra både LEH og REH. Overraskende, deres farvningsmønster var ikke homogen: nogle prøver viste et enkelt REH og LEH signal per inficeret celle, og blev påvist flere signaler i andre prøver. Multiple signaler per celle hos nogle lunge- og colorektale væv (lunge: n = 4, kolorektal: n = 3), hvilket indikerer, at multiple kopier af HBoV DNA er til stede i celler på grund af replikation eller flere genomer vedvarende som episomer eller blive integreret i værtens DNA. Disse observationer er kongruente med, at HBoV replikerer i en fokal måde. Derudover blev disse signaler ikke altid placeret i kernen; nogle syntes at være i cytoplasmaet, som indikeret ved at de forskellige farvekanaler.

Desuden mikroskopisk FISH analyser af GAPDH-genet viser, at afstanden mellem hoved og hale signalerne fra GAPDH-genet er stort nok til at klart adskilt begge signaler (figur 2a, sidste linje, figur 2b, udvidet fra figur 2a). Fletning de fluorescerende billeder fra HBoV positive tumorer viser, at de terminale HBoV signaler er placeret i nærheden af ​​hinanden i nogle tilfælde, som er angivet med grøn /røde signaler med en lille gul mellemliggende region, mens de røde og grønne signaler klart blev adskilt i andre (split signaler), hvilket viser at genomet forekommer i en ikke-cirkulær form. De gule signaler understøtter tidligere observation af Kapoor og kolleger, at HBoV genomer der fortsat som cccDNA [9]. Repræsentative fluorescerende billeder er vist i figur 2c.

Diskussion

I vores pilotundersøgelse, som omfattede 60 lunge tumorer og 44 kolorektale tumorer, identificerede vi HBoV DNA i 18,3% (n = 11) af alle lunge tumorer og 20,5% (n = 9) af alle kolorektale tumorer. De præsenterede data tyder på, at HBoV er forbundet med nogle lunge og kolorektale tumorer og bekræft den antagelse, at HBoV vedholdenhed øges hos kræftpatienter [35]. Forekomsten af ​​multiple FISH signaler i enkelte celler er forenelig med den hypotese, at HBoV replikerer ved den rullende cirkel eller den alternative rullende hårnål Replikationsmekanismen. For at undersøge dette problem, kan yderligere undersøgelser ved hjælp af konfokal mikroskopi, en metode, der endnu ikke er etableret i vores laboratorium, være nyttig.

HBoV stammer identificeret i tumorprøver i nærværende undersøgelse alle tilhørte genotype 1, som er den hyppigste genotype i Europa; det er ikke usædvanligt, at ingen andre undertyper blev identificeret, som de andre undertyper er generelt sjældne og er forbundet med akut gastroenteritis, en klinisk lidelse, der ikke blev undersøgt i vores studie.

Om HBoV DNA fortsætter i tumorer som episomer eller om den er integreret i det humane genom mangler at blive undersøgt. Vore data viser, at HBoV genomet kan findes i en lineær form (split signaler) eller i en “hoved-til-hale” -form (gul fusionerede signal eller direkte tilstødende grønne og røde signaler). Denne observation skal fortolkes forsigtigt, uden yderligere analyser. De ikke-separeret signaler kunne repræsentere “head-to-tail” replikationsmellemprodukter, cccDNA, som observeret tidligere [9,10,36], eller flere genom kopier vedvarende i inficerede celler. De delte signaler kan spekulativt tolkes som rullende hårnål replikation mellemprodukter eller som lineære genomisk DNA. Endvidere kunne DNA ikke er til stede i kernen være placeret i cytoplasmaet eller pakkes i ekstracellulære viruspartikler.

Konstateringen af, at HBoV kan persistere i nogle inficerede væv i form af cccDNA, ligner andre kræftfremkaldende vira, kunne fortolkes på flere måder. Først HBoV kunne bidrage til udviklingen af ​​nogle lunge og kolorektale tumorer, erkender, at det er uklart, om HBoV har en aktiv eller passiv rolle i udviklingen af ​​disse tumorer. Denne hypotese er stadig et spørgsmål om spekulation, men understøttes af den menneskelige DNA-fragmenter fra kromosom 5 findes i tre fuldt uafhængige sager, hvilket indikerer en rekombination begivenhed med host-DNA (figur 1b). Selvom det er usandsynligt, at der er en minimal risiko for, at dette resultat er en PCR artefakt. Hvorvidt HBoV er i stand til at integrere i humant kromosomalt DNA eller rekombinere med det humane genom mangler at blive undersøgt. I en opfølgende undersøgelse, kunne denne hypotese undersøges ved hjælp af friske vævsprøver og RFLP-analyse efterfulgt af Southern blotting, hvilket ville føre til et band skift i tilfælde af integration i værtsgenomet. Desværre, det var teknisk umuligt i vores undersøgelse, fordi FFPE væv blev anvendt med tilbagevirkende kraft. Desuden er det nødvendigt at analysere ekspression af virale proteiner i de respektive tumorer og deres interaktion med cellulære proteiner, en metode, der ikke kan udføres i fravær af bredt tilgængelige antistoffer.

andet, nogle lunge og kolorektale tumorer kunne give et optimalt miljø for HBoV og støtte HBoV replikation. Den anden antagelse i første omgang synes at være mere sandsynligt, fordi andre parvovirus foretrækker dividere og prolifererende celler [37,38].

roller menneskelige parvovirus som agenser, kræft eller bidragsydere til carcinogenese er blevet drøftet indgående for det første kendte human parvovirus B19. I 2007, en kinesisk gruppe opdaget parvovirus B19 i 81,1% af kolon adenokarcinomer ved in situ hybridisering og bekræftet dette resultat i 78,4% af dem ved immunhistokemi afsløre virale proteiner i ISH-positive væv [39]. Denne undersøgelse støttede en tidligere klinisk observation, hvor B19 var forbundet med lungekræft i en japansk patient [40]. Som nævnt i indledningen, blev parvovirus B19 mistænkes for at være en agens af andre cancerformer og kan inducere kroniske inflammatoriske processer i en inficeret væv [19-24]. Lignende mekanismer kan spille en rolle i HBoV inficerede væv; fremtidige studier bør derfor fokusere på de inflammatoriske processer forbundet med HBoV. Tilsammen disse observationer fører til den hypotese, at menneskelige parvovira, især HBoV og parvovirus B19, kan spille en aktiv rolle i humane kræftformer. Derfor yderligere undersøgelser baseret på prospektive undersøgelser ved hjælp af friske tumorvæv eller romanen CuFi-8 cellekultur-system [7] er meget ønskeligt og kunne belyse den rolle, som disse vira i humane kræftformer.