PLoS ONE: Hedgehog Signaling Antagonist GDC-0449 (Vismodegib) Hæmmer kræft i bugspytkirtlen Stem Cell Karakteristik: Molekylære mekanismer

Abstrakt

Baggrund

De seneste tal fra

in vitro

og

in vivo

studier har vist, at afvigende reaktivering af Sonic Hedgehog (SHH) signalvejen regulerer gener, der fremmer cellulær proliferation i forskellige cancer stamceller fra menneskelige (CSCS). Derfor har de kemoterapeutiske midler, som inhiberer aktiveringen af ​​Gli transkriptionsfaktorer dukket op som lovende nye terapeutiske lægemidler til pancreascancer. GDC-0449 (Vismodegib), oralt administrerbar molekyle tilhører 2-arylpyridine klasse, inhiberer SHH signalvejen ved at blokere aktiviteterne i Smoothened. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de molekylære mekanismer, som GDC-0449 regulerer menneskelige pancreas CSC egenskaber

in vitro

.

Metode /vigtigste resultater

GDC-0499 hæmmede cellernes levedygtighed og induceret apoptose i tre bugspytkirtelkræft cellelinjer og pancreas CSCS. Denne inhibitor undertrykte også cellelevedygtighed, Gli-DNA-binding og transcriptionale aktiviteter, og induceret apoptose gennem caspase-3-aktivering og PARP-spaltning i pancreas CSCS. GDC-0449-induceret apoptose i CSCS viste øget Fas udtryk og nedsat udtryk for PDGFRα. Desuden Bcl-2 blev nedreguleret hvorimod TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 ekspression blev øget efter behandling af CSCS med GDC-0449. Undertrykkelse af både Gli1 plus Gli2 af shRNA efterlignede ændringer i cellelevedygtighed, kugleformet dannelse, apoptose og genekspression observeret i GDC-0449-behandlede pancreas CSCS. Således aktiverede Gli-gener undertrykke DRS og Fas udtryk, opregulerer udtrykkene for Bcl-2 og PDGFRα og lette celleoverlevelse.

Konklusioner /Signifikans

Disse data antyder, at GDC-0499 kan anvendes til styring af kræft i bugspytkirtlen ved at målrette pancreas CSCS

Henvisning:. Singh BN, Fu J, Srivastava RK, Shankar S (2011) Hedgehog Signaling Antagonist GDC-0449 (Vismodegib) Hæmmer kræft i bugspytkirtlen Stem Cell Kendetegn : Molekylære mekanismer. PLoS ONE 6 (11): e27306. doi: 10,1371 /journal.pone.0027306

Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA

Modtaget: September 2, 2011; Accepteret: 13. oktober 2011; Udgivet: November 8, 2011

Copyright: © 2011 Singh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) er en meget dødelig malignitet. kendetegnet ved sen diagnose og behandling modstand. PC er den fjerde hyppigste årsag til kræft i USA med en 5-års overlevelse mindre end 5%. Kirurgisk resektion er den eneste potentielt helbredende behandlingsmulighed til PC; Men på grund af manglen på tidlige symptomer, det store flertal af patienter til stede med metastatisk sygdom, rendering deres malignitet ubrugeligt [1], [2]. Den nuværende standard-of-care terapi, gemcitabin, strækker patientoverlevelse ved kun et par uger [3]. Identifikationen af ​​nye molekylære mål til PC til at overvinde den dystre prognose er derfor nødvendig. Tilbagevendende genetiske ændringer i definerede gener i association med forstyrrelser af udviklingsmæssige celle signalveje er blevet forbundet med PC udvikling og progression. Nylig dokumentation fra

in vitro

og

in vivo

undersøgelser tyder på, at Sonic Hedgehog (SHH) signalvejen [4] er afvigende reaktiveres og anerkendt som en af ​​de mæglere i de fleste pc’er; derfor, SHH blokade har potentiale til at forhindre sygdomsudvikling og metastatisk spredning [5].

SHH signalering initieres ved bindingen af ​​korttidsvirkende polypeptidligand nemlig Shh (sonic Hedgehog, indisk pindsvin eller Desert Hedgehog) til dets receptor, Patched som derved mindsker de inhiberende virkninger af Patched på Smoothened [6]. Smoothened derefter lokaliseret i den primære cilium af cellen, en organel spiller en kritisk rolle i SHH signalering [7]. Der, Smoothened aktiverer et intracellulært kaskade, der resulterer i aktivering og nuklear translokation af Gli familie transkriptionsfaktor Gli2 [8]. Gli2 translokerer til kernen og inducerer transkription af SHH målgener, såsom Gli1, en pålidelig markør for SHH signalering [8], [9]. Gli2 er en kritisk komponent i SHH signal- og dens inaktivering resulterer i en inhibering af SHH signalering. Disse Gli transskriptionsfaktorer tænde gener i kernen som fremmer cellulær proliferation, cellulær overlevelse, stemness, og celleskæbne bestemmelse i en række forskellige organer [5], [10]. SHH pathway er et morfogen nødvendig for korrekt mønsterdannelse under embryogenese; dog deregulering af denne vej er ansvarlig for flere humane cancere [8], [10], [11]. Nyere vidnesbyrd indikerer, at SHH signalvejen på niveauet for Gli-gener har en kritisk rolle i normale pancreas udvikling, og der er stigende tegn på, at dysreguleret SHH signalering spiller en vis rolle i pancreascancer [12]. Desuden flere rapporter viser, at menneskelige pancreascancer end udtrykkelige Gli gener [13], [14].

Transskription faktorer af Gli familien har dobbelt funktioner som aktivator og repressor, der er defineret kun delvist og kan reagere på kombinatorisk og samarbejdsvillig Gli aktivitet. Den Gli familien spiller kritiske roller i mægling og fortolkning af SHH signaler [15]. SHH-drevne cancerformer udspringer fra en række forskellige mutationer, der påvirker forskellige komponenter, herunder de centrale transkriptionel effektor Gli proteiner, fører til en række forskellige humane maligniteter, herunder medulloblastom, rhabdomyosarkom, melanom, basalcellekarcinom, og bryst, lunge, lever, mave, prostata, og pancreascancer [16], [17], [18], [19], [20]. Konstitutivt, SHH-Gli signalering er aktiv i basalcellekarcinomer, medulloblastomer og kræft i spiserøret, på grund af mutation i Patched eller Smoothened [21], [22]. Melanomer og carcinomer i prostata har yderligere vist en SHH-Gli signalering akse [23]. I gastrointestinale cancere, SHH signaleringsaktivering sker gennem transkriptionel opregulering af SHH ligand [24]. Det er for nylig blevet foreslået, at SHH signalering skrider under kolon carcinogenese [25], [26] og i metastatisk sygdom [27], mens i normal colon væv, SHH signalering er involveret i differentiering [28]. For nylig er gener blevet profileret som reguleres nedstrøms for Gli1 og Gli2 der er involveret i celleproliferation og cellecyklus [29], [30], og celleoverlevelse (PDGFRα og Bcl-2) [22]. Gli2 udtrykkes også i mange basalcellekarcinomer [31], hvilket tyder på, at disse gener også kan være involveret i udviklingen af ​​PC, som kunne være i overensstemmelse med dets delvise aktion som formidler af SHH-signaler [32]. Men roller Gli gener (Gli1 og Gli2) i SHH-drevet cellulære overlevelse og celledød svar forbliver dårligt defineret, og specifikt, deres rolle i cellulær proliferation og overlevelse af pancreas CSCS er ukendt, og de nedstrøms målgener involveret i fastlæggelsen af celle skæbne.

Meget opmærksomhed er for nylig blevet fokuseret på rollen som cancer stamceller (CSCS) /kræft initierende celler (CICS) i initiering og progression af faste maligniteter. CSCS kan være ansvarlig for tumor debut, selv-fornyelse /vedligeholdelse, mutation ophobning, og metastase på grund af deres evne til at udtrykke anti-apoptotiske og lægemiddelresistente proteiner, og dermed opretholde tumorvækst [33], [34]. Den SHH signalvej er et centralt regulator af fysiologiske celleprocesser som omfatter proliferation, differentiering og apoptose [35]. Nylige undersøgelser tyder på, at SHH signalsystem spiller en central rolle også i CSC biologi, herunder i reguleringen af ​​CSCS selvfornyelse, differentiering; og tumorigent potentiale, hvilket tyder SHH signalering kunne være en lovende terapeutisk mål i pc’er [14]. Aktivering SHH signalering kan ophæve modstand CSCS for kemoterapi og kan føre til udvikling af nye terapeutiske metoder til behandling af pc’er.

At identificere nedstrøms mål af Gli gener, der regulerer celleproliferation og overlevelse i bugspytkirtelkræft stamceller (CSCS), anvendte vi en inhibitor af SHH signalering, GDC-0449 (Smoothened inhibitor), som er blevet identificeret i en celle-baseret lille molekyle skærm for inhibitorer af Gli familie-medieret transkription [36]. GDC-0449 virker som en potent inhibitor af Smoothened og viser en høj grad af selektivitet for SHH-Gli signalering [36]. I humane pancreas CSCS viste vi inhiberingen af ​​SHH signalvejen ved at målrette GLI transkriptionsfaktorer. GDC-0449 induceret betydelig celledød i tre bugspytkirtelkræft cellelinier (ASPC-1, Panc-1 og MIA Paca-2) og pancreas CSCS. I yderligere detaljerede analyser af pancreas CSCS, GDC-0449 faldt SHH signalering komponenter (Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, SHH og Smoothened) udtryk, Gli-DNA-binding og Gli-luciferase reporter aktiviteter. Desuden knockdown af både Gli1 og Gli2 udtryk vha shRNA tillægges resistens mod GDC-0499-induceret cytotoksicitet. Endvidere GDC-0449 faldt ekspressionen af ​​PDGFRα samtidig med forhøjede niveauer af Fas, forøget ekspression af TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5, faldt Bcl-2-ekspression, og induceret caspase-3-aktivitet og PARP-spaltning. GDC-0449-inducerede ændringer i genekspression og apoptose blev blokeret af Gli1 plus Gli2 shRNA, hvilket peger en rolle Gli for cellulær proliferation og overlevelse i humane pancreas CSCS. Disse data tyder på, at GDC-0449 undertrykker pancreas CSCS spredning og overlevelse ved at hæmme SHH signalvejen på niveau med Gli gener.

Resultater

SHH vej signalering komponenter er udtrykt i humane pancreas cancer cellelinjer og pancreas CSCS

Vi målte første ekspressionen af ​​forskellige komponenter af SHH pathway i human pancreascancer AsPC-1, PANC-1, og MIA-PaCa-2-cellelinjer og pancreas CSCS ved RT-PCR (fig. 1). Dataene viser, at komponenterne i SHH signalvej, herunder liganden (Shh), de signalmolekyler (Patched-1, Patched-2 og Smoothened) og effektorer (Gli1, og Gli2) er udtrykt i humane pancreas cancer cellelinjer og pancreas CSCS. Disse data tyder på, at SHH vej er intakt i bugspytkirtelkræft cellelinjer og CSCS, og støtter konceptet, at bindingen af ​​Shh ligand til Patched receptor mindsker sine hæmmende effekt på Smoothened, så signaltransduktion, som vil resultere i aktivering og nuklear translokation af gli familie transkriptionsfaktorer [13], [37].

bugspytkirtelkræftceller (AsPC-1, PANC-1 og MIA PaCa-2) og pancreas CSCS blev dyrket i 48 timer. Total RNA blev isoleret og ekspression af Shh, Patched-1, Patched-2, Smoothened, Gli-1 og Gli-2 blev målt ved QRT-PCR. HK-GAPD blev anvendt som endogen normalisering kontrol. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og blev beregnet på grundlag af ΔΔ

C

t metode. N-gange ændring i mRNA’er ekspression blev bestemt ifølge fremgangsmåden af ​​2

-ΔΔCT med GAPDH anvendes som den endogene kontrol.

GDC-0449 reducerer cellernes levedygtighed og inducerer apoptose i human pancreas cancer cellelinjer og pancreas CSCS

Tidligere kliniske studier har antydet, at GDC-0449 er et lille molekyle hæmmer af Smoothened. Vi først søgte at undersøge virkningerne af GDC-0499 på cellernes levedygtighed og apoptose i panelet af tre humane bugspytkirtelkræft cellelinjer og pancreas CSCS. Inhibering af celle overlevelse og induktion af apoptose blev observeret inden for 24 timer efter eksponering for dette stof (data ikke vist), men blev maksimalt bemærket ved 72 timer (fig. 2 og 3). I alle de cellelinjer, GDC-0449 induceret apoptose er en dosisafhængig måde på op til 65%. Til sammenligning GDC-0449 var mindre effektiv til at inducere apoptose i CSCS (fig. 3). For yderligere mekanistiske undersøgelser har vi brugt pancreas CSCS.

Celler blev behandlet med GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 uM) i 48 og 72 timer. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev cellelevedygtighed målt ved XTT i (A) AsPC-1, (B) MIA PaCa-2, (C) PANC-1, og (D) Pancreas CSCS. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @ Eller # signifikant forskellig fra respektive kontrol (P 0,05)

Cellerne blev behandlet med GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 uM) i 48 og 72 timer.. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev cellerne høstet og apoptose blev målt. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @ Eller # signifikant forskellig fra respektive kontrol (P 0,05).

GDC-0449 regulerer nedstrøms mål for SHH vej, hæmmer Gli-DNA interaktion, Gli transkriptionel aktivitet og reducerer Gli nukleare translokation i pancreas CSCS

Vi undersøgte dernæst virkningen af ​​GDC-0449 på ekspressionen af ​​Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, PARP, Bcl-2, caspase-3, og PDGFRα ved Western blot-analyse (fig. 4). GDC-0449 inducerede ekspression af Fas, DR4 og DR5 og hæmmede ekspression af Bcl-2 og PDGFRα i bugspytkirtlen CSCS. Desuden GDC-0449 induceret spaltning af caspase-3 og PARP i pancreas CSCS, korrelerer med omfanget af celleoverlevelse og apoptose.

Pancreas CSCS blev behandlet med GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 uM) i 48 timer. Ekspressionen af ​​Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, PARP-spaltning, Bcl-2, og caspase-3 ved Western blot-analyse. β-Actin blev brugt som en belastning kontrol.

Vi næste forsøgt at undersøge virkningerne af GDC-0449 på SHH vej ved at måle ekspressionen af ​​SHH receptorer (Patched-1, Patched-2 og Smoothened ) og effektorer (Gli1 og Gli2) ved QRT-PCR (fig. 5A). GDC-0449 inhiberede ekspressionen af ​​smoothened, Patched-1, og Patched-2. Tilsvarende GDC-0449 inhiberede ekspressionen af ​​transskriptionsfaktoren Gli1 og Gli2. Disse data antyder, at GDC-0449 kan regulere CSC egenskaber ved at hæmme forskellige komponenter af SHH-vejen.

. (A), blev pancreas CSCS behandlet med GDC-0449 (10 uM) i 36 timer. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev RNA ekstraheret og ekspressionen af ​​Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, Smoothened og Shh blev målt ved QRT-PCR. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD. @ Signifikant forskellig fra respektive kontrol (P 0,05). (B), blev pancreas CSCS behandlet med og GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 uM) i 48 timer. Nukleare ekstrakter blev fremstillet og gelshift eksperimentet blev udført. Kun Probe, kontrol (uden GDC-0449), og GDC-0449 behandlede prøver (1, 5 og 10 uM) henholdsvis. Dataene er repræsentative for tre eksperimenter. (C), er Gli-afhængig luciferaseaktivitet reduceret med GDC-0499. Pancreas CSCS blev transduceret med lentiviral konstrukt udtrykker Gli-afhængige luciferase reporter, og behandlet med GDC-0449 (0, 5 og 10 uM) i 48 timer. Lysater blev fremstillet, og luciferaseaktivitet blev målt. Normaliseret luciferaseaktivitet præsenteres som middelværdi ± SD. @ Eller # signifikant forskellig fra respektive kontrol (P 0,05). (D), GDC-0449 hæmmer ekspressionen af ​​Gli1 og Gli2 i humane pancreas CSCS. Cellerne blev podet på fibronectincoatede dækglas og behandlet med GDC-0449 (10 pM) i 48 timer. Efterfølgende blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd, blokeret i 10% normalt gedeserum og farvet med Gli1 og Gli2 primære antistoffer (1:100) i 16 timer ved 4 ° C og vasket med PBS. Bagefter blev cellerne inkuberet med fluorescensmærket sekundært antistof (1:200) sammen med DAPI (1 mg /ml) i 1 time ved stuetemperatur, og cellerne blev monteret og visualiseret under et fluorescensmikroskop. For bedre visualitet, blev farven på DAPI ændret fra blå til rød.

Siden Gli medierer effekten af ​​Shh, vi næste undersøgt Gli-DNA interaktion ved elektroforetisk mobilitet (EMSA) i human pancreas CSCS. Behandling af CSCS med GDC-0449 resulterede i nedsat Gli-DNA-bindingsaktivitet på en dosis-afhængig måde (Fig. 5B).

Vi undersøgte dernæst virkningen af ​​GDC-0449 på Gli transkriptionel aktivitet (fig. 5C ). Eksponering af CSCS med GDC-0449 i 36 timer resulterede i inhibering af Gli-afhængig luciferase reporter aktiviteten på en dosis-afhængig måde. GDC-0449 inhiberede ekspressionen af ​​Patched-1 og Patched-2, fordi de er downstream mål for Gli. Vi næste ansat immunofluorescens teknik til at undersøge virkningerne af GDC-0449 om nuklear udtryk for Gli (fig. 5D). Pancreas CSCS blev behandlet med GDC-0449, og den nukleare udtryk for Gli1 og Gli2 blev observeret. GDC-0449 inhiberede nukleare ekspression af Gli1 og Gli2. Samlet set antyder disse data at GDC-0449 kan inhibere Gli DNA-binding og transkriptionsaktivitet.

Humane pankreatiske CSCS kræver aktiv Gli funktion for vedvarende ekspression af gener involveret i celleoverlevelse og proliferation

for at undersøge virkningerne af Gli1 og Gli2 på celleproliferation, apoptose og ned-stream mål, hæmmet vi udtryk for Gli1 og Gli2 transkriptionsfaktorer af shRNA. Som vist i fig. 6A, lentiviral medieret udtryk for Gli1 og Gli2 shRNA hæmmede udtryk for Gli1 og Gli2 proteiner i bugspytkirtlen CSCS. Hvis GDC-0449 inhiberer cellernes levedygtighed og inducerer apoptose ved at inhibere Gli transkriptionsfaktorer, bør inhibering af Gli1 og Gli2 blokere antiproliferative og pro-apoptotiske virkninger af GDC-0449. For at bekræfte Gli-afhængige anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger GDC-0449, brugte vi pancreas CSCS udtrykker Gli1 + Gli2 shRNA (fig. 6B). GDC-0449 inhiberede cellelevedygtighed og apoptose i CSCS /krypteret celler. Hæmning af Gli1 og Gli2 alene ved shRNA ikke var i stand til helt at hæmme virkningen af ​​GDC-0449 på CSC levedygtighed (data ikke vist). Til sammenligning, inhibering af Gli1 plus Gli2 sammen af ​​shRNA undertrykt virkningerne af GDC-0449 på cellelevedygtighed og apoptose i CSCS. Disse data antyder, at både Gli1 og Gli2 gener er nødvendige for antiproliferative og pro-apoptotiske virkninger af GDC-0449.

(A), Knockout of Gli1 shRNA og Gli2 shRNA i humane pancreas CSCS. Pancreas CSCS blev transduceret med lentivirale partikler udtrykker Scrambled, Gli1 shRNA, Gli2 shRNA eller Gli1 plus Gli2 shRNA (KO). (B), blev pancreas CSCS behandlet med GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 uM) i 72 timer, og cellelevedygtighed og apoptose blev målt i krypteret og Gli1 plus Gli2 shRNA CSCS. Data repræsenterer gennemsnit ± SD, n = 4. @ eller # signifikant forskellig fra respektive kontrol (P 0,05). (C), Scrambled og Gli1 plus Gli2 shRNA pancreas CSCS blev behandlet med GDC-0449 (0 og 10 uM) i 48 timer, og lysater blev ekstraheret til bestemmelse af ekspression af DR4, DR5, PDGFRα, Fas og Bcl-2 ved Western blot analyse. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (D), hæmning af primære og sekundære sfæroider ved GDC-0449. Pancreas CSCS (krypteret, og Gli1 + Gli2 shRNA) blev podet i suspension og behandledes med GDC-0449 (10 uM) i 7 dage. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev sfæroider opsamlet, og dissocieret med Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.). For sekundære sfæroider blev celler genpodedes og behandlet med GDC-0449 (10 uM) for yderligere 7 dage. Cellelevedygtighed blev målt ved trypan blue assay. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @ Eller # signifikant forskellig fra de respektive kontroller, P . 0,05

Vi næste undersøgt virkningerne af at hæmme Gli udtryk på nedstrøms mål for SHH vej ved Western blot analyse (figur 6C.). GDC-0449 (10 uM) inducerede ekspression af Fas, DR4 og DR5, spaltet PARP, og inhiberede ekspression af Bcl-2 og PDGFRα i CSC /scrambled celler. Det er interessant at bemærke, at ekspressionen af ​​PDGFRα faldt efter GDC-0449 behandling med samtidig stigning i Fas. Til sammenligning GDC-0449 ikke havde nogen væsentlig indvirkning på ekspressionen af ​​disse nedstrøms mål for SHH signalvej i CSCS /Gli1 + Gli2 shRNA celler.

Vi næste undersøgte effekten af ​​GDC-0449 på primær og sekundær klumpformet dannelse (fig. 6D). GDC-0449 hæmmede dannelsen af ​​primære og sekundære spheroids i CSC /krypteret celler. Til sammenligning transduktion af Gli1 plus Gli2 shRNA i CSCS undertrykt de hæmmende virkninger af GDC-0449 på primær og sekundær klumpformet dannelse. Disse data tyder på, at GDC-0449 kan hæmme bugspytkirtlen CSC egenskaber.

Diskussion

Vores undersøgelse viser for første gang, at Smoothened-afhængige terapeutisk middel GDC-0449 regulerer cellulær overlevelse i human pancreas CSCS. Konkret GDC-0449 hæmmede cellernes levedygtighed og induceret apoptose i tre bugspytkirtelkræft cellelinjer og pancreas CSCS. I pancreas CSCS, GDC-0449 undertrykte også levedygtighed celle, Gli-DNA-binding og Gli-transkriptionelle aktiviteter, induceret apoptose gennem caspase-3 aktivering og PARP spaltning. Analyse af de molekylære mekanismer i GDC-0449-induceret celledød i CSCS viste øget FAS udtrykkelse og nedsat ekspression af PDGFRα, som også regulerer Fas. Desuden Bcl-2 blev nedreguleret mens DR4 og DR5 udtryk blev øget efter behandling af GDC-0449. Undertrykkelse af både Gli1 plus Gli2 af shRNA efterlignede ændringer i cellelevedygtighed, kugleformet dannelse, apoptose og død-relaterede genekspression observeret i GDC-0449-behandlede pancreas CSCS. Således aktiverede Gli gener undertrykke DRs og Fas udtryk mens opregulering bcl-2 og PDGFRα udtryk til at hæmme Fas. Vores resultater fremhæve den kritiske rolle SHH signalering i humane pancreas CSCS og muligheden for at målrette Gli1 og Gli2 aktivator funktioner ved hjælp GDC-0449 i bugspytkirtelkræft stamceller.

SHH signalering begivenheder har været impliceret i tumorcelleproliferation og overlevelse samt er den molekylære kendetegnende for forskellige humane tumor enheder, der omfatter esophageal pladecellecarcinom, basalcellecarcinom [38], delmængder af medulloblastom [39], prostatacancer [40], tyktarmskræft [41], hjernetumorer [42 ], rhabdomyosarcom [43], og brystkræft [44]. Flere linjer af beviser støtter ideen om, at SHH signalering er en forudsætning for den øgede levedygtighed pancreas CSCS, således at blokere aktiv SHH signalering med de terapeutiske inhibitor molekyler såsom GANT-61 (målrettet effektorer Gli1 og Gli2) og cyclopamin (målrettet SHH-receptor smoothened) induceret celledød [45]. Vi har vist, at humane kræft i bugspytkirtlen cellelinjer og CSCS konsekvent udtrykke forskellige komponenter i SHH vej herunder effektorer (Gli1 og Gli2), og receptorer (Patched-1, Patched-2, og Smoothened), og vigtigst af ligand: SHH, hvilket tyder Shh pathway er en af ​​de “kerne” signalvejen eller en autokrin måde til SHH-signalering i disse celler. Aktivering af SHH signaleringskaskade konsekvent inducerer Gli familie transkriptionsfaktorer (Gli1 og Gli2), derfor både Gli gener mRNA [46], udtrykt i bugspytkirtelkræft cellelinjer og CSCS angivelse potentiel inddragelse af SHH signalering i human pancreas carcinogenese.

Aberrant aktivering af SHH signalering er impliceret i mange humane cancere. At identificere nye terapeutiske mål, har hæmning af SHH signalering været forsøgt i flere humane kræftformer [11], [41], [45]. For nylig er Gli og SMO antagonister blevet anvendt til at ophæve SHH signalering i humane cancere (40). Naturlige og syntetiske Smoothened antagonister, såsom cyclopamin [24] og IPI-926 [11], henholdsvis har hæmmet proliferation, overlevelse og har anti-tumor-funktioner, hvilket resulterer i ophævelse af SHH signalering. Men i løbet af de kliniske forsøg er der observeret forskellige niveauer af resistens. Farmakologiske midler, herunder cyclopamin (11), GDC-0499 og GANT-61 [41] har inhiberet overlevelse og antitumor funktioner i prækliniske modeller af humane cancere. Gli-gener er potentielle medlemmer af SHH pathway, der fungerer som nedstrøms mediatorer af SHH signalering og de har regulatoriske virkninger på cellecyklus og apoptose. Derfor en potentiel druggable mål ligger i Gli familie transkriptionsfaktorer, som er de endelige mediatorer af transkriptionel regulering i SHH signalvejen. I den foreliggende undersøgelse, udsættelse for GDC-0449 inducerer signifikant cytotoksicitet og apoptose i humane bugspytkirtelkræftceller og CSCS.

GDC-0449 behandling effektivt faldt Gli-DNA-binding og Gli-transkriptionel aktivitet i humane pancreas CSCS. Disse resultater foreslår, at GDC-0449 kan inducere posttranskriptionel ændringer af Gli gen, der kunne pege i retning af en stigning i phosphorylering, som enten forhindrer DNA-binding eller destabilisere Gli-DNA-kompleks. Post-translationelle modifikationer af Gli gen er en vigtig mekanisme, der regulerer evne forskellige transkriptionsfaktorer til at hæmme forskellige gen-sæt, der er involveret i reguleringen af ​​celledød hæmning [41], i overensstemmelse med tidligere observationer i bugspytkirtelkræftceller manipuleret til at udtrykke Gli1 [13 ]. Af særlig interesse, Smoothened-afhængige GDC-0449 behandling af pancreas CSCS markant hæmmede udtryk for SHH receptorer (Patched-1, Patched-2 og Smoothened) og effektorer (Gli1 og Gli2), hvilket viser potentialet for terapeutisk anvendelse til behandling af kræft i bugspytkirtlen . Det blev tidligere rapporteret, at GDC-0449 blev identificeret som inhibitor af Gli1 transkriptionsaktivitet, og også ophævet Gli2-medieret transkription [36]. Efterfølgende har vi observeret, at reduktionen i Gli2 udtryk forud at af Gli1 i pancreas CSCS. Endvidere har studier i mus viste, at Gli2 er primære mediatorer af SHH signalering og er kendt for transkriptionelt regulere Gli1 ekspression [25]. Fordi SHH signalvejen allerede er aktiveret i humane pancreas CSCS blev undersøgelser under anvendelse shRNA knockdown af Gli1 og Gli2 alene og samtidigt udføres. GDC-0449 signifikant hæmmede celle levedygtighed og induceret apoptose i shRNA Gli1 og Gli2 alene (data ikke vist). Interessant nok blev betydelig beskyttelse mod GDC-0449-induceret cytotoksicitet og apoptose registreret i shRNA knockdown af både Gli1 og Gli2. Disse data understøtter endvidere tanken om, at GDC-0449 kan have Gli-afhængige og -uafhængige virkningsmekanisme (fig. 7), og viser yderligere betydningen af ​​funktionelle Gli gener i at opretholde cellulær overlevelse i humane pancreas CSCS.

Aktiveret Gli1 og Gli2, neden for SHH-Patched-Smoothened, regulere mål for SHH-signalering, herunder Bcl-2, PDGFRα, Fas, og DRs. GDC-0449 (rettet mod Smoothened) blokke de indirekte funktioner Gli aktivatorer, hvilket resulterer i celledød.

For at vurdere antiproliferative effekt af GDC-0449 nærmere, vi næste korreleret udtryk for cellecyklus og apoptose-relaterede gener med SHH signalering i pancreas CSCS. I flere stamceller og cancerceller, SHH fungerer som en overlevelsesfaktor [9], [47]. SHH er blevet rapporteret til at styre spredningen af ​​flere celletyper gennem forskellige molekylære mekanismer såsom forøgelse PDGFRα og Bcl-2 udtryk, fald i DRS og Fas udtryk, og inhibering af PARP-spaltning og caspase-3 aktivering i colon cancercellelinier overudtrykker gli-gener [41], eller en overekspression af dominant-negativ FADD i celler, der udtrykker SHH eller en konstitutivt aktiv Smoothened [41]. I vores undersøgelse GDC-0449 inducerede en markant stigning i ekspression af Fas og begge DRs (TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R1 /DR5), hvilket tyder på mulig anvendelse af disse DRs i lægemiddel-induceret apoptose. Nylige rapporter viste fraværet af Gli bindingssteder i promotorregionen af ​​DR4 og DR5. Reguleringen af ​​DR-ekspression af Gli er i øjeblikket ukendt og kan være via en indirekte mekanisme. Men GDC-0449 induceret opregulering af både DRs i pancreas CSCS, hvilket tyder på transkriptionel regulering af DRs af en aktuelt ukendt mekanisme. Vi bestemt også bidragene fra apoptotisk celledød veje (mitokondrier-medieret iboende og død receptor signalering-medieret ydre), baseret på den kendte regulering af PDGFRα opstrøms af Fas [2], [48], og af Bd-2, der kan være en direkte transkriptionel mål for både Gli1 og Gli2, en nøgle anti-apoptotisk protein i celleoverlevelse SHH-afhængig [49]. Vi har vist, at GDC-0449-behandling reducerer pro-overlevelse protein Bcl-2-ekspression i pancreas CSCS. Således er vores data viser, at aktivering af SHH pathway kan regulere gener involveret i både celle-ydre og celle-intrinsisk veje for apoptose.

Tilsammen denne undersøgelse viser, at endogen SHH signalering styrer selvfornyelse kapacitet af humant pancreas CSCS ved at målrette ned-stream mål for Gli. Som konklusion kan GDC-0449 anvendes til behandling af human bugspytkirtelkræft, fordi det kan målrette bugspytkirtelkræft CSCS.

Metoder

Antistoffer og reagenser

Antistoffer mod SHH, smoothened, blev Fas, TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, og β-actin indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Antistoffer mod Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2 blev PDGFRα og caspase-3 fås fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Forøget kemiluminescens (ECL) Western blot afsløring reagenser var fra Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). GDC-0449 (Vismodegib; C19H14Cl2N2O3S) blev købt fra Tocris (Ellisville, MO). Alle andre anvendte kemikalier var af analytisk kvalitet og blev købt fra Fisher Scientific (Suwanee, Georgien) og Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cell kultur

Bugspytkirtelkræft cellelinjer ( AsPC-1, PANC-1 og MIA PaCa-2) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotisk-antimykotisk ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2. Humane pancreas CSCS (CD133

+ /CD44

+ /CD24

+ /ESA

+) blev opnået fra Celprogen Inc. (San Pedro, CA). De blev isoleret fra primære tumorer og er blevet beskrevet tidligere [33]. De CSCS blev dyrket i DMEM suppleret med 1% N2 Supplement (Invitrogen), 2% B27 Supplement (Invitrogen), 20 ng /ml human blodplade vækstfaktor (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml epidermal vækstfaktor (Invitrogen) og 1 % antibiotikum-antimykotikum (Invitrogen) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2. Pancreas CSCS blev rutinemæssigt kontrolleret af morfologi og vækst karakteristika

Lentiviral partikel produktion og Gli1 shRNA og Gli2 shRNA transduktion

Gli1 shRNA (5′-GCCTGAATCTGTGTATGAA-3. «5’GTTTGAATCTGAATGCTAT-3 «5’AGCTAGAGTCCAGAGGTTC-3 ‘; 5’CCGGAGTGCAGTCAAGTTG-3’ og 5’GGCTGGACCAGCTACATCA-3 ‘) og Gli2 shRNA (5’CCGAGAAGCAAGAAGCCAA-3’; 5’CACAGCATGCTCTACTACT-3 ‘; 5’TCGCTAGTGGCCTACATCA 3 ‘; 5′-TCCGAGAAGCAAGAAGCCA-3’ og 5’CCAGACGACGTGGTGCAGT-3 blev opnået «) fra Open Biosystems, Huntsville, AL) og klonet ind TRIPZ vektor.