PLoS ONE: Tab af 4q21.23-22.1 er prognostisk markør for Disease og samlet overlevelse i ikke-småcellet lungekræft

Abstrakte

Denne undersøgelse blev udført for at vurdere den prognostiske betydning af genomiske afvigelser på kromosom 4q i NSCLC patienter. Vi har tidligere identificeret kopi nummer ændringer på 4q12-q32 at være signifikant associeret med den tidlige hæmatogen spredning af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), og nu har til formål at indsnævre potentielle hot-spots i denne 107 Mb spænder region. Brug otte mikrosatellitmarkører ved position 4q12-35, analyser allel ubalance (AI) blev udført på en forundersøgelse kohorte (

n =

86). Positioner indikerer klinisk-patologiske og prognostiske foreninger i AI-analyser blev yderligere valideret i en større undersøgelse kohorte anvendelse af fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) i 209 NSCLC patienter. Tab ved positionerne 4q21.23 og 4q22.1 viste sig at være forbundet med avancerede klinisk-patologiske karakteristika samt med forkortet sygdomsfri (DFS) og total overlevelse (OS) (DFS:

P =

0,019; OS:

P =

0,002). Multivariat analyser identificeret tab 4q21.23-22.1 at være en uafhængig prognostisk markør for både DFS og OS i NSCLC (HR 1,64-2,20, alle

P

0,04), og især i planocellulært lungecancer (

P

0,05). En sag rapport studie af en lungekræft patient yderligere afsløret et tab på 4q21.23 i disseminerede tumorceller (DTCs). Hverken gevinster på sidstnævnte positioner, eller genomiske afvigelser på 4q12, 4q31.2 og 4q35.1, indikerede en prognostisk relevans. Afslutningsvis vores data viser, at tab på 4q21.23-22.1 i NSCLC er af prognostisk betydning i NSCLC patienter og dermed indeholder nye potentielle tumorsuppressorgener med klinisk relevans

Henvisning:. Uzunoglu FG, Dethlefsen E, Hanssen A, Wrage M, Deutsch L, Harms-Effenberger K, et al. (2014) Tab af 4q21.23-22.1 er prognostisk markør for Disease og samlet overlevelse i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (12): e113315. doi: 10,1371 /journal.pone.0113315

Redaktør: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Marts 24, 2014 Accepteret: 26 oktober 2014; Udgivet: 11. december 2014

Copyright: © 2014 Uzunoglu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Hamburger Krebsgesellschaft e.V., Hamburg, Tyskland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Genomisk ustabilitet er en af ​​de vigtigste kendetegn for kræft [1]. Talrige undersøgelser af genomisk ustabilitet i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) har fremhævet specifikke sletning mønstre for både metastatiske og primære tumorer [2] – [4]. Kopiér nummer afvigelser i NSCLC kan findes på flere områder, nogle er specifikke for den histologiske undertype, og nogle er afhængig af sværhedsgraden af ​​histopatologiske ændringer (f.eks tumor stadie eller sortering) [5] – [11] Desuden forekomsten af ​​eksemplar nummerændringer har vist sig at være en tidlig begivenhed i lungekræft patogenese. Dette kan findes i kombination med en sekventiel mønster af tab af heterozygositet (LOH), som begynder med allele tab på kromosom 8p, efterfulgt af 3P og 9P deletioner [7], [12], [13].

Vi har tidligere vist, at tidlig hæmatogen spredning af tumorceller er drevet af et specifikt mønster af genomiske ændringer. Udover dette mønster, en stor deletion af kromosom 4q12-q32 ( 107 Mbp) angiver en stærk association med tilstedeværelsen af ​​disseminerede tumorceller (DTC) i knoglemarven, såvel som hjernemetastaser af lungecancerpatienter [14] . Men den prognostiske relevans af denne region endnu ikke blevet undersøgt. Formålet med denne undersøgelse var at indsnævre de relevante hotspot regioner og til at undersøge deres prognostisk betydning i NSCLC. Derudover har vi forsøgt at analysere, om også kunne påvises dette underskud i dobbeltbeskatningsoverenskomsterne af en NSCLC patient.

Til dette formål, vi uropført allel ubalance (AI /LOH) analyser i en foreløbig undersøgelse kohorte (

n =

86). For yderligere kontrol blev en fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) analyse af 209 NSCLC patienter udført. Et tab inden for en mindre end 4 Mb-spænder region ved 4q21.23-4q22.1 blev identificeret som en væsentlig negativ prognostisk markør for sygdomsfri samt den samlede overlevelse i NSCLC. Desuden udførte vi i træk immunofluorescens (IF) og FISH analyser på dobbeltbeskatningsoverenskomsterne af en enkelt NSCLC patient, som viser et tab på 4q21.23 i den primære tumor. Det samme tab kunne også påvises i dobbeltbeskatningsoverenskomster.

Materialer og metoder

Prøver

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i kammeret af læger, Hamburg, Tyskland . Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Alle kliniske undersøgelse er blevet udført i henhold til principperne i Helsinki-erklæringen. Alle tumorprøver blev opnået under kirurgiske resektioner på University Medical Center Hamburg-Eppendorf eller associerede kirurgiske afdelinger. Klinisk-patologisk data blev udtrukket fra et prospektivt database, og opfølgende data blev opnået ved interviews med den praktiserende læge eller patienten ved ambulant afdeling.

For allel ubalance (AI) analyser på 4q, 86 kirurgisk behandlet primære NSCLC patienter med tilgængelige matchede karcinom og sund genomisk DNA blev evalueret for inklusion. Den mediane alder af undersøgelsen kohorte var 65,9 år med en overvejende mandlig andel (65,1% versus 34,9%). Med hensyn til lungekræft celletyper, 37 patienter (43,0%) havde en pladecellecarcinom (SQCC) og 49 (57,0%) et adenocarcinom (AC). Den mediane follow-up tid var 21,4 måneder (2-60). Yderligere detaljer er givet i S1 tabel.

For DNA-kopi nummer afvigelser (FISH) ved 4q, et væv microarray (TMA), der består af 209 evaluerbare patienter primær lungecancer, blev anvendt, med en gennemsnitsalder på 62,3 år på tidspunktet for kirurgi. Køn distributioner var sammenlignelige med AI undersøgelsen kohorte, med en lignende overvægt af mandlige patienter (68,4%). FISH undersøgelse kohorte omfattede 88 (42,1%) patienter med SqCCs, 78 (37.1%) med ACS 34 (16,3%) med stor-cellet lungecarcinom, og ni patienter (4,5%) med neuroendokrine lungekræft. Den mediane opfølgningstid var 24,7 måneder (2,5-60). Yderligere oplysninger findes i S1 tabel.

Alle patienter blev omklassificeret i overensstemmelse med den syvende udgave af TNM klassifikation af maligne tumorer [15]. Med hensyn til administrationen af ​​adjuverende behandling er følgende specificerede kriterier blevet anvendt siden 2004: ≥ Stage II patienter modtog adjuverende kemoterapi med cisplatin og Vinorelbin. Iscenesat Ib patienter blev bedømt for adjuverende terapi, hvis tumoren 4 cm eller hos patienter med invasion i venen (V +) eller invasion i lymfekar (L +). Adjuverende kemoterapi efterfulgt af strålebehandling (50-60 Gy) blev drøftet i ≥ Stage III. Patient karakteristika for begge studier kohorter er vist i S1 tabel.

DNA isolation

Genomisk DNA af matchede carcinom (frisk frosset) og patologisk-verificerede ikke-maligne lungevæv eller perifert blod leukocyt, taget før kirurgi blev ekstraheret og oprenset ifølge producentens protokol under anvendelse af QIAamp væv (Qiagen, Hilden, Tyskland) eller InnuPREP DNA Microkit (AnalytikJena, Jena, Tyskland). Om nødvendigt blev manuel microdissection udført, for at opnå en tumorcelle indhold på mindst 70%. DNA-koncentrationen blev bestemt ved NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Wilmington, DE) og prøver blev fortyndet til 10 ng /pl og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

Allelic ubalance analyse

Based på vores tidligere undersøgelse, fire hotspot regioner er repræsenteret på positionerne 4q12, 4q21.23, 4q31.2 og 4q35.1 blev udvalgt til yderligere analyse [14]. For hver region blev to mikrosatellitmarkører anvendt til at vurdere hyppigheden og kliniske relevans af AI (se S2 tabel, at begrundelsen angiver alle mikrosatellitmarkører). Fremadrettede primere blev mærket med et fluorescerende farvestof (6-FAM) til efterfølgende kapillær elektroforese. PCR’er blev udført i et 10 pi reaktionsblanding bestående af 10 ng DNA-skabelon, 2,5 mM deoxyribonucleotid triphosphat mix (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland), 2,5 pmol sense- og antisense-primer (MWG, Ebersberg, Tyskland), 0,25 U AmpliTaq Gold-polymerase ( Applied Biosystems) og 5 pi nuclease-frit vand. PCR-betingelser bestod af gentagne cyklusser ved 95 ° C, 60 ° C-62 ° C og 72 ° C i 30 s. For AI bestemmelse, kapillarelektroforese med en ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Freiburg, Tyskland), ved anvendelse af en blanding af 40 ml formamid (Hi-Di), 0,2 pi Genescan-500-ROX Standard samt 0,1 pi PCR produkt og denaturering ved 94 ° C i 2 minutter blev udført og længden af ​​allele fragmenter og fluorescensintensitet blev vurderet. Allelerne blev defineret som de to højeste toppe inden for det forventede størrelsesområde og et forhold mellem ≥1.5 mellem tophøjderne for tumoren og normale alleler blev bedømt som AI. For den samlede kvalitetssikring, blev 10% af brugte prøver tilfældigt anvendt for gentagne analyser. Den overensstemmelse mellem allel status var . 99%

Fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) analyse

DNA-kopi antal tab analyse af to hot-spot områder baseret på AI analyser blev vurderet i en større studiepopulation ved fluorescens

in situ

hybridisering (FISH). Tre forskellige BAC sonder rettet mod regionerne 2 (RP11-570L13: 4q21.23 og RP11-1053C2: 4q22.1) og 3 (RP11-634D8: 4q31.2) blev hybridiseret på en TMA. De anvendte BAC prober blev opnået fra Source BioScience LifeSciences (Nottingham, UK). Én ug af hver BAC probe blev mærket ved tilfældig priming (BioPrime Labeling System, Invitrogen) med fluorescensmærkede dUTPs (RP11-570L13 og RP11-634D8: Spectrum Orange, RP11-1053C2: Spectrum Green; Enzo Life Sciences, Abbott). Som reference blev en centromer sonde (CEP 10, SpectrumAqua) ansat (Enzo Life Sciences, Abbott). For at kontrollere specificiteten og kvaliteten af ​​de fluorescensmærkede BAC prober blev FISH først testet på metafase-kromosomspredninger. Bagefter blev etableret protokoller for de paraffin objektglas for hver BAC probe separat. Først blev objektglassene inkuberet ved 60 ° C i en time, før de blev deparaffiniseret i xylen og hydratiseres i en ethanol-serien. Fikseringen blev opnået ved at placere objektglassene i en opløsning af 2% formaldehyd og methanol ved -20 ° C, efterfulgt af skylning dem i phosphatbufret saltvand (1x PBS) og præ-behandle dem med en forbehandling opløsning (Invitrogen) ved 90 ° C i 10 minutter. Efter PBS vask blev objektglassene behandlet med en forvarmet enzym-reagens (Invitrogen) ved 37 ° C i 10 min. Igen blev de vasket i PBS og derefter dehydreret i en ethanol-serien. Endelig blev objektglassene denatureret ved 85 ° C i 5 minutter, før de blev inkuberet med probehybridiseringsresultater blandinger ved 37 ° C natten over. Post-hybridisering vask blev derefter udført i 2 x SSC, 0,3% NP-40-puffer ved 70 ° C og stuetemperatur, efterfulgt af en anden hydratisering i en ethanol-serien. DAPI blev påført til påvisning af morfologisk intakte ikke-overlappende tumorceller. I gennemsnit blev fluorescerende signaler af 32 tumorceller for hver probe tælles (interval 11-57). For at vurdere den eksperimentelle bias, samt at definere afbrydelser af signal-til-centromere forholdet blev hybridiseringssignaler af 10 normale kontrolprøver (også placeret på TMA) tælles. Tilsvarende et forhold 1,5 blev defineret som en celle der bærer en DNA-forstærkning, mens et forhold 0,75 blev defineret som et tab

Fortløbende immunfluorescensfarvning og FISH-analyse

For. isolering af dobbeltbeskatningsoverenskomster blev mononukleære celler fra knoglemarvsaspirater af NSCLC-patienter isoleret ved Ficoll gradientcentrifugering. Cellerne blev derefter cyto-centrifugeret på objektglas. At påvise dobbeltbeskatningsoverenskomster, blev en immuncytokemi farvning udført i overensstemmelse med APAAP fremgangsmåden (alkalisk phosphatase anti-alkalisk phosphatase) under anvendelse af et antistof mod cytokeratiner (A45-B /B3, Micromet, Martinsried, Tyskland) [16]. En isotype-matchet, murint monoklonalt antistof (MOPC 21, gG1, Sigma- Aldrich) tjente som negativ kontrol. DTC-positive patienter blev anvendt til analyse af tab af 4q22.1 ved FISH-analyse. FISH blev udført på tumorceller, der blev detekteret på forhånd ved IF farvning med en Cy3 mærket anti-cytokeratin antistof (A45-Cy3, Micromet). For celle fiksering blev opløsning B (Micromet), der anvendes. Efter en PBS vask trin blev uspecifikke bindingssteder blokeret med 10% AB-serum (Biotest AG, Dreieich, Tyskland). En anden PBS vask blev efterfulgt af 45 min A54-Cy3 antistofbehandling (1:300). Celler blev igen vasket og DAPI (CellSearch) blev anvendt til nuklear farvning. Dobbeltbeskatningsoverenskomster blev identificeret i en automatiseret måde (ARIOL Scan, Leica Biosystems, Nussloch, Tyskland) og lokaliseret med England Finder for re-identifikation. For fortløbende FISH-analyse blev celler vasket med PBS og inkuberet i 7 minutter i en forvarmet proteinase K (0,1 ug /ml) opløsning (20 mM Tris-HCI pH 7,5, 0,2% CaCl2xH2O ad 50 ml Aqua dest.). Derefter blev cellerne dehydratiseret i en ethanol-serien og denatureret i 5 minutter ved 75 ° C (70% formamid, 0,6 x SSC, pH 7,4). Celler blev igen dehydreret og probehybridiseringsresultater blandinger blev denatureret i 5 minutter ved 75 ° C. Hybridisering blev udført natten over ved 37 ° C. Post-hybridisering vask blev udført i 50% formamid /2 x SSC, i 2 x SSC og i 0,1 x SSC ved 45 ° C. Efter anvendelse DAPI blev dobbeltbeskatningsoverenskomster flyttet og fluorescerende signaler af centromer 3 og RP11-1053C2 sonder blev talt. Et forhold på 0,75 blev defineret som et tab

Statistisk analyse

For statistisk analyse, SPSS 21,0 til MAC (SPSS Inc., Chicago, IL) blev anvendt.. Sammenhæng mellem AI /kopi nummer ændringer og klinisk-patologiske parametre blev vurderet ved chi-square test. Den samlede overlevelse (OS) blev beregnet som perioden fra datoen for kirurgi til enten dødsdagen eller sidste opfølgning, alt efter hvad skete først inden for 60 måneder. Sygdommen overlevelse (DFS) blev defineret som perioden fra datoen for kirurgi til datoen for tilbagefald eller tumor-relaterede dødsfald, alt efter hvilken indtraf først inden for 60 måneder. Patienter i live uden tilbagefald på den sidste opfølgning dato eller efter 60 måneder blev censureret. In-hospital mortalitet (inden for 60 dage) førte til udelukkelse fra overlevelse analyse. Overlevelse blev analyseret ved hjælp af log-rank test og afbildet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Hvis ikke andet er angivet, er resultater præsenteret som median overlevelse i måneder med 95% konfidensinterval (95% CI). For en multivariat analyse blev cox regression fare model, der anvendes til at vurdere den prognostiske værdi af AI /kopi nummer ændringer. Resultaterne er præsenteret som hazard ratio (HR) og 95% CI. Væsentlige udsagn refererer til P-værdier på to-tailed test . 0,05

Resultater

mikrosatelitter analyse

Undersøgelsen kohorte anvendes til mikrosatellit analyse bestod af i alt 86-matchede carcinom og normale vævsprøver af lungekræftpatienter, der undergik kirurgi. En mikrosatellit-analyse blev udført i alt fire regioner på kromosom 4q, under anvendelse af to polymorfe markører for hver region. Alleliske markører tæt på hinanden afsløret meget lignende frekvenser af sletning, der fører til den endelige tab af heterozygositet frekvenser 18,6% (

n =

16) i region 1; 23,3% (

n =

20) i region 2; 25,6% (

n =

22) i region 3 og 34,9% (

n =

30) i region 4. sats for ikke-informative sager varierede fra 16,3% til 36,0%, afhængig på markøren. Ved at bruge to markører for AI detektion i hver region, kan de ikke-informative tilfælde reduceres til intervaller fra 2,3% til 15,1%. Region 1 og 3 havde overensstemmende resultater (normal /tab), mens region 2 indeholdt tre disconcordant resultater og region 4 indeholdt en af ​​hver. Alle disconcordant resultater blev gentaget, og resultaterne forblev identiske, hvilket indikerer en mulig breakpoint mellem markørerne. I alt 45,3% (

n =

39) viste mindst en allel tab inden for de analyserede regioner. Inden for disse patienter, 17,9% (

n =

7) viste et tab i alle regioner. Detaljerede numeriske resultater er angivet i tabel 1 og S1 figur, supplerende oplysninger.

AI på kromosom 4q og klinisk-patologiske karakteristika

Der var ingen tegn på en signifikant statistisk sammenhæng mellem AI med klinisk-patologisk karakteristika i de fire undersøgte regioner. Men 83,3% (

n =

15) af patienterne med AI i region 2 udviklede et tilbagefald i modsætning til 16,7% (

n =

3) uden AI (P = 0,073).

AI på kromosom 4q som prognostisk markør for overlevelse

i univariat overlevelse analyser, en tendens til kortere median sygdomsfri (DFS) og total overlevelse (OS) hos patienter med AI i region 1 og 2 var tydelig (median overlevelse forskel fra 11,9 måneder til 14 måneder, er givet i S3 tabel). Men forskelle ikke statistisk signifikans (P 0,05). Da undersøgelsen kohorte for overlevelse analyser var begrænset til 68-77 sager, herunder UICC stadie IV patienter samt patienter med positive resektionsmarginer, confounding effekter på overlevelse analyse blev forventes. Det var tydeligt for region 2. Derfor, efter stratificering efter alder, køn, tumor stadie, og resektionsmarginer parametre, tilstedeværelsen af ​​AI i region 2 blev vist sig at være en uafhængig prognostisk markør for DFS (HR 3,82,

P =

0,044). En lignende ikke-signifikant tendens sås også til OS (HR 3,56,

P =

0,072). En UICC tumor stadie ≥ III var den stærkeste, og kun yderligere negativ prognostisk markør for DFS og OS, med HR 4,22 (

P =

0,007) og HR 2,87 (P = 0,047) henholdsvis (S4 tabel).

FISH kopi nummer analyse

Baseret på de rapporterede allelotyping resultater, vi søgte at verificere disse resultater i en større undersøgelse befolkning ved FISH-analyse. To forskellige BAC sonder, en hybridiserer til region 2 og én hybridiserer til region 3 blev etableret (S5 tabel).

For regionen 4q21.23 opdaget af RP11-570L13 blev en DNA-tab set i 24,9% (

n =

52) og en DNA-gevinst i 4,3% (

n =

9) af de analyserede prøver. Et tab opdages på denne position viste en betydelig histologisk type afhængig sammenhæng, med 38,0% (

n =

30) tab i SQCC i modsætning til 22,7% (

n =

15,

P =

0,049) i AC. Analysen med sonde RP11-1053C2 afslørede tab i 30,6% og gevinst i 7,2% (

n =

15), igen afslører en markant hyppigere tabsprocent i SQCC (44,6%,

n =

33) sammenlignet med AC (23,3%,

n =

17,

P =

0,022).

Brug sonde RP11-634D8 (område 3), satsen for vellykket analyse var 71,6% (

n =

204). En DNA-kopi nummer tab blev påvist i 36,8% (

n =

77) og en gevinst i 7,7% (

n =

16) af de analyserbare prøver.

Kopiér nummer tab på kromosom 4q og klinisk-patologiske karakteristika

Kopiér nummer tab ved position 4q21.23 (RP11-570L13) viste en signifikant sammenhæng med avanceret tumorstørrelse (

P =

0,005), men uden andre patologiske egenskaber. Kopiér nummer tab ved position 4q22.1 (RP11-1053C2) viste en signifikant sammenhæng med tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastaser (tab PN0: 25,2%,

n =

26 versus tab ≥pN1: 44,0%,

n =

37;

P =

0,005) samt avancerede UICC stadium (tab UICC I: 25,3%,

n =

23 versus tab UICC ≥II: 41,4%,

n =

41;

P =

0,032). Kopiér nummer tab ved position 4q31.2 (RP11-634D8) viste en signifikant sammenhæng med avanceret tumorstørrelse (

P =

0,019). Men ikke yderligere korrelationer med klinisk-patologiske karakteristika var tydelige (S5 tabel).

Kopier nummer tab på kromosom 4q som prognostisk markør for overlevelse

I forbindelse med en univariat analyse, kopi nummer tab ved position 4q21.23 (RP11-570L13) viste en ikke-signifikant tendens til kortere median DFS (12,5 måneder versus 28,0 måneder,

P =

0,056). Undergruppe analyser viste dog en stærk korrelation med DFS i SQCC undergruppe (11.2 måneder versus 39,1 måneder, p = 0,031;. Figur 1, S6 tabel). En tilsvarende virkning på OS blev rapporteret for hele undersøgelsen kohorten (23,9 måneder versus 42,6 måneder,

P =

0,033) og SQCC undergruppe (12,5 måneder versus 41 måneder,

P =

0,031, figen . 2, S6 Table)

a:. Kopier nummer tab ved position 4q21.23 (RP11-570L13) viste en tendens til kortere median sygdomsfri overlevelse (DFS) i univariat analyse (12,5 måneder versus 28,0 måneder,

P =

0,056). B: Kopi nummer tab ved position 4q21.23 (RP11-570L13) i pladecellecarcinom (SQCC) undergruppe viste stærke korrelationer med kortere DFS (11.2 måneder versus 39,1 måneder)

P =

0,031. C: Kopi nummer tab ved position 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhænge med kortere DFS (12,5 måneder versus 32,7 måneder),

P =

0,010. D: Kopi nummer tab ved position 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhænge med kortere DFS i SQCC undergruppe (11,7 måneder versus 35,5 måneder),

P =

0,027. Overlevelse grunde til forstærkning afvigelser var falmet ud for overskuelighedens skyld

A:. Kopier nummer tab ved position 4q21.23 (RP11-570L13) viste stærke korrelationer med kortere median samlet overlevelse (OS) i univariat analyse (23,9 måneder versus 42,6 måneder),

P =

0,033. B: Kopi nummer tab ved position 4q21.23 (RP11-570L13) i pladecellecarcinom (SQCC) undergruppe viste stærke korrelationer med kortere OS (12,5 måneder versus 41 måneder),

P =

0,031 C: Kopi nummer tab ved position 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhænge med kortere DFS (25,8 måneder versus 40,3 måneder),

P =

0,012. D: Kopi nummer tab ved position 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhænge med kortere DFS i adenocarcinom undergruppe (10,0 måneder versus 43,1 måneder),

P =

0,035. Overlevelse grunde til forstærkning afvigelser var falmet ud for overskuelighedens skyld.

Kopier nummer tab ved position 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhænge med kortere median DFS inden hele undersøgelsen kohorten samt som inden for SQCC undergruppe (12,5 måneder versus 32,7 måneder,

P =

0,010 og 11,7 måneder versus 35,5 måneder,

P =

0,027;. figur 1, S6 tabel). Endvidere blev et tab på 4q22.1 forbundet med kortere OS inden hele undersøgelsen kohorten og AC undergruppe, hvorimod ingen sammenhæng blev set i SQCC undergruppe (hele undersøgelsen kohorte: 25,8 måneder versus 40,3 måneder,

P =

0,012, AC undergruppe: 10,0 måneder versus 43,1 måneder,

P =

0,035, figur 2, S6 Table)

I modsætning hertil kopi nummer gevinster ikke afsløre en sammenhæng med overlevelse ved.. nogen af ​​de analyserede positioner. I overensstemmelse med resultaterne af AI undersøgelsen kohorte, kopiere nummer tab på region 3 (RP11-634D8, position 4q31.2) havde ingen effekt på overlevelsen (S6 tabel).

Multivariate analyser identificeret kopi nummer tab på position 4q21.23 (RP11-570L13) som en negativ prognostisk markør for DFS og OS for hele undersøgelsen kohorten (cox proportional hazard model, stratificeret efter alder, køn, margin clearance, sortering og UICC fase; DFS: HR 1,77 (1.10- 2,84 95% CI),

P =

0,019; OS: HR 2,20 (1,33-3,64 95% CI),

P =

0,002, tabel 2) såvel som for SQCC undergruppe ( DFS: HR 2,85 (1,35-6,04 95% CI),

P =

0,006; OS: HR 2,77 (1,26-6,13 95% CI),

P =

0,012, S7 tabel). Lignende resultater blev set for kopi nummer tab ved position 4q22.1 vedrørende hele studiegruppen (RP11-1053C2; DFS: HR 1,64 (1,03-2,61 95% CI),

P =

0,038; OS: 1,84 ( 1,12-3,01 95% CI),

P =

0.015, tabel 3), mens undergruppe analyse nåede ikke statistisk signifikans (S8 tabel). En anden model af multivariate analyser herunder administrationen af ​​adjuverende kemoterapi blev udført (oplysninger i 116 patienter). Resultaterne forblev signifikant, når administrationen af ​​adjuverende kemoterapi var inkluderet (data ikke vist).

Sammenfattende begge positioner i region 2, nemlig 4q21.23 (RP11-570L13) og 4q22 0,1 (RP11-1053C2), blev identificeret som en negativ prognostisk markør for DFS samt OS i hele undersøgelsen kohorte. Det er imidlertid kun tab ved position 4q21.23 nåede signifikans også i SQCC undergruppe. En flowdiagram opsummerer overlevelse analyser af studiet kohorten, er fremskridtene og resultaterne studie givet i S2 og S3 Tal.

Case rapport af 4q21.23 tab i dobbeltbeskatningsoverenskomster

Baseret på vores tidligere konstateringen af, at 4q12-32 tab korrelerer med positiv DTC-status, ønskede vi at undersøge, om et tab af denne region er også til stede i dobbeltbeskatningsoverenskomsterne fra en patient med 4Q tab i den primære tumor [14]. Et tab af 4q22.1 blev påvist i 77% (17/22) af patienterne dobbeltbeskatningsoverenskomster. Rækken af ​​RP11-1053C2 sonde og centromerfusioner 3 signaler var heterogene, varierende fra 1 til 5 signaler (gennemsnit 1,7 og 2,7 henholdsvis). FISH-analyse blev også udført på paraffinindlejret primær tumor og lunge tilbagefald materiale fra den samme patient (fig. 3). Disse resultater igen afsløret et tab på 4q22.1 og høj grad af heterogenitet i de enkelte celler spænder fra 0-4 signaler i primær tumor og 0-5 i tumor tilbagefald materiale.

Bone-marv celler i patientens blev immuncytokemisk farves mod cytokeratin hjælp af APAAP-metoden. En positiv DTC (rød) og en negativ leukocyt (brun) er vist. B: Knoglemarven celler fra patienten blev farvet fluorescerende mod cytokeratin (rødt signal) efterfulgt af FISH-analyse i C) med RP11-1053C2 sonde og CEN3 probe (RP11-1053C2 probe: 1 grønt signal; CEN3 probe: 3 spektrum appelsin signaler ; kernefarvning i DAPI). Cen7 sonde (Cen7 sonde: spektrum aqua vises i pseudo-farve magenta) var desuden anvendt til FISH-analyse på D) primær tumor (2-5 appelsin signaler /celle, 2-4 magenta signaler /celle og 0-2 grønne signaler /celle) og E) tumor tilbagefald FFPE materiale (3-6 appelsin, 4-5 magenta og 1-3 grønne signaler /celle).

diskussion

I en tidligere undersøgelse var vi i stand til at identificere fem kromosomale regioner differentierende patienter med eller uden tumor spredning tidligt. Tab af 4q12-q32 viste den stærkeste korrelation med den positive DTC status. Treoghalvfjerds gener i denne region blev fundet nedreguleret blandt knoglemarv-positive NSCLC-patienter, hvilket indikerer en sandsynlig tilstedeværelse af tumorsuppressorgener i denne region [14]. I denne undersøgelse, var vi i stand til at indsnævre målområdet og identificere kopi nummer tab inden for en mindre end 4 Mb-spænder region på kromosom 4q21.23-22.1 som selvstændige prognostiske markører for DFS, samt operativsystem i NSCLC. Tilstedeværelsen af ​​kopi nummer tab inden denne region var forbundet med mindst 18 måneders kortere median overlevelse, sammenlignet med patienter med normal kopi numre. Desuden tilstedeværelsen af ​​kopital tab forårsaget en øget risiko for recidiv og død spænder fra 1,6 op til 2,9 inden 60 måneder opfølgning, uafhængig af etablerede prognostiske markører for NSCLC (afhængig af histologisk undertype og placering af kopi nummer tab) . Desuden i vores tilfælde rapport studie, var vi i stand til at påvise, at tabet af kromosomal region 4q21.23 er ikke kun til stede i både den primære lunge tumor og i tumor tilbagefald væv, men også i en stor del af meget heterogene dobbeltbeskatningsoverenskomster. Dette understreger betydningen af ​​denne kromosomale region for formidling tumor. Uniparental disomi er en mekanisme for, hvordan et tab af heterozygositet i celler kan stamme [17]. I NSCLC vi ikke kendskab til undersøgelser, der indikerer uniparental disomi på 4Q. Desværre kunne vi ikke foretage nogen specifik forskning om, hvorvidt AI i vores prøver skyldtes uniparental disomi, da prøverne for AI og FISH analyser ikke var overlappende. Vi var ikke i stand til at udtale, om en 4q tab forekommer hyppigere i en polysomic tilfælde af kromosom 4 som vi brugte centromer 10 som reference. I vores oprindelige papir, der beskriver sammenhængen mellem tab af 4q og positiv DTC-status undersøgte vi 30 NSCLC patienter med matrix CGH. I denne temmelig lille antal tilfælde, kunne vi ikke finde nogen sammenhæng mellem tab af 4q og det samlede antal kromosomafvigelser [14], hvilket indikerer, at tabet af 4q er specifikt forbundet med metastatisk adfærd, uafhængigt af niveauet for kromosomal ustabilitet i tumoren .

Tab af forskellige størrelser regioner på kromosom 4q er blevet forbundet med lavere overlevelsesrater i mange typer af epitelcancer herunder colorektal cancer, duktal pancreas adenocarcinom, hepatoblastoma og mundtlige pladecellecarcinom [3], [18] – [22]. Desuden i NSCLC, tab af 4q har været forbundet med metastatisk lunge adenokarcinomer. Men størrelsen og placeringen af ​​de 4q deletioner varierer mellem de forskellige undersøgelser [3], [18] – [22]

Udover identifikation af 4q målregionen i NSCLC og dets potentielle kliniske relevans, vores. data indikerer histologiske subtype-specifikke afvigelser i form af allele tab frekvenser og prognostisk relevans. Undergruppe analyse viste en signifikant højere allel tab i SQCC sonder i modsætning til AC sonder. I overensstemmelse med disse forskelle, tab på 4q21.23 (med markør RP11-570L13) inden region 2 blev identificeret som en negativ prognostisk markør for DFS og OS i hele NSCLC studiet kohorte og især SQCC undergruppe. Denne region blev ikke anset for at være en uafhængig prognostisk markør i AC undergruppe. De observerede histologiske subtype-specifikke allel tabsfrekvenser med variabel indflydelse på overlevelse er i tråd med tidligere undersøgelser rapporterer flere kromosomale regioner differentiere SQCC fra AC, herunder de mere almindelige tab af 4q i SQCC [5], [8] – [10], [23], [24]. Desuden har talrige undersøgelser vist, at disse forskellige genomiske ændringer af AC og SQCC kunne give lovende muligheder for potentielle målrettede behandlinger af lungekræftpatienter [11]. Da LCLC og neuroendokrine lungekræft undergrupperne var for lille til undergruppeanalyser, er yderligere undersøgelser nødvendige for at vurdere den potentielt afvigende indvirkning allele ubalancer på 4q på disse histologiske undertyper.

Vores undersøgelse kohorte omfattede ikke præcancerøse læsioner. Som følge heraf er det stadig uklart, hvornår disse afgørende allele ubalancer forekommer inden tidslinjen for lungekræft patogenese.