PLoS ONE: Ufuldstændig radiofrekvens ablation Forbedrer invasiv og Metastase af resterende Cancer af hepatocellulært carcinom Cell HCCLM3 via Aktivering β-Catenin Signaling

Abstrakt

Baggrund

radiofrekvenser ablation (RFA) er en af ​​de helbredende behandlinger af hepatocellulært carcinom (HCC), dog accelereret progression af resterende HCC efter ufuldstændig RFA er rapporteret hyppigere. Den underliggende molekylære mekanisme af dette fænomen er endnu ikke klarlagt. I denne undersøgelse anvendte vi et ufuldstændigt RFA ortotopisk HCC nøgen musemodel til at studere den invasive og metastatiske potentiale residual cancer samt korrelerede mekanisme.

Metoder Salg

ufuldstændige RFA orthotopisk nøgen mus modeller blev etableret ved hjælp af høj metastatisk potentiale HCC cellelinje HCCLM3 og lav metastatisk potentiale HCC HepG2 hhv. Ændringerne i cellulær morfologi, bevægelighed metastaser og epitelial-mesenkymale overgang (EMT), og HCC celle molekylære markører efter

in vitro

in vivo

blev observeret ufuldstændige RFA intervention.

Resultater

Pulmonal og intraperitoneal metastaser blev observeret i en

in vivo

undersøgelse. Den underliggende pro-invasiv mekanisme af ufuldstændig RFA syntes at være forbundet med fremme EMT, herunder nedregulering af E-cadherin og opregulering af N-cadherin og vimentin. Disse resultater var i overensstemmelse med

in vitro

respons HCC-celler til at opvarme intervention. Yderligere undersøgelser viste, at β-catenin var et afgørende faktor under dette kursus og blokering β-catenin reducerede metastase og EMT fænotype ændringer i varmebehandlede HCCLM3 celler

in vitro

.

Konklusion

Ufuldstændig RFA forbedret den invasive og metastatiske potentiale resterende kræft, ledsager med EMT-lignende fænotype ændringer ved at aktivere β-catenin signalering i HCCLM3 celler

Henvisning:. Zhang N, Wang L, Chai ZT, Zhu ZM, Zhu XD, Ma DN, et al. (2014) Ufuldstændig radiofrekvens ablation Forbedrer invasiv og Metastase af Resterende Cancer af hepatocellulært carcinom Cell HCCLM3 via Aktivering β-Catenin Signaling. PLoS ONE 9 (12): e115949. doi: 10,1371 /journal.pone.0115949

Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Juni 14, 2014, Accepteret: November 27, 2014; Udgivet: 26 December, 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud nummer: 81.372.314).; Shanghai Natural Science fond for Ungdom Lærde (12ZR1442300); National Key Project for smitsomme sygdomme (2012ZX10002012-004). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er den femte mest almindelige kræftform i verden og den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald [1]. Selvom kirurgisk resektion er den standard behandling modalitet for HCC, er dens anvendelse normalt begrænset, fordi de fleste patienter, selv med små HCC, har forbundet alvorlig leverdysfunktion [2], [3]. Levertransplantation giver en alternativ behandling for små inoperabel HCC imidlertid manglen på leveren transplantater begrænser anvendeligheden af ​​denne fremgangsmåde [4]. På grund af disse omstændigheder er der indført flere ikke-kirurgiske teknikker til HCC behandling, såsom radiofrekvens ablation (RFA), perkutan ethanol injektion (PEI) og mikrobølge koagulering terapi (MCT) [5], [6]. Blandt disse teknikker, RFA er i øjeblikket den mest udbredte behandling mulighed på grund af sin enkelhed, sikkerhed, minimal invasiv, repeterbarhed og kortere hospitalsophold [4]. RFA betragtes som den bedste mulighed for inoperabel HCC patienter med højst tre leverknuder, en maksimal diameter tumor 3 cm, og med bevaret leverfunktion (Child-Pugh A og B) [7], [8]. Men en af ​​de store udfordringer med RFA er resterende tumorvæv og lokalt recidiv efter lokal behandling, blev det rapporteret, at de post-RFA tilbagevendende varierer fra 49 til 74% [9] – [11]. Endvidere lokale tilbagevendende tumor efter RFA viste en mere invasiv vækst, mere vaskulær invasion og mindre differentiering i forhold til tumorer i patienter uden RFA [12].

Wnt /β-catenin pathway er en vigtig signalvej i HCC [13], [14]. Det er blevet rapporteret, at en tredjedel af HCC er associeret med afvigende ekspression af β-catenin [15]. β-catenin (CTNNB1), er et centralt molekyle i Wnt signalvejen, og er et multifunktionelt protein involveret i celle-celle-adhæsion, signaltransduktion, cellulær differentiering regulering og proliferation. Vores hold havde bevist, at hypoxi kunne fremkalde β-catenin overekspression og /eller intracellulær akkumulering i fire HCC cellelinjer gennem nedregulere den endogene nedbrydning maskiner, og hypoxi kan også forbedret invasionsevne

in vitro

og metastase

in vivo

for Hep3B og MHCC97 celler [16]. Mutationer i Wnt /β-catenin pathway medlemmer også resultere i afvigende aktivering af målgener, herunder dem, der koder for aktivatorer af epitel-mesenkymale overgang (EMT) [17]. EMT spiller en central rolle i de kritiske faser af fosterudviklingen og bidrager til fysiologiske processer, såsom væv reparation, regenerering og patologiske tilstande, herunder carcinogenese og fibrose. Derudover er det også deltager i intrahepatisk formidling og fjernmetastaser under HCC progression [18] – [21]. β-catenin spiller en afgørende rolle i opståen og progression af EMT. Flere undersøgelser har påvist sammenhængen mellem β-catenin signalering og EMT [22]. Oh et al. rapporterede, at β-catenin-aktivering forårsaget induktion af Sneglen og ZEB1 ekspression, mesenchymal cellemarkør ekspression og repression af E-cadherin-ekspression i nogle epitelceller i patogenesen af ​​adenomyose [23]. Zhao et al. forudsat beviser, Wnt /β-catenin signalvejen er direkte involveret i EMT fremkaldt af HIF-1α, og blokering Wnt /β-catenin signalvej forårsaget tilbageførsel af EMT og metastatiske fænotyper ændringer [24]. Men er stadig uklart, hvilken rolle β-catenin i residual cancer efter ufuldstændig RFA. I denne undersøgelse, vi observeret, at ufuldstændig RFA forbedret den invasive og metastatiske potentiale resterende kræft, og undersøgte ændringer i β-catenin ekspression i ufuldstændige RFA tumorvæv

in vivo

i varmebehandlede HCC celler

in vitro

. Desuden vi evalueret dens betydning i metastatiske fænotype forandringer som følge af varme intervention.

Materialer og metoder

Cell Kultur og Dyr

HCCLM3 celler med høj metastatisk potentiale og HCCLM3-G celler, som var HCCLM3 celler transficeret med grønt fluorescensprotein, HepG2 celler med lav metastatisk potentiale og HepG2-G-celler, som blev HepG2 celler transfekteret med grøn fluorescens protein, blev anvendt i

in vitro

in vivo

eksperimenter, henholdsvis (etableret ved Liver Cancer Institute, Zhongshan Sygehus, Fudan University, Shanghai, Kina) [25]. Cellerne blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Gibco BRL, Rockville, MD, USA) med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 100 U /ml penicillin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. BALB /c nu /nu mus, der vejer 18-20 g ved 4-6 uger gamle, blev opnået fra SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, Kina. Alle mus blev holdt under SPF betingelser. Alle dyr protokoller blev godkendt af Etisk Udvalg om dyreforsøg af Animal Care udvalg af Fudan University. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelser forsøgsdyr (S1 Checkliste).

Udstyr og Etablering af ufuldstændige RFA ortotopisk Nude Mouse Model

Det vigtigste udstyr, der anvendes bestod af RITA medicinske system model 1500X RF generator (RITA Medical Systems, Fremont, CA, USA), optrækkelige multipel krog RFA nål (S1A fig.) (RITA stjerne Burst XL, angioødem Dynamics, Latham, NY, USA), og RITA jordforbindelse pads (angioødem Dynamics) .

De menneskelige HCC ortotopisk nøgen musemodeller med HCCLM3-G-celler og HepG2-G-celler blev etableret som beskrevet tidligere [26]. De nøgne mus blev tilfældigt opdelt i den ufuldstændige RFA (n = 12) og kontrolgruppen (n = 12). To uger efter ortotopisk implantation, blev den ufuldstændige RFA udføres som følger: efter anæstesi ved Pelltobarbitalum Natricum med administreret ved intraperitoneal injektion (50 mg /kg), dyret blev placeret på en ledende metalplade med benene fast og RITA jordforbindelse pads blev overholdt til bagsiden af ​​denne metalplade for at sikre god elektrisk ledningsevne. Dernæst blev abdomen hulrum mus åbnet og udsat orthotopisk tumor i venstre lap af leveren (S1B, C Fig.). Centret lige en af ​​RITA nål blev indsat i xenograft og normalt saltvand blev dryppet på indstiksstedet for at holde god ledningsevne. I betragtning af vægt og volumen af ​​nøgne mus, blev RFA udført med en lavere energi-protokol, med ud magt 5W og varighed af ca. 30 sekunder for at holde eksistensen af ​​tilbageværende cancer. Efter RFA blev maven hulrum i mus lukkes med 5-0 ikke-absorberbare suturer. Musene i kontrolgruppen var skin-opereret ved at indsætte en RFA nål i tumoren uden at udføre ablation.

Parametre Vurderet

Tre uger efter RFA procedure, seks mus fra hver gruppe blev aflivet for at evaluere tumorvækst og metastase. Den længste (a) og korteste (b) tumor diameter blev målt, og tumorvolumen blev beregnet som følger: Tumorvolumen (mm

3) = a (mm) x b (mm) x b (mm) /2 [ ,,,0],27]. Lungerne blev skåret ud og billeder af de grønne fluorescerende protein (GFP) -positive metastatiske foci blev opnået (stereomikroskop, Leica, Wetzlar, Tyskland). Lungevæv blev snittet serielt og H Slug, 5′-GGTCAAGAAGCATTTCAAC-3 ‘(fremad), og Slug, 5′-CTGAGCCACTGTGGTCCTTG-3′ (tilbage); Twist, 5’-TGTCCGCGTCCCACTAGC-3 ‘(fremad), og Twist, 5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGGA-3’ (tilbage).

Western Blot-analyse

Western blot procedurer, der anvendes, er beskrevet andetsteds [31]. Primære antistoffer anvendt, herunder:. Anti-E-cadherin, anti-N-cadherin, anti-vimentin, anti-β-catenin, anti-cyclin-D1 (Abcam) og anti-β-actin (Boster, Wuhan, Kina)

Immunhistokemi

Tumor væv blev fikseret, indlejret og skåret i 5 um tykke sektioner. Immunhistokemi farvning af E-cadherin, N-cadherin, vimentin og β-catenin blev udført som tidligere [30] beskrevne. Farvning resultater blev evalueret under et lysmikroskop ved en forstørrelse på × 200.

Statistisk analyse

Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af Students

t

test når data normalt blev distribueret eller de parametriske analyser af Mann-Whitney U-test, når data blev ikke normalt fordelt. Beregninger blev foretaget under anvendelse af SPSS 20.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikant ved et

s

værdi. 0,05

Resultater

Heat indgriben forfremmet proliferation, invasion og migration af HCC celle

in vitro

En

in vitro

proliferationsassay viste, at de varmebehandlede HCC-celler havde signifikant højere proliferation end i kontrol (fig. 1A), især ved 45 ° C i HCCLM3 celle og 47 ° C i HepG2-celle. I cellemigrationsassay, alle de varmebehandlede HCCLM3 celler udviste signifikant højere potentiale migration end den kontrolgruppen. (33,40 ± 2,16, 45,00 ± 3,21, 86,20 ± 3,39

vs.

19.00 ± 2.00), HepG2 celler behandlet med 44 ° C og 47 ° C viste højere potentiale migration end i kontrol (18,00 ± 1,52, 33,80 ± 2,63

vs.

11,60 ± 1,07) (fig. 1B). I celleinvasion assay HCCLM3 celler behandlet med 42 ° C og 45 ° C påvist den forøgede invasive evne (18,40 ± 0,87, 29,00 ± 1,82

vs.

5,60 ± 1,03), HepG2-celler behandlet med 44 ° C og 47 ° C udviste signifikant højere invasiv evne (12,20 ± 1,56, 19,40 ± 1,50

vs.

2,80 ± 0,67) (fig. 1B). Salg

(A) HCCLM3 og HepG2-celler blev dyrket med eller uden varme indgriben. De 24 timer, 48 timer og 72 timer cellelevedygtighed af HCC-celler blev målt under anvendelse CCK8 assay. Heat indgriben fremmes signifikant HCCLM3 og HepG2 celler proliferation. (B) Transwell assay viste, at de varmebehandlede HCCLM3 og HepG2-celler viste forbedret migration og invasion evne sammenlignet med kontrollerne.

Heat indgriben giver mesenkymale egenskaber til HCC celler

in vitro

varmebehandlede HCC-celler kan også få en EMT-lignende fænotype, morfologisk, de HCCLM3 celler og HepG2-celler ved 48 timer efter varme indgriben på 45 ° C og 47 ° C, henholdsvis viste en uregelmæssig fibroblast-lignende form i stedet for en typisk epitel brosten udseende (fig. 2A). I mellemtiden western blot (fig. 2B) og immunfluorescensfarvning (fig. 2C) demonstrerede en reduktion i ekspressionen af ​​epitelcelle markør E-cadherin i disse varmebehandlede celler, sammenlignet med kontrolcellerne. Samtidig blev den forøgede ekspression af de mesenkymale cellemarkører N-cadherin og vimentin også detekteret. Derudover blev mRNA ekspressionen af ​​EMT transkriptionsfaktorer (Snail, Slug og Twist) påvist ved RT-PCR. Forstærkningen af ​​Snail mRNA i varmebehandlede HCCLM3 celler og Slug mRNA i varmebehandlede HepG2-celler var statistisk højere end kontrollen (fig. 2D).

(A) HCCLM3 celler og HepG2-celler blev dyrket efter 45 ° C og 47 ° C varme indgriben hhv. Morfologiske forandringer i overensstemmelse med EMT (spindel-formede celler med tab af polaritet og øget intercellulære separation) blev observeret i varmebehandlede HCC celler i 48 timer sammenlignet med dem i kontrol. (B) Western blot analyse viste ekspression af E-cadherin, N-cadherin, vimentin i varmebehandlede HCC celler og i kontrol. HCCLM3 celler og HepG2-celler blev dyrket 48 timer efter 45 ° C og 47 ° C varme indgriben hhv. Immunofluorescens-farvning (C) viste, at ændringerne i cellulære EMT markører som reaktion på varme indgriben som karakteriseret ved nedregulering af E-cadherin og opregulering af N-cadherin og vimentin, sammenlignet med kontroller. RT-PCR (D) viste, at mRNA ekspressionen af ​​EMT relaterede transskription faktorer Snail, Slug, og Twist i HCC-celler.

Ufuldstændig RFA hæmmede tumorvækst men fremmet invasionsevne og fjernmetastaser

i vivo

Vi har udviklet en sikker og pålidelig metode til at etablere en ufuldstændig RFA ortotopisk nøgen musemodel og denne dyremodel kan være den første rapporterede ufuldstændig RFA ortotopisk nøgen mus model i henhold til litteraturen i PubMed. I ufuldstændig RFA gruppe, tumor størrelse HCCLM3-G og HepG2-G model var 449.58 ± 143,19 mm

3 og 299.83 ± 131.45 mm

3, henholdsvis som var mindre end kontrollerne (1788,75 ± 248.53 mm

3 i HCCLM3-G og 942.67 ± 144,16 mm

3 i HepG2-G,

P

. 0,05) (fig 3A). Den pulmonale metastaser sats i den ufuldstændige RFA gruppen af ​​HCCLM3-G (6/6) var højere end i kontrolgruppen (2/6) (fig. 3B). For yderligere at evaluere metastatiske potentiale af resterende kræft i HCCLM3-G efter ufuldstændig RFA blev serielle lunge paraffinsnit anvendes. De pulmonale metastaser i ufuldstændig RFA gruppe blev væsentligt forøget sammenlignet med kontrolgruppen (29,67 ± 2,56

vs

2,50 ± 1,58,

P

. 0,001) (. Figur 3C). På den anden side blev pulmonal metastaser ikke påvist i HepG2-G-model, uanset modtagende RFA eller ej (S2 fig.), Kunne imidlertid ufuldstændig RFA inducere peritoneal metastase (6/6), og blev ikke observeret nogen peritoneale metastaser i kontrol gruppe (0/0) (fig 3D.)

(A) i ortotopisk HCC model, tumor størrelser i den ufuldstændige RFA gruppen var mindre end dem i kontrol (HCCLM-G:. 449,58 ± 143,19

vs

1788,75 ± 248,53,

P

= 0,002; HepG2-G: 299,83 ± 131,45

vs

942,67 ± 144,16,

P

= 0,008) . (B) Kvantificering af bioluminescens viste, at ufuldstændig RFA accelererede pulmonal metastaser i HCCLM3-G-xenografter, sammenlignet med de matchede kontroller (pile indikerer pulmonale metastaser). Tre tumorer fra kontroller og tre ufuldstændige RFA behandlede tumorer blev sammenlignet ved både lyse felt (b) og fluorescens (f). Forekomsten af ​​pulmonal metastase (6/6) blev forøget i den ufuldstændige RFA gruppen, sammenlignet med kontrolgruppen (2/6). (C) H 0,001). (D) Kvantificering af bioluminescens viste, at ufuldstændig RFA kunne fremkalde intraperitoneal metastaser i HepG2-G-xenografter (6/6), sammenlignet med de matchede kontroller (0/6) (pile indikerer intraperitoneale metastaser).

ufuldstændige RFA inducerede ændringer i overensstemmelse med EMT i HCC xenotransplantater

Immunhistokemi udviste den typiske membranøs E-cadherin ekspression i celle-celle-kontakter i kontrolgruppe af HCCLM3-G, i modsætning hertil ufuldstændige RFA-behandlede tumorer viste reduktion af E-cadherin ekspression, samt opreguleringen af ​​N-cadherin og vimentin. I HepG2-G model blev nedreguleringen af ​​E-cadherin ekspression og opregulering af N-cadherin ekspression observeres også i ufuldstændig RFA gruppe (fig. 4A). Induktion af EMT ved ufuldstændig RFA blev påvist i xenotransplantattumorer af begge cellelinjer ved Western blot, og blev karakteriseret ved tabet af E-cadherin og opregulering af N-cadherin og vimentin i tumorvæv ufuldstændig RFA gruppe (fig. 4B). Desuden blev den forøgede mRNA-ekspression af EMT transkriptionsfaktor Sneglen og Slug undersøgt ved RT-PCR i HCCLM3-G-afledte og HepG2-G-afledte xenotransplantater henholdsvis (fig. 4C).

(A) Immunhistokemi afslørede, at E-cadherin-ekspression blev reduceret i ufuldstændig RFA gruppe af begge HCC cellemodeller, ekspressionsniveauet af N-cadherin i tumorvæv var højere i ufuldstændig RFA gruppe end i kontroller, og i HCCLM3-G model, forøget ekspression af vimentin blev også påvist i ufuldstændig RFA gruppe. (B) Western blot viste ændringerne af rester tumorer var i overensstemmelse med EMT i ufuldstændig RFA gruppe (f.eks nedregulering af E-cadherin og opregulering af N-cadherin, vimentin) af begge HCC-celle modeller. (C) RT-PCR viste ekspressionen af ​​transkriptionsfaktorer sneglen, Slug, og Twist på mRNA-niveauet i tumorvæv. Det er dog kun Snail mRNA i HCCLM3-G model og Slug mRNA i HepG2-G model var signifikant opreguleret i ufuldstændig RFA gruppe, henholdsvis (

P

0,05).

Ufuldstændig RFA induceret β-catenin aktiverende ledsaget med EMT

in vivo

in vitro

af HCCLM3

at udforske de molekylære mekanismer, der er involveret i EMT af varmebehandlet HCC celler, forsøgte vi at teste, om β-catenin signalering blev aktiveret. I HCCLM3-G model, immunhistokemi-farvning afslørede en signifikant forøget intracellulær akkumulering af β-catenin i ufuldstændig RFA-behandlede tumor, men ikke i HepG2-G model (fig. 5A). Disse resultater stemte overens med β-catenin proteinekspression i den ufuldstændige RFA-gruppen og kontrolgruppen ved Western blot (fig. 5B). Ophobning af cytoplasmatisk og nuklear β-catenin er en indikation af aktiveret β-catenin-afhængig signalering, så vi yderligere at undersøge, om øget β-catenin-ekspression påvirkede β-catenin pathway aktivitet. Immunfluorescensfarvning viste forøget ekspression af β-catenin i både cytoplasmaet og kernen af ​​de varmebehandlede HCCLM3 celler, sammenlignet med kontrollen celler

in vitro

imidlertid den samme tendens i de varmebehandlede HepG2-celler var ikke observeret (fig. 5C). Desuden blev en markant intracellulær translokation af β-catenin i de varmebehandlede HCCLM3 celler verificeret ved Western blot-analyse (fig. 5D). At undersøge virkningen af ​​varme indgriben inducere nuklear translokation af β-catenin på genekspression, vendte vi opmærksom på β-catenin signalvej nedstrøms målgen Cyclin-D1. Western blot viste, at ekspressionen af ​​cyclin-D1 også blev forøget med total β-catenin overekspression i de varmebehandlede HCCLM3 celler

in vitro

(fig. 5E).

(A) Immunhistokemi afslørede, at β-catenin udtryk blev øget i ufuldstændig RFA gruppe af HCCLM3-G-xenografter (

P

= 0,002); i HepG2-G-xenografter, var der ingen signifikant forskel mellem to grupper i β-catenin-ekspression (

P

= 0,843). (B) Western blot viste forbedrede β-catenin udtryk i tumorvæv efter ufuldstændig RFA sammenlignet med kontrollerne af HCCLM3-G xenografter. (C) Immunfluorescensfarvning viste den stærke cytoplasmatiske og nukleare lokalisering af β-catenin i varmebehandlede HCCLM3 celler, og den typiske membranøs β-catenin ekspression i celle-celle-kontakter HCCLM3 celler i kontrol. Der var imidlertid ingen signifikant forskel mellem to grupper i β-catenin ekspression af HepG2-celler. (D) Fordeling af β-catenin i cytoplasmaet og kernen af ​​HCCLM3 celler blev påvist ved western blot

in vitro

. (E) Western blot-analyse udstillet udtryk for total β-catenin og dens downstream målgen cyclin-D1 af både to HCC celler

in vitro

.

Den forbedrede invasion potentiale og EMT-lignende ændringer af varmebehandlede HCCLM3 celler kan delvist svækket ved tavshed β-catenin

in vitro

for yderligere at belyse, om aktivering af β-catenin funktionelt var forbundet med forøget invasionsevne og EMT-lignende ændringer i varmebehandlede HCCLM3 celler, brugte vi CTNNB1 siRNA transfektion og undersøgt dens virkninger på HCCLM3 celler. For at kontrollere virkningerne af transfektion blev immunfluorescensfarvning og western blot anvendes. Som vist i fig. 6A, blev den typiske cellemembran ekspression af β-catenin reduceret efter transfektion og den totale β-catenin-protein blev reduceret i HCCLM3-siCTNNB1 celler, sammenlignet med kontrollen af ​​HCCLM3-mock celler (Fig. 6B). Som vist i fig. 6C, under normale forhold, forskellen i gennemtrængende celle numre mellem HCCLM3-mock celler og HCCLM3-siCTNNB1 celler var ikke statistisk signifikante. Men efter indførelsen af ​​varme indgriben, antallet af HCCLM3-siCTNNB1 celler i både migration array og invasion matrix var mindre end HCCLM3-mock celler (fig. 6C). Desuden kunne lyddæmpning af CTNNB1 påvirke ekspressionen af ​​EMT transskription faktor, RT-PCR viste, at ekspressionen af ​​Snail mRNA af varmebehandlede HCCLM3-siCTNNB1 celler blev reduceret i forhold til modparten i varmebehandlede HCCLM3-mock celler (Fig . 6D). Western blot-analyse bekræftede også, at undertrykkelse af β-catenin påvirkede ekspressionen af ​​β-catenin-medieret EMT markører i varmebehandlede HCCLM3 celler, og ekspressionen af ​​cyclin-D1 blev også svækket (fig. 6E). Kollektivt, de ovenstående resultater viste, at aktivering af β-catenin var funktionelt relevant for invasion og metastase af HCCLM3 celler medieret af varme indgriben.

(A) Immunofluorescens farvning viste, at β-catenin udtryk delvist blev svækket ved at lukke munden af CTNNB1 i HCCLM3 celler. (B) De proteinniveauer af β-catenin målt ved Western blot-analyse efter siCTNNB1 transfektion. (C) Repræsentative billeder af migration og invasion af HCCLM3-mock celler og HCCLM3-siCTNNB1 celler i Transwell assay. HCCLM3-mock celler og HCCLM3-siCTNNB1 celler blev dyrket 48 timer efter 45 ° C varme intervention og normal tilstand, henholdsvis RT-PCR (D) viste den relative mRNA ekspressionen af ​​transskription faktorer Snail, Slug, og Twist. Western blot (E) afslørede udtryk for EMT relateret transkriptionsfaktorer og cyclin-D1.

Diskussion

På nuværende tidspunkt et stigende antal kliniske undersøgelser har identificeret den hurtige progression af resterende kræft efter ufuldstændig RFA i behandling HCC [32], [33]. Tidligere undersøgelser havde givet flere potentielle mekanismer, der kan hjælpe forklare disse fund. Hypertermi kan spille en vigtig rolle i den hurtige vækst af resterende HCC efter RFA ved at fremme angiogenese af resterende HCC via HIF-1a /VEGFA [34]. En anden undersøgelse viste, at suboptimal RFA accelereret HCC vækst og spredes ved transient at inducere en EMT-lignende og mere aggressiv cellulær fænotype [35]. I den foreliggende undersøgelse, indførte vi RFA i en orthotopisk nøgen mus HCC model og demonstreret betydningen af ​​ufuldstændig RFA behandling på tumorvækst og invasivitet. Selvom xenograft tumorvolumener blev reduceret efter ufuldstændig RFA behandling, viste de resterende tumorer mere invasive evner i ufuldstændige RFA-behandlede mus, som indikeret ved øget pulmonal eller intraperitoneal metastase. På den anden side,

in vitro

varmebehandlede HCC-celler udviste øget motilitet og invasionsevne. Disse resultater var i overensstemmelse med resultaterne af tidligere undersøgelser ved hjælp af andre dyr kræftmodeller. I en translationel murin model, Kroeze et al. identificeret at ufuldstændig termisk ablation stimuleret proliferation af resterende renale carcinomaceller [36]. Ke et al. fundet resterende hepatisk VX2 karcinom efter ufuldstændig RFA kunne lette hurtig progression i en VX2 carcinom kanin model, og de centrale tumor volumen og lungemetastaser af RFA-behandlede kaniner steg betydeligt [37].

havde identificeret Montering beviser en signifikant sammenhæng mellem EMT og invasivitet i forskellige typer af tumor [38] – [40]. Heri viste vi, at varme indgriben stimulerede transformation af HCC-celler fra en typisk epithelial fænotype til en spindel-formet mesenkymale fænotype, ledsaget af nedregulering af E-cadherin og opregulering af N-cadherin og vimentin. Yderligere beviser, som xenografter i nøgne mus efter ufuldstændig RFA var der også blev påvist proteinniveau ændringer af disse EMT markører. Desuden har vi undersøgte også up-regulerede EMT transkriptionsfaktorer i ufuldstændige RFA tumorer og i varmebehandlede HCC celler. Disse resultater kombineret med resultaterne af tidligere undersøgelser, der er nævnt ovenfor, yderligere identificeret, at den “cadherin switch” af tumorvæv kan udløses ved ufuldstændig RFA der føre til øget metastaser potentiale.

For helt at forstå den molekylære mekanisme i forholdet mellem varme intervention og ændringerne i cellefænotype, fokuserede vi vores opmærksomhed på β-catenin. Som en central faktor i Wnt-signal-vejen, β-catenin spiller en vigtig rolle i HCC progression, udvikling, fænotype ændringer og carcinogenese. β-catenin-mutationen er en faktor, der kan være kritisk for udviklingen af ​​HCC. Mutationer involverer Wnt /β-catenin pathway synes at være en af ​​de hyppigste genetiske hændelser, der bidrager til leveren carcinogenese og progression [41]. Dysregulering af β-catenin kan fremme carcinogenese; mus heterozygote for LKB1 sletning viste en accelereret progression til HCC når parret med adenovirus-inducerbare p-catenin mutant mus [42]. I mellemtiden havde nogle rapporter impliceret, at β-catenin mutation var en temmelig fælles mekanisme af mus hepatocellulære neoplasmer, herunder adenomer og karcinomer [43]. På den anden side har korrelationen mellem β-catenin-signalvejen og EMT blevet verificeret i flere studier. Yang et al.