PLoS ONE: Ribosomal L22-like1 (RPL22L1) Fremmer kræft i æggestokkene Metastase ved at inducere Epithelial-til-Mesenchymale Transition

Abstrakt

Dobbelt minut kromosomer (DMS) har stor betydning for kræft progression, fordi onkogener ofte forstærkes på dem . Vi har tidligere fundet en funktionelt udefineret gen forstærkes på DMs, Ribosomal L22-like1 (

RPL22L1

). Forholdet mellem

RPL22L1

og kræft progression er ukendt. Her

RPL22L1

blev karakteriseret for sin rolle i æggestokkræft (OC) metastaser og dets underliggende mekanisme blev undersøgt. DNA-kopi nummer og mRNA udtryk for

RPL22L1

i OC celler blev analyseret ved hjælp af data fra The Cancer Genome Atlas og Gene Expression Omnibus database. En immunhistokemisk analyse af kliniske OC prøver blev udført og forholdet mellem ekspressionsniveauet og klinisk-patologiske faktorer blev evalueret. Derudover

in vivo

in vitro

analyser blev udført for at forstå betydningen af ​​

RPL22L1

i OC. RPL22L1 udtryk var højere i OC prøver end i normale væv, og dens udtryk niveauet var stærkt positivt korreleret med invasion og lymfeknude metastaser (

P

0,05).

RPL22L1

overekspression væsentligt forbedret intraperitoneal xenograft tumor udvikling i nøgne mus og fremmet invasion og migration

in vitro

. Derudover

RPL22L1

knockdown bemærkelsesværdigt hæmmede UACC-1598 celler invasion og migration. Endvidere

RPL22L1

overekspression opreguleret den mesenkymale markører vimentin, fibronectin, og α-SMA, reduceret ekspression af de epiteliale markører E-cadherin, α-catenin, og β-catenin.

RPL22L1

hæmning reduceret ekspression af vimentin og N-cadherin. Disse resultater antyder, at

RPL22L1

inducerer epitel-til-mesenchymal overgang (EMT). Vores data viste, at DMs forstærket gen

RPL22L1

er kritisk i at bevare den aggressive fænotype OC og i udløsning celle metastase ved at inducere EMT. Det kunne være ansat som en ny prognostisk markør og /eller effektiv terapeutisk mål for OC

Henvisning:. Wu N, Wei J, Wang Y, Yan J, Qin Y, Tong D, et al. (2015) Ribosomal L22-like1 (

RPL22L1

) Fremmer kræft i æggestokkene Metastase ved at inducere Epithelial-til-Mesenchymale Transition. PLoS ONE 10 (11): e0143659. doi: 10,1371 /journal.pone.0143659

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, KINA

Modtaget: August 5, 2015; Accepteret: November 6, 2015; Udgivet: November 30, 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: DNA-kopi nummer analysedata fås oncomine.org (https://www.oncomine.org/resource/main.html) og alle de detaljerede trin er inden papiret. Alle andre relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af programmet for Changjiang Scholars og Innovative Research Team i University (Grant nr IRT1230 til YJ), National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.371.617 til YJ), Outstanding Ungdom grundlaget for Heilongjiang-provinsen i Kina (Grant nr JC201215 til YJ)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

kræft i æggestokkene (OC) er den anden mest almindelige gynækologisk malignitet og den første dødsårsag [1]. Cancermetastase, snarere end primære tumorer, er ansvarlige for de fleste kræftdødsfald [2]. På grund af manglende endelige tidlige symptomer og passende markører til OC diagnose på et tidligt tidspunkt, er de fleste patienter diagnosticeret med sen-fase OC ledsaget med metastaser, der typisk har en 5-års overlevelse på 30% [3]. Det er afgørende at forstå de molekylære mekanismer, der er involveret i OC metastase, og til at bestemme effektive, specifikke og følsomme molekylære mål, der kan anvendes til metastaser diagnose, prognose, og individuel behandling.

Dobbelt minut kromosomer (DMS) er cytogenetiske kendetegnende for genamplifikation [4]. DMs optræder i forskellige typer af humane cancerceller, men ikke i normale celler [5]. Som ekstra-kromosomale elementer transporterer amplifikationer af genomiske DNA-sekvenser, DMs bidrager til dannelse kræft og progression, onkogener er ofte til stede i de amplificerede sekvenser, og proteinerne, de koder for, er ofte overudtrykkes [6]. Eksempler på gener forstærket på DMs omfatter

MYC

i tyktarmskræft [7],

MitCN

i neuroblastom [8],

EGFR

i gliomer [9], og

EIF5A2

[10, 11] i ovariecancer [12]. Da DMs er køretøjer på forstærkede gener herunder mange onkogener, funktionelle studier af gener, der er forstærket på DMs er en god måde at udforske kandidat onkogener.

Vores team tidligere identificerede 3q26.2 som oprindelsen af ​​DMs i den menneskelige æggestokkræft cellelinje UACC-1598, og en række gener blev co-forstærket på de samme æggestokkene DMs, herunder

MitCN

,

EIF5A2

, og

RPL22L1

[13 ]. Begge

MitCN

EIF5A2

spille vigtige roller i kræft progression. Men forholdet mellem

RPL22L1

og kræft er ikke kendt.

I denne undersøgelse viste vi, at

RPL22L1

er almindeligt overudtrykt i klinisk OC individer og dens udtryk niveau er stærkt relateret til tumor invasion og metastase. En

in vivo

Forsøget viste, at tvungen udtryk for

RPL22L1

fremmer intraperitoneal xenograft tumor udvikling i nøgne mus, og øger celle migration og invasion

in vitro

. Desuden bankede den ned med små interfererende RNA (siRNA) hæmmer migration og invasion

in vitro

. Under denne proces

RPL22L1

overekspression resulterede i forhøjet ekspression af mesenchymale markører, såsom vimentin og α-SMA, og nedsat ekspression af epiteliale markører, såsom E-cadherin, α-catenin, og β-catenin , hvilket viser, at induktionen af ​​epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) kan forklare de observerede stigninger i motilitet og invasion evne til metastase. Vores data viser, at

RPL22L1

spiller en vigtig rolle i processen med OC metastaser.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Harbin Medical University med følgende referencenummer HMUIRB20150023. De æggestokkene kræft væv microarrays (TMAS) for immunohistokemi blev købt fra US Biomax (ov951, ov1912, ov6161, Rockville, MD, USA) og Xin Chao (Hova-Can90PT-01, Shanghai, Kina). Begge selskabers etiske erklæringer for at bekræfte, at de lokale etiske råd godkendt deres samtykke procedurer, alle deltagere forudsat deres skriftlige informerede samtykke, og alle bestræbelser var gjort for at beskytte patientens privatliv og anonymitet. De etiske udsagn, som virksomheder og protokollen af ​​eksperimentet var blevet kontrolleret omhyggeligt og godkendt af etiske komité Harbin Medical University (HMUIRB20150023). Fire uger gamle BALB /c-mus (specifik-patogenfrie) blev indkøbt fra SLAC (Shanghai, Kina) og opstaldet i Harbin Medical University Animal Laboratory. Mus blev huset under standardiserede lys-kontrollerede betingelser ved stuetemperatur (24 ° C) og 50% fugtighed, med fri adgang til foder og vand. Dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i retningslinjerne fra Laboratory Animal Brug af Harbin Medical University. Den blev godkendt af den etiske komité i Harbin Medical University (HMUIRB20150023) og alle bestræbelser protokol blev gjort for at minimere lidelse.

cellelinjer og cellekultur

Menneskelig ovariecancer cellelinje UACC-1598, SKOV3, HO-8910, og HO-8910PM blev indkøbt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle celler blev dyrket efter de metoder, der er beskrevet af ATCC (Manassas, VA, USA), og blev godkendt i 2012 på Micro-læse Genetik Company (Beijing, Kina) ved hjælp af en kort tandem repeat analyse.

Forberedelse af metafasespredninger og fluorescens

situ

hybridisering (FISH) analyse

i

​​Celler blev høstet for metafasespredning præparat ifølge fremgangsmåderne beskrevet i tidligere undersøgelser [14, 15] og blev farvet med Giemsa. To BAC kloner, GFP-RP11-355H10, der specifikt omfatter

MitCN

(forstærkes i UACC-1598 og ligger på DMs [13]), og Cy3-RP11-726H11 for

RPL22L1

, blev udvalgt som DNA-prober og hybridiseret til metafasespredninger af celler som tidligere [16] beskrevne. Kromosomer blev modfarvet med DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindol). Billeder blev taget med et Leica DM5000 B fluorescens mikroskop (Wetzlar, Tyskland), og analyseres ved hjælp af MetaMorph Imaging System (Universal Imaging Corporation, West Chester, NY, USA).

DNA-kopi nummer og genekspression analyse

Oncomine DNA Copy Number Datasæt (https://www.oncomine.org/resource/main.html) indeholder data deponeret i Cancer Genome Atlas (TCGA Ovarian 2 Dataset, http: //TCGA-data. nci.nih.gov/tcga/) blev anvendt til at bestemme forskellene i DNA kopital mellem OC og normale blod /ovariale væv. 607 ovarie serøs cystadenocarcinoma, 431 normalt blod, og 130 normalt ovarie vævsprøver blev analyseret. Data blev opnået gennem følgende trin: typen gen navn:

RPL22L1

i søgefeltet og på browse træet vælge Primære Filtre Datasæt typen DNA kopital datasæt. Resultatet af TCGA Ovarian 2 er direkte i den første, og grafen var til venstre. Klik på histogrammet knappen i øverste venstre hjørne af grafen titel for at få et histogram graf. På gruppens filtre over grafen titel, skal du klikke på trekanten symbol, i den valgte “Kræft og Normal Type” i menuen for at gøre analysen grupperet efter kræft og normale prøver. Dataadgang kræver en akademisk email-konto. Forfattere skal kontaktes for login-oplysninger om nødvendigt.

To uafhængige microarray genekspression datasæt blev brugt. Begge datasæt blev dannet ved anvendelse af Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array platform (Santa Clara, CA, USA). De raw.CEL filer for de to datasæt blev hentet fra Gene Expression Omnibus (GEO) hjemmeside (GSE27651 og GSE28450) [17, 18], og normaliseret ved hjælp af RMA (robust multi-matrix gennemsnit) algoritme [19].

QRT-PCR

Total RNA for hver cellelinie blev ekstraheret under anvendelse Pure High RNA Isolation Kit (Roche, Basel-Stadt, Schweiz) ved at følge producentens instruktioner. PrimeScript

® RT Reagent Kit Perfect Real Time (Takara, Dalian, Kina) blev anvendt til at vende transskriberet det totale RNA. CDNA blev kvantificeret ved hjælp LightCycler

® 480 SYBR Green I Master (Roche) i en LightCycler

™ 480 II Real Time System (Roche). De specifikke primere til human

RPL22L1

GAPDH

var som følger:

RPL22L1

fremad primer, 5′-AGAAGGTTAAAGTCAATGG-3 ‘og revers primer, 5’-ATCACGAAGATTGTTCTTC- 3 ‘;

GAPDH

fremadrettet primer, 5′-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3 ‘og revers primer, 5′- TTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3’. Angivelse af

RPL22L1

i prøver blev normaliseret til den for

GAPDH

og fold-ændring i ekspression blev beregnet ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode.

Western blot analyse

Celler blev lyseret ved 4 ° C i RIPA (8990, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Cellelysater, der indeholder 40 pg totalt protein fra hver prøve blev påsat 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgeler og overført til en polyvinylidenfluoridmembran (Millipore, Billerica, MA, USA). Efter blokering i 10% blokerende opløsning (Roche) blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer, efterfulgt af 1-times inkubation med anti-muse /anti-kanin sekundært antistof (200-332-263 /610-132-007 , Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) ved stuetemperatur. Billeder blev opnået ved hjælp af Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) og beskåret ved hjælp af Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA), repræsentant for fem uafhængige forsøg. GAPDH blev anvendt som kontrol. Detaljerne i de primære antistoffer findes i det supplerende materiale S1 Tekst

Tissue microarray

The OC væv microarrays (TMAS) blev købt fra US Biomax (ov951, ov1912, ov6161,. Rockville, MD, USA) og Xin Chao (Hova-Can90PT-01, Shanghai, Kina). Godkendelse til denne undersøgelse blev opnået før den blev indledt fra den lokale regionale etiske komité. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagerne.

Immunhistokemi

Immunhistokemi (IHC) blev udført ved hjælp PowerVision

™ To Trin Histostaining Reagent (Zhongshan Golden Bridge, Beijing, Kina) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev TMA sektioner deparaffineret og rehydreret. For antigen hentning, TMA dias var mikrobølge-behandlet i 10 mM citratpuffer (pH 6,0) i 8 min. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 3% hydrogenperoxid i 10 min. TMA Objektglassene blev inkuberet med en 1:50 fortynding af monoklonalt mod humant RPL22L1 (1:50) natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Objektglassene blev derefter sekventielt inkuberet med gede anti-kanin IgG-antistof-peberrodsperoxidase konjugater i 30 minutter ved 37 ° C, og 3′-3 ‘diaminobenzidin blev anvendt som kromogen substrat. Endelig blev alle objektglas modfarvet for kerner med hematoxylin, dehydreret, og monteret. For den negative kontrol blev det primære antistof erstattet med normalt kanin IgG. RPL22L1 immunoreaktivitet i TMA prøver blev evalueret ved tre patologer. Intensiteten af ​​immunoreaktivitet på TMA’er blev gradueret på en skala fra 0 til 3 baseret på en konsensus af de tre efterforskere.

Vektorer

RPL22L1

-ORF blev PCR-amplificeret og klonet ind i pcDNA3.1 (+) ekspressionsvektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). SiRNA (h) og kontrol-siRNA blev indkøbt fra RiboBio (Q000200916-1-B, Guangzhou, Kina). Den luciferasereporterplasmid pGL4.17 blev venligst stillet til rådighed af Dr. ZH Zhong (Department of Microbiology, Harbin Medical University, Harbin, Kina).

transfektion

Alle plasmider og siRNA’erne blev transficeret ind i cellerne ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Nude mus tumor xenograftmodel

de dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité i Harbin Medical University (HMUIRB20150023) og udført i overensstemmelse med den retningslinjer for Laboratory Animal Brug af Harbin Medical University. Fire uger gamle BALB /c nøgne hunmus blev randomisering tildelt i hver gruppe, fem mus pr gruppe. Hver mus blev injiceret med 1 x 10

6 celler (i 200 pi af phosphat-bufret saltvand [PBS]). Tumorvækst blev målt to gange om ugen via bioluminescens billeddannelse. Mus blev injiceret intraperitonealt med 150 ug /g D-luciferin (Biosynth, Naperville, IL) i PBS og bedøvet med 2,5% isofluran. Fotoner udsendes fra musene blev registreret af IVIS Lumina (Advanced Molecular Vision, Lincolnshire, UK) og præsenteret som pseudo-farvebilleder overlejret på en grå-skala kropsbillede. Alle mus blev aflivet ved CO

2 inhalation 30 dage efter injektion. For at sikre død efter CO

2 kvælning, blev cervikal dislokation udført.

Cell migration og invasion analyser

Transwell celle migration og invasion blev udført ved hjælp af Corning 8,0-mm Transwell skær (8 -μm porestørrelse, plade med 24 brønde) og BD BioCoat

™ Matrigel

™ invasion Chambers (Corning Incorporated Life Sciences, Tewksbury, MA, USA) ifølge producentens anvisninger.

Sårheling assay

cellemonolaget blev ridset med en 10-pi pipettespids (i en 6-brønds plade). Fotografier (forstørrelse, × 40) blev taget straks og ved hver 24-h efter sårdannelse indtil sårene var naturligvis helet. For hver assay blev udført forsøgene på ni forskellige positioner og hele assayet blev gentaget tre gange.

Immunfluorescensfarvning

Celler blev fikseret i methanol og blokeret i 1-h med 10% normalt gedeserum, 0,3% bovint serumalbumin, 0,05% saponin og 0,3% Triton X-100 i PBS. De primære antistoffer blev tilsat og inkuberet ved 4 ° C natten over. Celler blev senere vasket med PBS og inkuberet med fluorescens-mærket sekundært antistof. En fluorescensmikroskop (Leica) blev anvendt til at fange billeder.

Statistik Salg

RPL22L1 protein ekspressionsniveauer af TMAs blev analyseret ved Wilcoxons logget rank test. Den χ

2 test blev anvendt til at undersøge sammenhængen mellem genekspression og kliniske parametre. Andre data blev udtrykt som middel ± SD, og ​​den statistiske signifikans af forskelle mellem to grupper blev evalueret ved hjælp af to-sidede uafhængige Students

t

-tests. Statistisk signifikans blev erklæret hvis

P

0,05. Beregninger blev udført ved hjælp af SPSS 13.0. (IBM, Armonk, NY, USA)

Resultater

RPL22L1

blev forstærket via DMs og over-udtrykt i UACC-1598 celler

The OC cellelinje UACC-1598 indeholdt forstærkede gener i form af DMS. Onkogen amplifikation på DMs repræsenterer tumorigenese, men forekommer ikke i normale celler (Fig 1A). Ved hjælp af en FISH-analyse, detekteret vi forstærkede områder af

RPL22L1 Hoteller, som co-lokaliseret med

MitCN

på DMs (Fig 1B). Desuden har vi opdaget forstærkning af

RPL22L1

i normale æggestokkene væv, humane lymfocytter, og UACC-1598 celler ved hjælp af PCR (Fig 1C). Vi undersøgte også forstærkningen af ​​

RPL22L1

i yderligere tre æggestokkene kræft cellelinier (S1 Fig). RT-PCR bekræftede ekspressionen af ​​

RPL22L1

i forskellige prøver (Fig 1D). Disse resultater er angivet som

RPL22L1

blev forstærket via DMs i UACC-1598 celler.

(A) Repræsentative billeder af metafase kromosomer UACC-1598 og normale humane lymfocytter. Pile angiver DMs i UACC-1598 celler (forstørrelse, × 1000). (B) Repræsentative billeder af FISH-analyse. Metafasekromosomer af UACC-1598 og humane lymfocytter blev detekteret med DNA-prober. (A) Rød sonde indikerer

RPL22L1

og (b) grøn sonde indikerer

MitCN

; (C) begge prober blev placeret på samme locus på DMs som angivet ved pilene, (d) red probe indikerer

RPL22L1

i normale humane lymfocytter (forstørrelse, × 1.000). (C) DNA amplifikation niveauer af

RPL22L1

påvist ved PCR, (D) RT-PCR resultat af mRNA ekspressionsniveauer af

RPL22L1

i forskellige prøver.

DNA-kopi nummer og udtryk niveau af

RPL22L1

i klinisk OC prøver

for at bestemme forstærkningen af ​​

RPL22L1

i klinisk, brugte vi Oncomine database (https: //www .oncomine.org) at analysere de DNA-kopi nummer profiler af

RPL22L1

i en TCGA æggestokkene datasæt (TCGA ovarian 2, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [20 , 21]. Dette datasæt klart angivet en betydelig stigning i DNA-kopien antal

RPL22L1

i OC i forhold til normalt blod og æggestokkene væv, tærskel af

P

10

-4 (Fig 2A).

(A) DNA kopital profiler af

RPL22L1

i en æggestokkene serøs cystadenocarcinoma datasæt registreret i Oncomine database (TCGA Ovarian 2 datasæt) . To uafhængige microarray genekspression datasæt (B) GSE29405 og (C) GSE27651 fra GEO hjemmeside blev anvendt til at undersøge ekspressionsniveauet af

RPL22L1

i OC. De raw.CEL filer til de to databaser blev hentet og normaliseret ved RMA.

RPL22L1

blev mere stærkt udtrykt i OC end i normalt ovarievæv (*

P

0,05, uafhængig Students

t

-test). Repræsentative billeder af RPL22L1 proteinekspression i (D) OC og (E) matchede tilstødende normale væv ved IHC (forstørrelse, × 400).

Endvidere opnåede vi offentligt tilgængelige GEO ekspressionssystemer datasæt til at analysere ekspressionen af

RPL22L1

i OC prøver. To GEO datasæt baseret på Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array blev brugt til at evaluere

RPL22L1

mRNA ekspressionsniveauer i OC og normale æggestokkene væv. I hver af de to datasæt,

RPL22L1

udtryk var signifikant højere i OC end normale æggestokkene væv (Fig 2B og 2C,

P

0,05, t-test).

for yderligere at undersøge protein udtryk niveau af

RPL22L1

i kliniske prøver, blev fire OC TMA’er bruges til IHC-analyser. Farvningsintensitet blev estimeret ved anvendelse af et indeks på 0-3 i cellekernen og cytoplasma (S2 Fig). RPL22L1 blev klart udtrykt mere højt i OC cytoplasma end for de tilstødende normale væv (Fig 2D og 2E) (

P

= 0,008, Wilcoxons logget rank test).

Vi undersøgte associationer mellem RPL22L1 protein ekspressionsniveauer og clinicopathologic variable. RPL22L1 udtryk i cytoplasma af OC celler var stærkt associeret med scenen, invasion, og lymfeknude metastaser (

P

0,05, Pearsons χ

2 test, tabel 1). Disse resultater viste, at ekspressionen af ​​

RPL22L1

er almindeligvis højere i kliniske OC prøver, og dets ekspressionsniveau er associeret med tumorudvikling, specielt med invasion og lymfeknudemetastaser.

RPL22L1

forbedret intraperitoneal xenograft tumor udvikling

in vivo

at påvise rolle højt niveau

RPL22L1

i tumor progression, valgte vi en OC-cellelinje med lav RPL22L1 udtryk SKOV3, for yderligere funktionelle undersøgelser (figur 3A). SKOV3 celler stabil transfektion med luciferase tidligere, og derefter stabil transfektion med

RPL22L1

(Fig 3B og 3C). At udforske den rolle,

RPL22L1

i tumor progression

in vivo

, vi intraperitonealt injicerede SKOV3-RPL22L1 og kontrol celler i nøgne mus. De xenotransplanterede tumorer blev målt under anvendelse af bioluminescens ved 30

th dag efter injektion, område xenograft tumor i mus med SKOV3-RPL22L1 celler injiceret var større end kontrolceller injiceret (fig 3D). Resultatet foreslog, at højt niveau af

RPL22L1

bidrage til tumor udvikling.

(A) Ekspression af RPL22L1 i UACC-1598 og SKOV3 celler blev undersøgt ved Western blotting. Angivelse af

RPL22L1

i SKOV3-RPL22L1 og kontrol celler blev undersøgt ved (B) western blots og (C) QRT-PCR. (D) Fire uger gamle nøgne mus blev intraperitonealt injiceret med SKOV3-RPL22L1 eller kontrol celler og bioluminescens billeder blev taget efter 30 dage. (Bar: middelværdi ± SD; *

P

0,05, uafhængig Students

t

-test).

RPL22L1

fremmes OC celle migration og invasion

for at bekræfte rolle

RPL22L1

i OC celler blev UACC-1598 celler behandlet med tre specifikke siRNA’er mod

RPL22L1

(siRNA-1, siRNA -2, og siRNA-3). Da siRNA-2 udviste den mest effektive knockdown af endogen

RPL22L1

, blev det valgt til efterfølgende analyser (S3 Fig). Undtagen SKOV3-RPL22L1 og kontrol celler, vi brugte en anden to OC cellelinjer HO-8910 og HO-8910PM med lavere

RPL22L1

udtryk for forbigående transficeret med

RPL22L1

for yderligere funktionel undersøgelse (S3 fig). Effekten af ​​

RPL22L1

på celle motilitet var præget af sårheling, transwell migration, og Matrigel invasion assays. Knockdown af

RPL22L1

i UACC-1598 celler (1598-siRPL22L1) forårsagede klar ression af migration og invasion celler. Over-ekspressionen af ​​

RPL22L1

i SKOV3-RPL22L1, HO-8910 (8910-RPL22L1), og HO-8910PM (8910PM-RPL22L1) celler i væsentlig grad kan forbedre celler migration og invasion (

P

0,05, figur 4). Cell vækstrate blev analyseret ved en MTA assay,

RPL22L1

havde ingen indflydelse på celleproliferation (data ikke vist). Disse resultater tydede på, at højt

RPL22L1

forbedrer OC celler migration og invasion.

(A-D) Repræsentative billeder af sårhelende assay af celler (forstørrelse, × 40). (E-H) Migration af cellerne blev påvist ved Transwell migration assay, og (I-L) celleinvasion blev evalueret under anvendelse af en Matrigel invasion kammer. Eksempler på celler, der migreret gennem membranen (venstre panel), søjler angiver tredobbeltforsøg (forstørrelse, × 100, Bar: middelværdi ± SD *

P

0,05, uafhængig Students

t

– test).

udtrykket niveau af

RPL22L1

påvirkninger OC cellelinje EMT

det er blevet mere og mere klart, at EMT er en integreret del af udviklingen af ​​epitelial -afledte tumorer [22, 23]. Vi fandt, at SKOV3-RPL22L1 celler udviste en spindel-formet og fibroblastisk morfologi henviser 1598-siRPL22L1 celler udviste svind former og forøget celle-celle adhæsion (S4 Fig). Derfor har vi undersøgt, om

RPL22L1

induceret EMT kunne forklare den

RPL22L1

medierede ændringer i celler motilitet og invasion. Biokemiske kendetegn for EMT omfatter tab af ekspression af epiteliale markørproteiner og samtidig forøgelse af mesenkymal markørekspression [22, 24]. Western blots og immunofluorescens analyser blev anvendt til at evaluere ekspressionen af ​​epitel- og mesenchymale markører. Efter ektopisk overekspression af

RPL22L1

i SKOV3 celler, udtryk for epitel beslutningstagere, såsom E-cadherin, β-catenin, og α-catenin faldet, mens udtryk for vimentin, α-SMA, og fibronectin steg (fig 5A og 5B). I 1598-siRPL22L1 celler blev ekspressionsniveauerne af den mesenchymale markører vimentin og N-cadherin nedbrydes (Fig 5C). Disse resultater antydede, at ekspressionsniveauet af

RPL22L1

påvirkninger EMT i OC-celler.

(A) Western blots viste lavere niveauer af epiteliale markører (E-cadherin, β-catenin og α- catenin) og højere niveauer af mesenchymale markører (vimentin, α-SMA, og fibronectin) i SKOV3-RPL22L1 sammenlignet med i kontrolceller. (B) HVIS analyse viste nedsat niveau af epitel markører (α-catenin og β-catenin) og øgede niveauer af mesenkymale markører (fibronectin og vimentin). (C) Western blot-analyse viste, at knockdown af

RPL22L1

af siRNA resulterede i et lavere niveau af mesenkymale markører (vimentin og N-cadherin) i UACC-1598 celler.

Diskussion

DMs er maligne cytogenetiske markører og er tæt korreleret med tumor progression [4]. Tidligere vi bestemt, at

RPL22L1

forstærkes på DMs, men dens funktion er uklar. Mange onkogener forstærkes via DMs i maligne tumorceller [34.38.39], såsom

EIF5A2

MitCN

, som begge er placeret på samme sted som

RPL22L1

på DMs. Vi udledes, at

RPL22L1

kan være involveret i OC progression, og verificeret dette i en serie af

in vitro

og

in vivo

analyser.

Brug offentligt tilgængelig TCGA og GEO ekspressionsvektorer datasæt vi fundet både DNA kopital og mRNA-ekspression af

RPL22L1

var signifikant højere i OC væv end i normale ovariale væv. Protein udtryk for

RPL22L1

blev undersøgt ved IHC med fire OC TMAs. Vi fandt, at RPL22L1 udtryk var ofte højere i OC væv sammenlignet med normalt tilstødende ovarievæv (

P

= 0,008, Wilcoxons logget rank test). Endvidere fandt vi ekspressionsniveauet var signifikant korreleret med sygdom etape (81,7% i fase 2-4 versus 64,5% i fase 1) invasion dybde (81,9% i T2-T4 versus 64,5% i T1), og lymfeknude metastaser (86,6 % med versus 70,3% uden metastase), hvilket tyder på, at det høje RPL22L1 i OC celler kan lette den invasive /metastatiske fænotype. Disse resultater understreger en potentielt vigtig rolle

RPL22L1

som en underliggende biologisk mekanisme i udviklingen og progressionen af ​​OC.

Resultatet af IHC-analyse viste, at

RPL22L1

kan være involveret i patogenesen af ​​OC progression især i metastase. For at bekræfte denne hypotese, nøgen mus tumor xenograft, sårheling, transwell migration, og Matrigel invasion blev udført for at undersøge den rolle,

RPL22L1

i reguleringen OC celler motilitet, invasion. Over-ekspressionen af ​​

RPL22L1

naturligvis fremmet tumor udvikling

in vivo

og øget migration og invasion evne tre OC cellelinier

in vitro

. Desuden knockdown af endogene

RPL22L1

af siRNA i UACC-1598 celler hæmmede migration og invasion

in vitro

. Migration og invasion er to vigtige faser i tumormetastaser [25], og disse funktionelle assays kraftigt antydet, at

RPL22L1

spiller en vigtig rolle i at fremme tumormetastaser via øge cellemigration og invasion.

Mange biologiske processer er forbundet med migration og invasion herunder EMT, en central begivenhed i tumorinvasion og metastase [26]. Over-ekspression af

RPL22L1

reducerede ekspressionen af ​​epiteliale markørproteiner (E-cadherin, β-catenin, og α-catenin) og forøgede ekspression af mesenchymale markører (vimentin, α-SMA, og fibronectin), som er biokemiske kendetegnende for EMT [24, 27, 28]. Men efter knockdown af

RPL22L1

i UACC-1598 celler, den mesenkymale markører vimentin og N-cadherin var naturligvis nedreguleret. EMT spiller en afgørende rolle i at fremme metastase og under denne proces celler opnå migration og invasion kapaciteter, der fremmer metastaser [29, 30]. Følgelig vi udlede, at overekspression af

RPL22L1

sandsynligvis induceret EMT at fremme celleinvasion og metastase.

RPL22L1 er en paralog af RPL22, som er et RNA-bindende protein komponent i 60S ribosomale subunit. Ribosomale proteiner er væsentlige bestanddele af ribosomer, hvor cellulære proteiner syntetiseres. Til dato er ca. 80 ribosomale proteiner blevet identificeret. Ud over deres nøgleroller i proteinsyntese, nogle ribosomale proteiner er involveret i ekstra-ribosomale funktioner, såsom DNA-reparation, apoptose, transskription regulering, og oversættelse regulering [31-36]. Et stigende antal rapporter har antydet, at ribosomale proteiner har onkogent potentiale [37-39]. For nylig,

RPL22

har vist sig at være muteret eller nedreguleret i forskellige cancerformer, herunder T-akut lymfoblastisk leukæmi, invasiv brystcarcinom og lunge adenocarcinom. Derudover

RPL22

direkte undertrykker udtryk for

RPL22L1

mRNA, og en mangel på RPL22 forårsager en kompensatorisk stigning i RPL22L1 [40, 41]. Disse undersøgelser ort vores formodninger om den rolle,

RPL22L1

i kræft progression.

Samlet foreslog vores resultater, at

RPL22L1

spiller en vigtig rolle i OC progression ved at øge celle invasion og metastase via fremkalde EMT. Som

RPL22L1

er en DM gennemført forstærket gen, kunne vores data hjælpe med at forklare funktionen af ​​DMs i kræft.