PLoS ONE: Cabozantinib inhiberer vækst af Androgen-Sensitive og kastrationsresistent prostatakræft og Påvirker Bone Remodeling

Abstrakte

Cabozantinib er en inhibitor af flere receptortyrosinkinaser, herunder behandling og VEGFR2. I en klinisk fase II forsøg i fremskreden prostatacancer (PCA), cabozantinib behandling forbedret knogle scanninger i 68% af de evaluerbare patienter. Vores undersøgelser har til formål at bestemme et udtryk for cabozantinib mål under PCa progression og vurdere dens effektivitet i hormon-følsomme og kastrationsresistent PCa i prækliniske modeller samtidig afgrænse dens virkninger på tumor og knogler. Brug immunhistokemi og væv mikroarrays indeholdende normal prostata, primær PCa, og blødt væv og knoglemetastaser, vores data viser, at niveauet af MET, P-MET, og VEGFR2 er stigende i PCa progression. Vore data viser også, at ekspressionen af ​​cabozantinib mål er særligt udtalt i knoglemetastaser. At evaluere cabozantinib effekt på PCa vækst i knoglen miljø og i blødt væv, vi brugte androgen følsomme LuCaP 23.1 og kastrationsresistent C4-2B PCA tumorer.

In vivo

, cabozantinib hæmmede væksten af ​​PCa i knogler samt vækst af subkutane tumorer. Endvidere cabozantinib behandling svækket knoglen reaktion på tumoren og resulterede i øget normal knogle volumen. Sammenfattende udtrykket mønster af cabozantinib mål i primær og kastrationsresistent metastatisk PCa, og dens effektivitet i to forskellige modeller af PCa tyder på, at dette middel har et stærkt potentiale for effektiv behandling af PCa på forskellige stadier af sygdommen.

Henvisning: Nguyen HM, Ruppender N, Zhang X, Brown LG, Gross TS, Morrissey C, et al. (2013) Cabozantinib Hæmmer vækst af androgen-Sensitive og kastrationsresistent prostatakræft og Påvirker Bone Remodeling. PLoS ONE 8 (10): e78881. doi: 10,1371 /journal.pone.0078881

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: 15. maj 2013; Accepteret: September 16, 2013; Udgivet: 25 oktober 2013

Copyright: © 2013 Nguyen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelserne i dette manuskript var delvist finansieret af Exelixis Inc. To af medforfatterne (DTA og FS) er ansat i Exelixis. De blev involveret i studiedesign, dataanalyser og i manuskript forberedelse

Konkurrerende interesser:. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af Exelixis Inc., arbejdsgiver for Frauke Schimmoller og Dana T. Aftab. Eva Corey har modtaget forskningsmidler fra Exelixis, Inc., via aftale Sponsoreret Forskning med University of Washington. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Metastaser fortsat være den vigtigste årsag til sygelighed og dødelighed hos mænd, der lider af fremskreden prostatacancer (PSA). Trods de eksisterende midler, der er effektive mod avancerede PCa, overlevelse efter udvikling af kastration resistens fortsat meget kort. Derfor roman, er et presserende behov effektive behandlinger mod metastatisk og kastrationsresistent sygdom.

Cabozantinib er en potent hæmmer af receptortyrosinkinaser, herunder MET og VEGF receptor 2 (VEGFR2). Andre mål inhiberes af cabozantinib omfatter AXL, FLT-3, KIT, og RET [1,2]. Virkningerne af cabozantinib er blevet evalueret i den prækliniske indstilling i flere kræftformer, herunder gliom, bryst-, lunge-, og pancreascancer. I disse undersøgelser cabozantinib reduceret tumorindtrængen, proliferation og angiogenese samtidig øge apoptose [1,2]. Prækliniske studier i en model af pancreas neuroendokrine kræft har givet et indblik i mekanismerne i cabozantinib handling, hvilket tyder på en funktionel balance mellem MET og VEGFR2 gennem inddragelse af HIF1A [2-5]. Men mekanismer, der involverer andre mål for cabozantinib, såsom RET, et vigtigt mål i medullært thyroidea carcinom [6,7], og AXL eller KIT, ikke blevet grundigt undersøgt eller rapporteret. I betragtning af de roller disse kinaser i tumorbiologi, cabozantinib inhibering af en eller alle af disse mål kan være gavnlig til behandling af PCa ved at angribe tumorceller på flere fronter. Denne type angreb kan potentielt målrette effektivt heterogene cellepopulationer, såsom de af PSA.

Cabozantinib blev for nylig godkendt af FDA for den kliniske behandling af progressiv, metastatisk medullær kræft i skjoldbruskkirtlen. Denne godkendelse fulgte tidlige observationer af cabozantinib aktivitet mod denne sygdom i den indledende fase I klinisk undersøgelse [5]. Cabozantinib har også vist opmuntrende resultater hos patienter med metastatisk, kastrationsresistent PCa (CRPC) i en fase II adaptiv randomiseret seponering retssag. Væsentlige forbedringer i knogle scanninger blev observeret i 68% af de evaluerbare patienter. Desuden 72% udviste regression i blødt væv læsioner, og 67% oplevede en forbedring af knoglesmerter [3]. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at efter 12 uger den objektive responsrate 5%, og 75% af patienterne viste stabil sygdom [3]. Ikke desto mindre har ingen anden agent vist denne konstellation af virkninger hos mænd med CRPC, hvilket indikerer en potentielt unik virkningsmekanisme for cabozantinib i denne indstilling sygdom.

MET og dens ligand, hepatocytvækstfaktor (HGF), er blevet impliceret i progressionen af ​​mange cancerformer. MET signalering fremmer celle overlevelse, spredning, invasion, metastase, og angiogenese

in vivo

in vitro

[8]. I PCa er MET udtrykt i primær PCa, og der påvises højere ekspression i PCA metastaser i knogler [9-11]. Endvidere blev MET ekspression forbundet med PCa kvalitet, Gleason score, og dårlig prognose [9], og forhøjede plasmaniveauer af HGF viste sig at være en dårlig prognostisk indikator i PCA patienter [12]. Desuden har prækliniske resultater viste krydstale mellem androgen receptor (AR) og MET signalering, med AR signalering resulterer i direkte inhibering af MET-ekspression [13,14]. Derfor kan opregulering af MET signalering være forbundet med progressionen af ​​PCa til kastration modstand. Følgelig er flere hidtil ukendte MET inhibitorer udvikles mod forskellige kræftformer, herunder PCa [15]. Men en gennemgang af den aktuelle litteratur viste blandede resultater af MET hæmning i PSA. De MET hæmmere PHA-665.752 og PF2341066 hæmmede væksten af ​​PCA celler [16], og knockdown af MET-ekspression af en adenovirus hæmmede PCa vækst og lymfeknude (LN) metastaser [17]. I modsætning BMS-777.607, en anden MET-hæmmer, påvirkede ikke signifikant spredning af PCA celler, men hæmmede deres invasionsevne og migration [18]. I klinikken, har en række midler, der selektivt målrettet MET undladt at vise en væsentlig klinisk fordel i patienter med CRPC [19,20].

VEGFR2 spiller også en vigtig rolle i flere kræftformer, herunder PSA. VEGFR signalering er centralt i reguleringen af ​​angiogenese og øges i metastatiske CRPC læsioner [21]. Desuden er forhøjede plasma og urin niveauer af VEGF forbundet med en dårlig prognose i PCa [22,23]. Derfor har VEGF /VEGFR2 signalering været et mål for nye behandlinger mod kræft. Inhibering af VEGF-pathway nedsat tumorvækst og vaskulaturen i en model for pancreas-ø kræft, selvom denne effekt ikke blev opretholdt og tumorer vinder gentog [24]. Et klinisk forsøg med bevacizumab, et rekombinant anti-VEGF monoklonalt antistof, kombineret med kemoterapi viste øget progressionsfri overlevelse sammenlignet med placebo plus kemoterapi. Men denne behandling kombination ikke signifikant forbedre den samlede overlevelse sammenlignet med kontrollen arm [25]. De begrænsede reaktioner og erhvervet resistens til anti-VEGF-behandling tyder på, at mens angiogenese gennem VEGF er et vigtigt mål for kræftbehandling, vil udviklingen af ​​succesfulde nye lægemidler kræver en dybere forståelse af faktorer, der letter flygte fra antiangiogen terapi og give mulighed for fortsat tumor overlevelse og vaskularisering. Med dette i tankerne, er blevet påvist stigninger i MET-aktivitet som reaktion på antiangiogen terapi og hypoxi [26,27]. Fortsat administration af VEGF-hæmmer sunitinib forøget HGF udtryk i en murine tumor model, og sunitinib var ineffektive, når HGF blev givet [28,29]. Desuden har VEGF blevet vist at direkte aktivere MET signalering via neuropilin-1 i PCa uafhængig af HGF [11]. Disse resultater viser en synergistisk virkning mellem VEGF og MET signalveje og foreslå, at en terapi rettet mod begge disse veje, såsom cabozantinib, kunne være yderst relevant i avanceret PCa.

Vi havde til formål at bestemme ekspressionsniveauerne af cabozantinib primære mål i avanceret PCa og vurdere dets indvirkning på subkutane PCA tumorer og dem vokser i knogler, specielt med hensyn til tumor byrde og knogleomsætning. Vores resultater viser, at målene i cabozantinib udtrykkes i PCA metastaser, og at cabozantinib hæmmer tumorvækst i knogler og blødt væv og udviser gavnlige virkninger på knogler i både intakte og kastrerede mus.

Materialer og metoder

Alle humane væv blev opnået fra patienter, som underskrevet skriftligt informeret samtykke og efter University of Washington IRB godkendelse. Alle dyreforsøg, der er beskrevet i dette manuskript blev godkendt af og udføres i overensstemmelse med University of Washington Institutional Animal Care og brug Udvalg og NIH retningslinjer.

Immunhistokemi (IHC)

Tissue microarrays (TMA’er) blev anvendt til bestemmelse MET, P-MET, og VEGFR2 immunoreaktivitet i normale prostata (NP) og PCa: 1) UWTMA48: NP og benign prostatahyperplasi (60 væv, to kerner pr væv) og primær PCa (61 væv, to kerner pr væv); 2) UWTMA52: matchede NP og PCa fra tilbagevendende og ikke-tilbagevendende patienter (63 tilbagevendende og 64 ikke-tilbagevendende patienter, to kerner for hver NP og PSA); 3) UWTMA21: PCa metastaser fra 44 patienter (40 knoglemetastaser, 19 levermetastaser, 27 LN metastaser, og 7 andre blødt væv metastaser, to kerner pr væv); og 4) UWTMA48: 24 LuCaP PCA xenograftmodeller fra intakte, kastrerede og docetaxel-behandlede dyr (tre kerner pr væv). IHC blev udført under anvendelse af standardprocedurer med antigen-genvinding [30]. Et monoklonalt muse-anti-met-antistof (gave fra Dr. Knudsen [31]), en kanin monoklonalt anti-P-MET-antistof (Cell Signaling, Boston, MA), og en kanin polyklonalt anti-VEGFR2 antistof (Cell Signaling, 55B11, Boston, MA) blev anvendt. Specifik immunfarvning blev vurderet af en patolog (XZ) ved anvendelse af en tre trins-skalaen: 2 = intens, 1 = svag, og 0 = fraværende, og procentdelen af ​​celler i hver intensitet blev estimeret.

Statistisk analyse af IHC

For hver kerne i hver TMA, en farvning indeks blev bygget som et vægtet kombination af de tre-punkts farvning intensiteter, med vægte givet af den procentdel af væv farvning på hver intensitet; se Methods S1. Det beregnede farvning indeks er en værdi i intervallet [0, 1], hvor 1 betyder 100% af celler farvet intensivt. Lineære blandede modeller var egnet til at farvningen indekset betinget af metastaser placering med tilfældige effekter for hver patient eller et dyr. Efter evaluering af modelantagelser og transformation af data, som var nødvendigt, blev de monterede modeller anvendes til at kvantificere forskelle i immunreaktivitet mellem metastatiske steder og teste statistisk signifikans. Grafiske profiler illustrerer fordelingerne af farvning intensitet blev konstrueret ved at beregne simple gennemsnit på tværs af alle ikke-manglende dele i hver farvning kategori. Foreninger mellem ekspressionen af ​​proteiner og kliniske parametre blev evalueret ved hjælp af lineære regressionsmodeller, og foreninger med tid til PSA recidiv blev evalueret ved hjælp af skrøbelighed (tilfældige effekter Cox proportionel risiko) modeller.

Cellelinjer

C4-2B celler (Urocor, Inc., Oklahoma City, OK) og MC3T3-celler (ATCC, Manassas, VA) blev opretholdt under standard væv dyrkningsbetingelser. C4-2B celler blev dyrket i RPMI 1640 og 10% føtalt bovint serum (FBS), og MC3T3-celler blev dyrket i DMEM med 10% FBS. Den LuCaP 23.1 PCa xenograft blev opretholdt og seriel passage i CB17 SCID-mus [32]

Dyreforsøg

Studie 1:.. Intratibial LuCaP 23,1, 60 mg /kg cabozantinib

Intakte seks uger gamle mandlige beige SCID-mus (Charles River, Wilmington, MA) blev injiceret med en LuCaP 23.1 enkelt-cellesuspension ind i den højre proximale skinneben som tidligere [33] offentliggjort. 200.000 LuCaP 23.1 celler blev injiceret i 20 pi RPMI 1640 i den højre proksimale tibia. Dyr blev randomiseret i en kontrolgruppe (n = 5) eller cabozantinib gruppe (n = 5), når serum PSA-niveauer nåede påviselige niveauer (0,6 ng /ml, AxSYM Total PSA testen, Abbott Laboratories, Abbot Park, IL). Cabozantinib blev opløst i H

2O og administreres af oral sonde ved 60 mg /kg, fem gange om ugen i seks uger. Kontroldyr fik sondeernæring med H

kun 2O. Serum PSA niveauer og kropsvægt blev målt ugentligt. Efter aflivning tumorangrebne skinneben og normal kontralateral skinneben blev indsamlet og behandlet til analyser

Studie 2:.. Intratibial C4-2B, 60 mg /kg cabozantinib

Undersøgelsen design var den samme som for studerer 1, bortset fra at dyrene blev kastreret og C4-2B celler blev injiceret i tibia to uger efter kastration [34]. C4-2B celler blev høstet, når ~ 50% sammenflydende, og 200.000 celler blev injiceret i hver skinneben. Dyr blev randomiseret i en kontrolgruppe (n = 11) eller en cabozantinib gruppe (n = 10).

Undersøgelse 3: Subkutan C4-2B, 60 mg /kg cabozantinib

C4-2B. (2×10

6, 1: 1 med Matrigel) celler blev injiceret subkutant i kastrerede mus . Dyr blev randomiseret i en kontrolgruppe (n = 8) eller en cabozantinib gruppe (n = 12), når tumorvolumenet nåede 100 mm

3. 60 mg /kg cabozantinib blev indgivet ved oral sondeernæring fem gange om ugen i op til ni uger. Dyrene blev aflivet, når tumorer nåede 1000 mm

3 eller når dyrene blev kompromitteret.

Studie 4:. Intratibial LuCaP 23,1, 30 mg /kg cabozantinib

Undersøgelsen design var den samme som i studie 1, bortset fra at en lavere dosis af cabozantinib (30 mg /kg) var anvendes, og behandlingen varede i op til 15 uger. Dyrene blev randomiseret i en kontrolgruppe (n = 10) eller en cabozantinib gruppe (n = 10).

Micro-CT

En Scanco vivaCT 40 høj opløsning μCT scanner blev brugt til at analysere en 0,85 mm afsnit spanning proksimale tibia metafyse af tumorangrebne og ikke-tumorangrebne kontralateral tibia (LuCaP 23.1: n = 3-5; C4-2B: n = 5-10 pr gruppe). Knoglevolumen (BV), vævs volumen (TV), trabekulære separation (Tb.Sp), trabekulære tykkelse (Tb.Th), og trabekulære nummer (Tb.N) blev bestemt, og BV /TV blev beregnet.

Statistisk analyser af dyreforsøg

Langsgående tumor målinger og PSA i serum blev log-transformeret og modelleret ved hjælp af lineære mixed modeller betinget af behandlingsgruppen med tilfældige effekter for hvert dyr; se Methods S1. Efter en standard diagnostisk vurdering af model fit, vi simulerede 1000 datasæt fra hver forsynet model, beregnet den empiriske middelværdi og 95% konfidensgrænser ved hvert tidspunkt, og re fi t modellerne til disse datasæt. De endelige resultater repræsenterer midler og 95% tilliden grænser for 1000 bootstrap replikater. Efter standard kontrol af modellens antagelser, blev 2-sidede t-tests anvendes til at teste for forskelle i serum-PSA, tumor volumen, kropsvægt, og IHC farvning indeks niveauer. Den statistiske signifikans af forskellene i knogleparametre blev bestemt under anvendelse af en 2-sidet t-test.

RT-PCR-analyse

RNA-ekstraktion, cDNA-syntese, og qPCR blev udført som tidligere beskrevet [ ,,,0],35]. Primerne og hærdningsbetingelser er anført i tabel S1. RNA blev ekstraheret fra subkutane tumorer. Relativ udtryk for de mål meddelelser blev bestemt baseret på fire gange fortynding af kalibrator cDNA. Vi brugte LNCaP cDNA for RET; PC-3 cDNA for behandling, AXL og KIT, og LuCaP 23.1 cDNA for murine VEGFR2 (VEGFR2m). Specifikke signaler blev normaliseret til RPL13a niveauer.

In vitro-forsøg

Virkningerne af cabozantinib på spredning, mineralisering, alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet, og Ar transkriptionsaktivitet blev vurderet

in vitro

som tidligere beskrevet [36]; se Metoder S1.

Resultater

Niveauer af MET, P-MET og VEGFR2 løbet PCa progression

For at løse, om cabozantinib mål er udtrykt i PCa, vi evaluerede niveauerne af MET, P-MET, og VEGFR2 i væv, der repræsenterer normal prostata og forskellige stadier af PCa progression.

NP vs primær PCa

MET og P-MET:. Vores resultater viste, at behandling er til stede i høje niveauer i NP og primære PCA celler, men der var kun marginal beviser for forskelle mellem disse væv (betyde farvning indeks NP: 0,96, 95% CI 0,93-0,98; PCa: 0,92, 95% CI 0,88-0,96; P = 0,06); se fig S1. På trods af de høje niveauer af MET i NP og PCa, var minimal immunoreaktivitet af P-MET påvist i disse væv, og der var ingen tegn på forskelle mellem disse væv (betyder farvning indeks NP: 0,16, 95% CI 0,00 til 0,32; PCa: 0,11; 95% CI 0,00-0,27; P = 0,49); se fig S1. Der var ingen tegn på, at MET eller P-MET immunoreaktivitet var forbundet med risiko for biokemisk recidiv efter kontrol for alder, Gleason sum, og tumor volumen

VEGFR2:. Normal prostata epitelceller og PCA celler både udstillet lav VEGFR2 immunoreaktivitet , og der var marginal tegn på højere VEGFR2 i PCa vs NP (betyde farvning indeks NP: 0,03, 95% CI 0,00-0,05; PCa: 0,07, 95% CI 0,03-0,11; P = 0,02); se fig S1. Stærk farvning var til stede i stroma og vaskulaturen af ​​både NP og PSA. Svarende til MET, var der ingen tegn på, at VEGFR2 ekspression var forbundet med risiko for PSA recidiv efter kontrol for alder, Gleason sum, og tumorvolumen.

Primær PCa vs metastaser.

På grund af de rapporterede stigninger i MET i PCA metastaser [12], vi satte sig for at vurdere, om der kan påvises denne stigning i væv fra vores kohorte af patienter. Til denne sammenligning, vi brugte resultaterne fra metastaser på TMA 21 og kombinerede resultater af PCA væv fra UWTMA48 og UWTMA52 (127 patienter). MET blev påvist i PCA metastaser med meget stærke beviser for højere immunoreaktivitet farvning i knoglemetastaser (BM) i forhold til primær PCa (betyde farvning indeks primære PCa: 0,83, 95% CI 0,82-0,87; BM: 0,94, 95% CI 0,89-0,98 ; P = 0,0002); se figur 1. I modsætning hertil MET niveauet var signifikant lavere i alle bløde væv metastaser i forhold til primær PCa (betyde farvning indeks lever: 0,70, 95% CI 0,62-0,77, P 0,0001; LN: 0,78, 95% CI 0,71-0,83 , P 0,0001, andre bløde:. 0,79, 95% CI 0,67-0,93, P = 0,01)

IHC og analyser blev udført som beskrevet i afsnittet Metoder. Grafiske profiler illustrerer fordelinger af farvning intensitet blev konstrueret ved at beregne simple gennemsnit på tværs af alle ikke-manglende dele i hver farvning kategori. I hvert sted, er det gennemsnitlige farvning indeks markeret med en fyldt orange cirkel og orange streger repræsenterer 95% kreditinstitutter. Repræsentative eksempler på farvning er vist for hvert protein. A. MET er stærkt udtrykt i både primær og metastatisk PCa, om det er steget markant i BM og faldt i bløde væv metastaser vs primære PSA. B. P-MET er højere i BM, LN og andre bløde væv metastaser, mens ingen ændring blev påvist i levermetastaser i forhold til primær PSA. C. VEGFR2 udtryk øges betydeligt på tværs PCA metastatiske læsioner i forhold til primær PSA. Billeder blev taget ved 400 x forstørrelse

P-MET blev påvist i PCa metastaser med stærke beviser for højere immunoreaktivitet i BM i forhold til primær PCa (betyde farvning indeks primære PCa:. 0,22, 95% CI 0,17 -0,26; BM: 0,37, 95% CI 0,30-0,45; P = 0,003); se Figur 1. P-MET niveauet var også højere i alle bløde væv metastaser i forhold til primær PCa, selvom ikke alle forskelle var signifikante (gennemsnitlig farvning indeks lever: 0,28, 95% CI 0,13-0,38, P = 0,35; LN: 0,46, 95% CI 0,35-0,56, P = 0,0001, andet blødt:. 0,51, 95% CI 0,27-0,70, P = 0,006)

VEGFR2 blev påvist i PCa metastaser med meget stærke beviser for højere immunoreaktivitet i BM sammenlignet til primær PCa (betyde farvning indeks primære PCa: 0,10, 95% CI 0,07-0,14; BM: 0,25, 95% CI 0,19-0,31; P = 0,0001); se figur 1. Niveauerne af VEGFR2 var også højere i alle bløde væv metastaser i forhold til primær PCa, selvom ikke alle forskelle var signifikante (gennemsnitlig farvning indeks lever: 0,29, 95% CI 0,17-0,38, P = 0,0005; LN: 0,40, 95% CI 0,29-0,46, P 0,0001, andet blødt: 0,19, 95% CI 0,04-0,38, P = 0,28)

PCA metastaser

Siden mikromiljø påvirker genekspression.. profiler af tumorceller, vi analyserede også Met ekspressionsniveauerne af metastatisk site. Niveauerne af MET var signifikant højere i BM i forhold til leveren, LN, og andre bløde væv metastaser (betyde farvning indeks BM: 0,94, 95% CI 0,91-0,98; betyde farvning indeks lever: 0,59, 95% CI 0,52 til 0,66, P 0,0001; LN: 0,67, 95% CI 0,61-0,73, P 0,0001, andre bløde:. 0,68, 95% CI 0,57-0,83, P 0,0001)

niveauerne af P-MET var svagt eller ikke-signifikant forskellig hos BM sammenlignet med leveren, LN, og andet blødt væv metastaser (gennemsnitlig farvning indeks BM: 0,37, 95% CI 0,32-0,44; leveren: 0,28, 95% CI 0,13-0,36, P = 0,10; LN : 0,46, 95% CI 0,34-0,53, P = 0,05; bløde andet: 51%, 95% CI 0,27-0,69); se figur 1. På grund af forskellig behandling af BM og blødt væv metastaser (BM forarbejdning kræver afkalkning) og lav stabilitet af phosphorylering under sure betingelser, kan den faktiske niveauer af P-MET faktisk være højere i BM end vore data viser.

VEGFR2 niveauer var signifikant forskellige i BM i forhold til LN metastaser (betyde farvning indeks BM: 0,25, 95% CI 0,21-0,31; LN: 0,40, 95% CI 0,30-0,45, P 0,0001), men ikke lever eller andet blødt væv metastaser.

Foreninger mellem MET, P-MET, og VEGFR2 farvning indeks og AR, PSA, og PSMA.

Crosstalk mellem AR, MET og VEGFR2 signalering er blevet rapporteret i CRPC (13,14 ). Derfor har vi vurderet sammenhængen mellem MET, P-MET og VEGFR2 farvning (bestemt i denne undersøgelse) og AR, PSA, og PSMA farvning (fra historiske data) i metastaser. Vores analyse, der var baseret på en lineær mixed model (se Metoder S1), ikke afsløre eventuelle signifikante sammenhænge mellem nogen af ​​de par af de udvalgte proteiner i BM eller bløde væv metastaser (data ikke vist). Salg

Cabozantinib mål i PCA xenografter

qPCR.

For at bestemme ekspressionen af ​​udvalgte cabozantinib mål i PCa, vi evaluerede niveauer af MET, murine VEGFR2, AXL, KIT, og RET mRNA i 24 forskellige LuCaP PCA xenografter der nøje model heterogenitet PCa i mennesker [37]. Vores qPCR resultater viser, at alle cabozantinib mål er udtrykt i disse modeller på varierende niveauer; se fig S2A. Stratificering modellerne til neuroendokrine tumorer (NE) og adenocarcinom (AD) viste høj til moderat dokumentation for højere niveauer af alle mål i NE LuCaP modeller (n = 4) sammenlignet med AD modeller (n = 20) Se figur S2B. Da krydstale mellem AR, MET, og VEGFR2 signalering er blevet rapporteret, vi undersøgte også, om udtryk for cabozantinib mål korrelerer med AR udtryk eller reaktioner på kastration. Til dette formål har vi klassificeret xenografter som “yderst lydhør over for kastration”, hvis kastration resulterede i en mere end tre gange overlevelse. Vores analyser viste ikke nogen signifikante associationer mellem niveauerne af AR og cabozantinib mål. Desuden mens de gennemsnitlige mRNA niveauerne af cabozantinib mål var højere i modeller, som ikke reagerer godt på kastration, disse forskelle nåede ikke signifikans.

IHC.

For at få en bedre forståelse af cabozantinib s potentielle virkninger i patienter med fremskreden CRPC der er på ADT og /eller behandlet med docetaxel, vi undersøgte niveauer af MET, P-MET, og VEGFR2 i LuCaP tumorer fra intakte, kastreret, og docetaxel-behandlede dyr. Vores analyser viser moderat dokumentation for, at markedsøkonomisk og P-MET ekspressionsniveauerne negativt korreleret på tværs tumortyper (R = 0,29; P = 0,02), og marginal bevis for, at gennemsnitlige markedsøkonomisk og P-MET farvning indeks er 5-6% højere i tumorer efter docetaxel behandling end i tumorer fra intakte dyr (P = 0,08 og P = 0,05, henholdsvis). Vores analyser afslørede ikke nogen dokumentation for, at ekspressionsniveauerne for ethvert andet par af proteiner er korreleret på tværs eller inden tumortyper (alle P 0,14), der betyder markedsøkonomisk og P-MET farvning indeks er forskellige mellem tumorer høstet fra intakt og kastrere dyr, eller at betyde markedsøkonomisk og P-MET farvning indeks varierer betydeligt mellem LuCaP implanteret, der viser en høj og lav respons på kastration; se fig S2C. VEGFR2 viste ikke nogen signifikant immunreaktivitet i tumorceller i vores modeller.

Prækliniske Effekt Studies

For at øge vores forståelse af cabozantinib effekter på PCA knoglemetastaser, vi undersøgte dens virkninger på serum PSA, kropsvægt, og knogleomsætning i modeller for PCa vækst i knoglen. Ligeledes vi vurderet ændringer i serum PSA, tumor volumen, og kropsvægt i respons på behandling i dyr, der bærer subkutane tumorer.

Cabozantinib hæmmer tumorvækst i knoglen.

For at evaluere effekten af ​​cabozantinib på vækst af PCa i knogler, vi behandlede intakt eller kastrere dyr bærer intratibial LuCaP 23.1 eller C4-2B tumorer hhv. Vi valgte disse to modeller, fordi LuCaP 23.1 fremkalder en udtalt osteoblastisk reaktion og C4-2B fremkalder en blandet osteoblastiske /osteolytisk respons. Endvidere LuCaP 23.1 betegner androgen-sensitive PCa mens C4-2B betegner kastrationsresistent sygdom. Vores qPCR resultater viser, at behandling, VEGFR2m, KIT, RET og AXL udtrykkes i LuCaP 23.1. I C4-2B tumorer detekteret vi VEGFR2m, AXL og RET, meget lave niveauer af MET og noget signal i KIT (resultater er vist i figur 2A). Ekspression af disse receptorer i LuCaP 23.1 og C4-2B tumorer støtter hypotesen om, at cabozantinib vil ændre biologi af disse tumorer. Cabozantinib (60 mg /kg) hæmmede væksten af ​​begge tumorer i knogler som demonstreret ved fald i serum PSA-niveauer; se Figur 2B. Ugentlige ændringer i serum PSA var signifikant forskellig mellem kontrol- og cabozantinib grupper i LuCaP 23.1 model (P 0,0001), hvor PSA steg med 76% om ugen i kontrolgruppen, men med 0,2% pr uge i cabozantinib gruppen. PSA ændringer var også signifikant forskellig mellem kontrol- og cabozantinib grupper i C4-2B model (P = 0,0066), hvor PSA steg med 35% pr uge i kontrolgruppen, men faldt med 2,9% pr uge i cabozantinib gruppen. Cabozantinib også inhiberede proliferation af de resterende levedygtige celler i tumorerne baseret på BrdU farvning; se Figur 2C. Hæmningen af ​​tumor progression var også mærkbar, når vi evaluerede AR og PSA-immunreaktivitet; LuCaP 23.1 og C4-2B tumorer fra dyr behandlet med cabozantinib viste mindre intens AR og PSA-farvning i de resterende tumorceller samt store nekrotiske områder; se figur 2D E. C4-2B celler udtrykker lavere niveauer af PSA som det ses i figur 2B og som også afspejles i meget lavere PSA-immunreaktivitet i disse tumorceller.

A. Niveauer af cabozantinib receptorer i LuCaP 23.1 og C4-2B subkutane tumorer. qPCR blev anvendt på RNA isoleret fra subkutane tumorer til bestemmelse ekspressionsniveauer af MET, VEGFR2m, AXL, RET og KIT. For at kalibrere signalet brugte vi fire gange fortynding af LNCaP cDNA (RET), PC-3 cDNA (MET, AXL, KIT) og LuCaP 23.1 (VEGFR2m). Udvælgelse af kalibratoren cDNA blev baseret på signal for hver specifik meddelelse. Signal blev normaliseret til husholdning gen RPL13a. Vores resultater viser, at LuCaP 23.1 tumorer udtrykker alle de cabozantinib mål og C4-2B tumorer udtrykker VEGFR2m, AXL og RET, lave niveauer af MET, og ingen KIT. I disse qPCR forsøg målte vi relative niveauer af mål-transkripter og ikke deres faktiske antal, derfor kan vi ikke sammenligne ekspressionsniveauerne af de forskellige mål til hinanden, og kommentere, hvorvidt RET, som gav højere signal, kan udtrykkes ved højere kopi antallet vs MET, og derfor er mere vigtigt i disse modeller.

B. Lineære modeller af PSA vækst viser, at cabozantinib nedsætter PSA niveauer i både androgen følsomme LuCaP 23.1 og kastrationsresistent C4-2B modeller. C. BrdU farvning af skinnebenene viser, at cabozantinib nedsætter proliferation af androgen-sensitive og kastrationsresistent tumorceller i knogle, blev 2-sidet t-test anvendes til at bestemme betydningen af ​​forskellene. D E. AR og PSA-immunreaktivitet forekommer i kontrol tumorer. Cabozantinib behandling resulterede i fald i AR og PSA-immunreaktivitet i begge modeller (LuCaP 23.1 (D) og C4-2B (E)). C4-2B celler udtrykker lavere niveauer af PSA i forhold til LuCaP 23,1, og farvningen er svagere i disse tumor. Endvidere store nekrotiske områder af tumor er til stede i det behandlede tibia (markeret med røde asterics). F. 60 mg /kg cabozantinib tåles godt op til 4 uger i androgen-sensitive LuCaP 23,1 dyr. Efter denne periode signifikant BW falder vs. blev påvist kontrol (op til 17%), men på grund af variation og antal dyr, har disse fald ikke nå betydning. 60 mg /kg cabozantinib tåles godt op til 5 uger i kastrationsresistent C4-2B model, med en 12% signifikant fald ved uge 6. Signifikans blev bestemt ved sammenligning indskrivning BW til BW ved hver uge ved anvendelse af 2-sidet t- prøve. Middelværdi ± SEM af grupperne er afbildet.

Cabozantinib ændrer knogle remodellering i tumorangrebne knogle.

Vi udførte en detaljeret analyse af cabozantinib effekter på knoglen /tumor mikromiljø af μCT. Vi har valgt denne form for analyse i stedet for histomorfometri analyse fordi μCT evaluerer hele skinneben i 3D, mens histomorfometri analyser er færdig som regel på en enkelt 2D longitudal sektion af skinnebenet. Analysen af ​​trabekulær knogle viste, at LuCaP 23.1 vækst resulterer i signifikante stigninger i knoglevolumen (tumorangrebne tibia: 0,42 ± 0,06 (gennemsnit ± SEM), normal tibia: 0,09 ± 0,01; 5-fold stigning i BV /TV, P = 0,02) . Disse stigninger blev svækket ved cabozantinib, hvilket resulterer i et fald i BV /TV 52% sammenlignet med kontrolgruppen LuCaP 23.1 skinneben. Dette fald blev afspejlet i ændret trabekulære nummer (Tb.N), trabekulære tykkelse (Tb.Th), og trabekulære separation (Tb.Sp); se tabel 1. C4-2B vækst i knogler resulterede også i moderat evidens for BV /TV stiger (40% stigning, P = 0,06).