PLoS ONE: SOX4 transkriptionelt Regulerer Multiple SEMA3 /plexin familiemedlemmer og Fremmer tumorvækst i pancreas Cancer

Abstrakt

semaphorin signalering gennem plexin ofte deltager i tumorigenese og ondartet progression i forskellige former for kræft. Især rollen af ​​semaphorin signalering i pancreas duktal adenokarcinom (PDAC) forbliver uudforsket, trods en høj sandsynlighed for metastase og dødelighed. I modsætning til andre epitelmalignanser der ofte udtrykker et lille antal specifikke gener i semaphorin /plexin familie, er fem eller flere udtrykkes ofte i human PDAC. Sådan samtidig ekspression af disse SEMA3 /plexin familiemedlemmer er ikke et resultat af genamplifikation, men (i det mindste delvist) fra øget gentranskription aktiveret af SOX4 de novo udtrykt i PDAC. Via chromatin-immunopræcipitation, luciferase promotoraktivitet assay og elektroforese mobility shift assay SOX4 påvist at binde til konsensus-stedet ved promotoren for hver

SEMA3

plexin

gen at øge transkription aktivitet. Omvendt er RNAi-knockdown af SOX4 i PDAC cellelinjer resulterer i nedsat udtryk for SEMA3 /plexin familiemedlemmer og forbundet med begrænset tumorvækst både

in vitro

i SCID-mus. Vi demonstrerer endvidere, at SOX4 niveauer parallelt med den summerede udtryk SEMA3 /plexin familiemedlemmer (

P

= 0,033,

NPAR

Kruskal-Wallis

en

–

måde

analyse), som også korrelerer med dårlig overlevelse i human PDAC (

P

= 0,0409,

Kaplan-Meier

analyse). Interessant, miR-129-2 og miR-335, som begge målrette SOX4 for nedbrydning, er co-undertrykt i humane PDAC tilfælde forbundet med opreguleret SOX4 i en statistisk signifikant måde. Afslutningsvis vi afslører en miR-129-2 (miR-335) /SOX4 /semaphorin-plexin regulatoriske akse i tumorigenese af kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Huang HY, Cheng YY, Liao WC, Tien YW , Yang C-HJ, Hsu SM, et al. (2012) SOX4 transkriptionelt Regulerer Multiple SEMA3 /plexin familiemedlemmer og Fremmer tumorvækst i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 7 (12): e48637. doi: 10,1371 /journal.pone.0048637

Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: 8. maj 2012; Accepteret: 1 oktober 2012; Udgivet: 12. december, 2012 |

Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Taiwan University Hospital intern fond tildelt PH Huang og HY Huang (NTUH.96-M-037). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA, og en af ​​de ti mest almindelige kræftformer i Taiwan. Diagnose af PDAC forekommer ofte først efter udbredt metastase. Som et resultat heraf kan dårlig prognose af PDAC tilskrives dets aggressive biologiske adfærd og dens modstandsdygtighed over for kemoterapi eller strålebehandling, hvilket nødvendiggør en detaljeret mekanistisk undersøgelse af PDAC til terapeutisk design [1].

Genekspression og genom dækkende mutationsændringer undersøgelser viser, at menneskets bugspytkirtel kræft resultater fra ændring af flere gener, der fungerer gennem et sæt på mindst 12 cellulære signalveje [2]. Gennem en analyse af mere end 20000 udskrifter, har et gennemsnit på 63 genetiske ændringer i bugspytkirtelkræft blevet påvist. Mekanismerne for afvigende ekspression af hvert specifikt gen i bugspytkirtelkræft er forskellige, herunder punkt mutation, gendeletion, og forstærkning [2].

afvigende ekspression af klasse 3 semaphorin samt beslægtede receptorer plexin (PLXN ) og neuropilin (NRP) i forskellige typer af human cancer viser, at SEMA3-gated plexin signalering regulerer cancercellelinier adfærd [3], [4]. For eksempel overekspression af SEMA3C og SEMA3E medierer tumorprogression og metastase i cancere, herunder human lunge adenocarcinom, prostatacancer, endometrioide cancer og bryst-adenocarcinom. Derimod

SEMA3F

og

SEMA3B

gener ofte slettet i epitel malignitet, hvilket resulterer i øget angiogenese [3]. For PDAC, overekspression af NRP1 og SEMA3A er blevet rapporteret at korrelere med en dårlig [5] prognose. Imidlertid har de molekylære processer bag sådanne udtryk under PDAC tumorigenese ikke blevet belyst, og om andre medlemmer af klasse 3 semaphorin eller plexin deltage i bugspytkirtelkræft dannelse eller progression er endnu ikke kendt. Her undersøgte vi ekspressionen af ​​SEMA3 og plexin /neuropilin i normale humane pancreas, PDAC kirurgiske prøver og PDAC cellelinier. I modsætning til andre epitelmalignanser der ofte specifikt over-udtrykker et lille antal gener i semaphorin familien, mest PDAC tilfælde over-udtrykke mere end fem gener relateret til SEMA3 og plexin. Mekanismen ligger til grund for co-ekspression af SEMA3 /plexin familiemedlemmer i PDAC blev således undersøgt.

Materialer og metoder

Etik Statement

Vi bekræftede, at arbejdet med menneskelige væv blokke og frisk parret tumor /ikke-tumor prøver i denne undersøgelse blev godkendt af Tissue og etiske komité, med skriftlige informerede samtykke opnået efter de retningslinjer, der er fremsat af Tissue og etiske komité på NTUH.

in vivo

tumorigenese assay i SCID-mus blev udført under en godkendelse udstedt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) for National Taiwan University College of Medicine og College of Public Health.

Case valg

Sixty-to tilfælde af pancreas duktalt adenokarcinom blev identificeret via en søgning på de patologiske optegnelser er registreret i National Taiwan University Hospital (NTUH), Taiwan fra januar 1996 til december 2006. kvantitativ real-time PCR, treogtyve tilfælde af parrede snap-frosne pancreas ikke-tumor og tumorvæv blev opnået. Udvalgte demografiske oplysninger blev hentet fra hospitalet Cancerregisteret som beskrevet i supplerende tabel S1.

Celledyrkning, RNA-interferens, og udvælgelse af stabile-transfekterede celle kloner

PANC-1, MiaPaCa2, og Capan-1-celler blev indkøbt fra ATCC. Alle celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C med 5% CO

2.

I RNA-interferens, målretningsindstillingerne oligonucleotider specifikke for

SOX4

genet (NM_003107.2: nt.1999-2019 og nt.1362-1382) eller krypterede sekvenser blev klonet i pSuperGFP /neo vektor. Lentiviral shRNAs målrette SOX4 via de konstruerede oligonukleotider rettet mod nt.4433-4453 og nt.1101-1121 (NM_003107.2) henholdsvis blev købt fra RNAi core laboratorium i Taipei Sinica Academica.

PLXNA2

siRNA plasmider blev kommercielt indkøbt (Santa Cruz). De stabilt plasmid-transficerede kloner blev selekteret ved G418 (Sigma). RNAi-knockdown af hvert molekyle blev bekræftet ved RT-PCR og Western blot

Antistoffer, immunhistokemi, og Western blot

anvendte antistoffer indbefattet anti-humant NRP1 (R Tabel 1). Når den kombinerede udtryk for al SEMA3 blev PLXN, og NRP1 medlemmer i hvert PDAC tilfælde vurderet, blev det klart, at de fleste PDAC sager (svarende til 85,5% i vores prøver) udtrykte 5-10 medlemmer af SEMA3 /plexin familie (fig. 1B ). I tråd med co-ekspression af SEMA3 /plexin i PDAC kirurgiske prøver, human PDAC-afledte cellelinjer (PANC1, Capan1 og MiaPaCa2 celler) udtrykte også flere medlemmer af SEMA3, plexin og NRP1 på udskriften og protein niveauer (Fig. 1C og 1D).

(A) immunhistokemi af menneskelige PDAC tilfælde, der viser ekspressionen af ​​NRP1 og de fleste medlemmer af SEMA3 /plexin familie. Normal pancreas væv gav ikke udtryk for nogen SEMA3 /plexin /NRP (diagonal, skala bar = 50 um). Scale bar = 100 um. (B) Søjlediagram for at vise fordelingen af ​​antal SEMA3 /plexin /NRP udtrykt i hvert PDAC tilfælde. Fifty-tre ud af 62 tilfælde (85,5%) udtrykte mere end 5 medlemmer. (C) semikvantitativ RT-PCR-analyse af SEMA3-, Plexin- og NRP- transkripter i humane PDAC cellelinier. GAPDH tjente som en intern loading kontrol. (D) immunoblot af helcelle-lysat fra humane PDAC cellelinier til påvisning endogen SEMA3, plexin, og NRP1. (E) repræsentant SEMA3-, Plexin- og NRP1-immunreaktivitet påvist i Panin læsioner støder op til invasiv karcinom. Scale bar = 100 um.

Når Kaplan-Meier overlevelse analyse blev udført i sammenhæng med udtryk SEMA3, plexin eller NRP medlemmer, ikke signifikant sammenhæng blev fundet bortset fra at SEMA3F-positive tilfælde vises længere overlevelse og mindre hyppig lymfeknudemetastase (Supplerende fig. S1 og upublicerede data). Desuden blev der ikke observeret nogen korrelation mellem nodal metastase og ekspressionsniveauet af SEMA3 eller plexin (Supplerende tabel S2). Desuden RNAi-medieret knockdown af en enkelt SEMA3 eller plexin resulterede i en ubetydelig effekt på både celle overlevelse og formering (supplerende fig. S2B, S2C, S2D). Derfor ingen enkelt medlem af SEMA3 /plexin spiller en afgørende rolle i tumordannelse eller progression af PDAC.

I betragtning af at kræft i bugspytkirtlen udtrykker varierende mængder af SEMA3 og plexin i stærk kontrast til ikke-udtryk i normal pancreas duktalt væv vi spekuleret på, at samtidig udtryk for SEMA3 /plexin kan være involveret i PDAC tumorigenese. Derfor vi næste undersøgt ekspressionen af ​​SEMA3 og plexin i bugspytkirtlen precursor kræft, specielt pancreas intraepitelialneoplasi (Panin). Som vist i fig. 1E, flere medlemmer af SEMA3 og plexin plus NRP1 var allerede til stede i Panin læsioner støder op til invasive duktalt neoplastiske tumor reder, hvilket tyder på, at samtidig udtryk for SEMA3 /PLXN /NRP1 sker i de tidlige trin i PDAC tumorigenese.

Expression af SOX4 i PDAC korrelerer med den summerede ekspression af gener fra NRP1, SEMA3 og plexin familier

flere mekanismer kan ligge til grund for den observation, at flere medlemmer af SEMA3 og plexin familie var co-opreguleret i PDAC. Første, gener, der koder SEMA3 og plexin familiemedlemmer kan co-amplificeres grund af hyppige kopital variationer i bugspytkirtelkræft. Vi har bemærket, at de fleste gener af det humane SEMA3 og plexin familier er placeret på hver kromosom 3 eller 7 (fig. 2A). Derfor brugte vi vifte komparativ genomisk hybridisering til at undersøge muligheden for DNA-amplifikation i SEMA3 og plexin familiens gen loci. Som vist i fig. 2B, ingen ændring i DNA-kopi nummer blev observeret ved kromosomale regioner 7p12.1 (

SEMA3A

locus), 7q21 (

SEMA3C

,

SEMA3D

,

SEMA3E

loci) (fig. 2B), 1q32.2 (

PLXNA2

locus), 3p21.3 (

SEMA3B

og

SEMA3F

loci), 3q21.3 (

PLXNA1

og

PLXND1

loci), eller 10p12 (

NRP1

locus) (Supplerende fig. S2A). Equivocal DNA-amplifikation blev observeret ved kromosomet Xq28 regionen kun, hvor

PLXNA3

bosat (Supplerende fig. S2A).

(A) gen loci af hvert menneske

SEMA3

,

plexin

, og

NRP

gen. (B) repræsentative matrix CGH på kromosom 7 med genomisk DNA ekstraheret fra Panc-1 og MiaPaCa2 celler, sammenlignet med normalt humant genomisk DNA (blå prikker og linje: fremad eksperiment cellelinje i forhold til kontrollen, røde prikker og linje: reverse eksperiment , kontrol versus cellelinie). Ingen signifikant genamplifikation ( = eller = 2-gange ændring) blev observeret omkring

SEMA3A

,

3C

,

3D

,

3E

og

PLXNA4

gen loci (angivet ved grøn-farvet rektangel og pil). (C) SOX4 udtrykkes i PDAC cellelinier. Cellelysater blev immunpræcipiteret under anvendelse af anti-SOX4 antistof og immunblottet med SOX4 eller en kontrol-IgG-antistof. (D) immunhistokemi af SOX4 og E2F1 i humane PDAC tilfælde. SOX4 og E2F1 blev begge påvist i Panin forskellige kvaliteter og invasiv adenokarcinom, men ikke i normal duktale og acinar epitel eller kronisk betændelse i bugspytkirtlen. Scale bar = 100 um. (E) Rank sum af farvning intensitet for SEMA3 /plexin /NRP1 korrelerer med SOX4 udtryk i PDAC tilfælde. Farvningen af ​​hvert afsnit blev scoret 1-3 til rang sin intensitet som svag, medium eller stærk. Score af alle SEMA3 /plexin /NRP1 immunfarvning for hvert tilfælde blev summeret og korreleret med SOX4 ekspression (NPAR Kruskal-Wallis envejs analyse). Den mediane (linje i boksen), maksimale og minimale værdier (øverste og nederste linjer uden for boksen, henholdsvis) for hver gruppe vises i boxplot.

En anden almindelig ændring i kræftceller er tavshed af tumorsuppressorgener efter hypermethylering [8]. Selvom SEMA3F og SEMA3B generelt betragtes som tumor undertrykkere og methyleres

SEMA3F

er blevet rapporteret i lungekræft [9], er det neo-udtryk i stedet for undertrykkelse af SEMA3 /plexin udtryk, der generelt observeret i PDACs (se tabel 1). Endvidere er CpG-rige øer for methylering modifikation ikke altid findes i de forudsagte promotorområder af SEMA3 /plexin familie gener (som forudsagt af EMBOSS CpGPlot Program). Som et resultat, vi næste undersøgt den mulighed, at co-ekspression af SEMA3 /plexin /NRP familiemedlemmer i PDACs er forårsaget af neo-ekspression af nogle masterkontrol gen (er) afgørende for tumorigenese af PDAC, eventuelt transkriptionsfaktor (er) som kunne interagere med et konsensus-DNA-bindende motiv stede i promotoren af ​​hver SEMA3 /plexin /NRP gen. Flere kandidater, herunder E2F1, GATA6, og SOX2, blev opnået via en litteratursøgning. Den E2F1 transskription faktor kunne aktivere

NRP1

transskription i mus cortex under iskæmisk forandring [10]. Mus

SEMA3C

og

PLXNA2

er de direkte mål for GATA6 under hjerte-udvikling [11]. Endelig

SEMA3C

og

NRP1

blev rapporteret til at være de direkte målgener af SOX4 [12]. Derfor forsøgte vi at finde SOX4-konsensus bindingssted [(A /T) (T /A) CAA (A /T) G], den GATA6-bindingssted [(A /T /C) GAT (A /T ) (A)], og E2F1-bindingsstedet [TTT (C /G) (C /G) CGC] i forudsagte promotorer til hver SEMA3 og plexin genet [12] – [15]. Som anført i supplerende Tabel S3, alle SEMA3, plexin, og NRP gener besidder mindst en formodet SOX4 bindingssted og et E2F1-bindingssted i de forudsagte promotorområder. Salg

tilstedeværelsen af ​​de formodede SOX4 og E2F1-bindingssteder i promotoren for hver SEMA og plexin gen fik os til at undersøge SOX4 og E2F1 udtryk i humane PDAC væv og cellelinier. Immunoblotting viste SOX4 ekspression i PANC-1 og MiaPaCa2 celler (fig. 2C). For humane PDAC prøver, immunohistokemi viste, at 76,4% af humant PDAC udtrykt SOX4, og 87,9% udtrykt E2F1 (fig. 2D). Derimod acinære og duktale epitelceller fra normale pancreas og kroniske pankreatitis var ikke immunreaktive til SOX4 eller E2F1. Desuden SOX4 og E2F1 var allerede påvist i Panin forskellige kvaliteter (fig. 2D), tyder på, at SOX4 og E2F1 er de novo udtrykt i de tidlige processer PDAC tumorigenese.

At udforske forholdet mellem ekspressionen af SOX4 eller E2F1 og af SEMA3 /plexin /NRP1 hos patienter med PDAC, vi rangeret farvningen intensiteten af ​​hver SEMA3 og plexin som et tal 0-3 (0, negativ, 1, svag, 2; moderat, 3, stærk) og analyseret hver patients rang sum versus SOX4 eller E2F1 udtryk.

NPAR

Kruskal-Wallis

en

–

måde

analyser viste signifikante forskelle i rang sum af SEMA3, Plexins og NRP1 farvning mellem SOX4-positive og SOX4-negative sager (

P

= 0,046) (fig. 2E). Imidlertid blev der ikke observeret nogen forskel, når E2F1 udtryk blev betragtet som den variable (

P

= 0,9121). Den meget korreleret udtryk for SOX4 med SEMA3 /plexin /NRP1 familiemedlemmer i human Panin og PDAC tyder på, at SOX4 kan fungere som master transskription faktor til at drive ekspressionen af ​​SEMA3 og plexin gener i bugspytkirtelkræft formation.

SOX4 aktiverer transskription af SEMA3 og plexin gener

for at påvise, at SOX4 kunne regulere transskription aktivitet SEMA3 og plexin gener i PDAC, vi først undersøgt, om SOX4 kunne binde til den forudsagte promotor af hver SEMA3 og plexin gen. Chromatin immunoprecipitation udført på PANC-1-celler viste, at SOX4 faktisk bundet til promotoren af ​​hver SEMA3 og plexin genet (fig. 3A og 3B). Væsentlige fold-stigning i luciferaseaktivitet blev observeret i konstruktionen drevet af promotoren fra SEMA3 og plexin gen, når transficeret ind SOX4-udtrykkende HeLa-celler. Derudover co-transfektion af en SOX4-udtrykkende vektor yderligere forbedret promotoraktiviteten (fig 3C, P. 0,001), som blev svækket når SOX4-konsensus bindingssteder blev muteret (AACAATG til AACAAAA og TACAATG til TACAAAA mutationer) ( fig. 3D). Ligeledes elektroforese mobilitet shift assay viste, at protein udvundet af SOX4-holdige kerner forsinket migration af en radio-mærket DNA-probe bestående af

SEMA3

eller

plexin

promoter sekvenser i en koncentrationsafhængig måde . Denne virkning blev specifikt lettet ved en kold-mærket probe bestående af SOX4-konsensus bindingssekvenser og kunne supershift ved tilsætning af SOX4 antistoffer (fig. 3E). Omvendt RNAi-medieret depletion af SOX4 i PANC1 celler (66% og 78% reduktion i SOX4 protein for siSOX4 # 1 og siSOX4 # 2 henholdsvis fig. 3F) resulterede i et samtidigt fald i mRNA og protein niveauer af de fleste SEMA3 /plexin familiemedlemmer og NRP1 (fig. 3G og 3H). Kollektivt, disse resultater tyder på, at SOX4 kunne fungere som en mester faktor til at aktivere transkription af SEMA3 og plexin gener samtidigt, hvilket fører til ekspression af multiple SEMA3 og plexin familiemedlemmer i bugspytkirtelkræftceller.

(A) repræsentant endepunkt PCR af kromatin immunofældning (chip) under anvendelse af et antistof mod SOX4 i PANC-1-celler. Genomisk DNA blev forstærket med primersæt efter bundne proteiner blev fordøjet med proteinase K. chippen Resultaterne viste binding af SOX4 til den genomiske region huser SOX4 bindingssteder i den forudsagte promotor af de fleste

SEMA3

plexin

gener. (B) kvantificering af chip resulterer i (A), n = 3. Hver bane i figur 3A blev givet en værdi målt ved densitometri og normaliseret med værdien af ​​IgG. Chip effektivitet er defineret som en procentdel af værdien stammer fra PCR af SOX4-immunopræcipitat forhold til den for samlet genomisk input.

Fejl barer

, standardafvigelse (SD) fra mindst tre eksemplarer. (C) øget luciferaseaktivitet af konstruktioner, der indeholder

SEMA3

– eller

plexin

– promotor i fravær (hvide søjler) eller tilstedeværelse (grå søjler) af co-udtrykte SOX4 i sammenligning med promotorløse pGL3-Basic kontrol. Konstruktionerne, der huser en SOX4-konsensus bindingssted blev forbigående transficeret ind SOX4-holdige HeLa-celler. Vist er forhold mellem ildflue-luciferase-ekspression til Renilla luciferase ekspression (udtrykt fra cotransficeret plasmid), målt 48 timer efter transfektion normaliseredes til middel-forhold fra pGL3-Basic. Fejl søjler viser SD, n = 4. Students

t

-test, *,

P

0,01; **,

P

0,001. Ved tilstedeværelse af cotransficeret SOX4, luciferaseaktivitet drevet af hver

SEMA3

– eller

plexin

– promotor er yderligere forstærket (grå søjler) i forhold til mocktransfekterede (hvide søjler) og kontroller . (D) transkriptionsaktiviteten af ​​

PLXNA2

promoter drevet af SOX4 dæmpes når konsensus SOX4-bindende sites er muteret. Boxed DNA-sekvens, konsensus SOX4-bindingssted; Understreget med skygge i breve, de muterede SOX4-bindingssteder. Søjlediagram viser, at mutation af enten SOX4-bindingssted forårsagede signifikant fald i luciferaseaktivitet drevet af

PLXNA2

promotor i nærvær af overudtrykt SOX4. Fejl barer, SD, n = 5. Students

t

-test, *,

P

0,01; **,

P

0,001. (E) EMSA viser, at migrationen af ​​en radioaktivt mærket DNA-fragment afledt af

PLXNA2

promotor forsinkes af SOX4-holdige HeLa primitiv nuklear ekstrakt i en koncentrationsafhængig måde. Signalet af proteinbundet retarderede band (pilespidser) blev specifikt formindsket ved kolde sonder indeholder SOX4-bindende konsensussekvenser og var super-forskydes med anti-SOX4 antistof (tom pilespids). Asterisk, uspecifik binding signaler; arrow, un-bundet radioaktivt mærket probe. (F) effektiv RNAi knockdown af endogen SOX4 i PANC-1-celler vist ved SOX4 immunblotting. Værdien angivet er den normaliserede relativ intensitet målt ved densitometri (Forholdet SOX4 /tubulin for krypteret-siRNA celler er defineret som 1.). To stabile siSOX4 kloner mærket som siSOX4 # 1 og siSOX4 # 2 blev konstrueret med målrettet oligonukleotid rettet mod forskellige nukleotidsekvenser i

SOX4

gen (siSOX4 # 1, nt.1999-2019 NM_003107.2; siSOX4 # 2 , nt.1362-1382 NM_003107.2). (G) Immunoblotting i SOX4-depleterede celler viser et ledsagende fald i proteinet mængde NRP1, SEMA3- og Plexin- familiemedlemmer. Tubulin blev anvendt som en standard for normalisering i kvantificering af hver bane målt ved densitometri. Forholdet angivet var den normaliserede værdi i siSOX4 celler i forhold til den normaliserede værdi i scrambled-siRNA-celler. (H) Real-time PCR at kvantificere mRNA ekspressionen af ​​

SEMA3

og

PLXN

gener i SOX4-udtømte celler i forhold til SOX4-rigelige scrambled-siRNA-celler (vist med fold-ændring). Studerendes

t

-test, *,

P

0,01; **,

P

. 0,001

RNAi-medieret nedbrydning af SOX4 undertrykker tumorvækst

in vitro

in vivo

for at undersøge, hvordan SOX4 påvirker tumorigenese i PDAC celler, effekten af ​​SOX4 knockdown på celledeling og cellecyklus progression blev først undersøgt. Det viste, at det samlede antal levedygtige celler blev signifikant reduceret i SOX4-knockdown celler dyrket

in vitro

i tre dage (fig. 4A). Cellecyklusprogression og apoptose blev kvantitativt sammenlignet mellem SOX4 undertrykt og -competent celler, og ingen signifikant forskel blev observeret ved flowcytometri eller TUNEL-assay udfordret af genotoksisk middel (fig. 4B og 4C). I modsætning hertil blev proliferation af SOX4 undertrykt (siSOX4 # 1 og siSOX4 # 2) celler tydeligvis faldt, da mindre Ki-67 immunoreaktivitet og meget mindre BrdU mærkning blev observeret i siSOX4 celler (fig. 4d), hvilket indikerer, at antallet af celler indtastning cellecyklussen reduceres, når SOX4 er opbrugt. Dette fund tyder på, at SOX4 kan fungere at lette celledeling når de udtrykkes i bugspytkirtelkræftceller.

(A) Cell spredning påvirkes i PANC-1 celler med RNAi-undertrykkelse af SOX4. 30000 celler blev podet i hver brønd i en plade med 12 brønde. Ved 24, 48 eller 72 timer efter podning blev cellerne høstet og talt ved trypan blå-udelukkelse assay.

Fejl barer

, SD fra seks uafhængige forsøg, Students

t

-test. (B) Repræsentant flowcytometri af siSOX4 celler farvet med propidiumiodid viser ingen signifikant variation fra scrambled-siRNA celler i apoptose (afbildet ved sub-G1) eller i cellecyklusprogression. Procentdelen af ​​celler i sub-G1, G0 /G1, S og G2 /M-fasen blev vist på højre nedadgående hjørne af hvert plot. (C) repræsentative TUNEL-mærkning af celler udfordret af genotoksisk stof cisplatin (10 pg /ml, 12-H). Forskelle i apoptose blev ikke observeret mellem SOX4-knockdown (siSOX4 # 1 og siSOX4 # 2) og kontrol (scrambled-siRNA) celler. (D) lavere celleproliferation sats og nedsat antal celler bor på M-fasen i siSOX4 celler. siSOX4 og krypteret-siRNA-celler blev udpladet på dækglas og inkuberet i 48 timer. Før høst og fiksering med paraformaldehyd, blev celler inkuberet med 10 pM af BrdU i 3 timer og blev derefter underkastet anti-Ki-67 eller anti-BrdU immunfluorescensfarvning. Tyve tilfældigt udvalgte høj effekt felter (X400) blev talt til statistisk analyse (Students

t

-test). (E) Tumor xenograft af siSOX4 /PANC-1-celler vokser mindre end kontrolceller (scrambled-siRNA) i en SCID mus. Musene blev aflivet 30 dage efter subkutan inokulation af kontrolcellerne til venstre og de siSOX4 celler på højre side af flanken. (F) Mindre og lettere tumorxenoplantater af siSOX4 celler sammenlignet med de for kontrollen (n = 9, Students

t

-test). (G) repræsentant H & E, Ki-67, phh3 immunofarvningsprocedure, og TUNEL mærkning i vævssnit fra tumorxenoplantater. Scale barer = 50 um. (H, I, og J) kvantificering af proliferation (Ki-67 mærkning), apoptose (TUNEL-farve) og mitose (phh3-immunofarvningsprocedure). Atten tilfældigt udvalgte felter (x200) i hver Ki-67-farvede sektion og celler i syvogtyve tilfældigt udvalgte felter (X400) for TUNEL mærkning eller phh3 immunofarvningsprocedure blev talt i hver xenograft tumor. Den prolifererende indekset og de mitotiske tællinger af siSOX4 tumorceller er signifikant lavere end den for kontrolceller, mens procentdelen af ​​apoptotiske celler ikke varierede (Students

t

-test). n er det samlede antal celler tælles.

Brug af en

in vivo

tumorigenese assay, vi viste også, at tumorer vokser fra SOX4 undertrykt celler var meget mindre i størrelse og vægt sammenlignet med dem, der vokser fra kontrol SOX4-kompetent celler (fig. 4E og 4F). Som vist i fig.