PLoS ONE: A Novel sLRP6E1E2 Forhindrer Canonical Wnt Signaling, Epithelial-til-Mesenchymale Transition, og inducerer Mitokondrier-Dependent Apoptose i Lung Cancer

Abstrakt

Aberrant aktivering af Wnt vej bidrager til human cancer progression. Antagonister, der forstyrrer Wnt ligand /receptor-interaktioner kan være nyttige i kræftbehandling. I denne undersøgelse, vi vurderet det terapeutiske potentiale af en opløselig Wnt receptor lokkedue i cancer genterapi. Vi har designet en Wnt antagonist sLRP6E1E2, og genererede et replikation-inkompetente adenovirus (Ad), DE1-K35 /sLRP6E1E2 og en replikationskompetent onkolytisk Ad, RDB-K35 /sLRP6E1E2, begge udtrykker sLRP6E1E2. sLRP6E1E2 forhindrede Wnt-medieret stabilisering af cytoplasmatisk β-catenin, nedsat Wnt /β-catenin signalering og celleproliferation via mitogenaktiveret proteinkinase, og phosphatidylinositol 3-kinase pathways. sLRP6E1E2 induceret apoptose, cytochrom

c

frigivelse og øget kløvning af PARP og caspase-3. sLRP6E1E2 undertrykt vækst af den humane lunge tumor xenograft, og reduceret motilitet og invasion af cancerceller. Desuden sLRP6E1E2 opreguleret ekspression af epiteliale markørgener, mens sLRP6E1E2 nedreguleret mesenkymale markørgener. Tilsammen sLRP6E1E2, ved at inhibere interaktion mellem Wnt og dets receptor, undertrykt Wnt-induceret celleproliferation og epithelial-til-mesenchymal overgang

Henvisning:. Lee JS, Hur MW, Lee SK, Choi WI, Kwon YG , Yun CO (2012) A Novel sLRP6E1E2 Forhindrer Canonical Wnt Signaling, Epithelial-til-Mesenchymale Transition, og inducerer Mitokondrier-Dependent Apoptose i lungekræft. PLoS ONE 7 (5): e36520. doi: 10,1371 /journal.pone.0036520

Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Modtaget: November 6, 2011; Accepteret: April 3, 2012; Udgivet: May 14, 2012 |

Copyright: © 2012 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministeriet for videnøkonomien (10030051, Dr. CO Yun), Korea Science and Engineering Foundation (2009K001644, fra 2010 til 0.029.220, Dr. CO Yun) og Korea Food and Drug Administration (KFDA-10172- 332 til Dr. CO Yun). Jung-Sun Lee er en ph.d.-studerende sponsoreret af Brain Sydkorea 21 Projekt for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Sydkorea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er meget aggressiv og den mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. I 2009 American Cancer Society skønnede, at der var 219,440 nye tilfælde af lungekræft i USA. Standardbehandlinger såsom kirurgi og stråling er ikke effektive i mange tilfælde [1]; imidlertid har en øget forståelse af de molekylære mekanismer i lungekræft ført til udviklingen af ​​nye lovende terapier [2]. Selvom kemoterapi fremskridt har forbedret samlet overlevelse for patienter med aggressiv ikke-småcellet lungekræft, kemoresistens fortsat en væsentlig årsag til behandlingssvigt [3]. Mange aggressive lungecancere viser ændringer i forskellige cancerassocierede gener, herunder Wnt, K-ras, ekstracellulært signal-reguleret kinase (ERK), Akt, og cyclooxygenase-2, hvilket tyder på en anden molekylær pathway for carcinogenese i lunge-adenokarcinomer [4] – [6].

rolle Wnt signalering i kræft først blev foreslået for 20 år siden med opdagelsen af ​​Wnt-1 som en integration site for musebrysttumorvirus [7]. Mange undersøgelser har rapporteret, at ændret ekspression af Wnt-ligander, receptorer og ekstracellulære antagonister i forbindelse med cancer udvikling /progression og stamcelle selvfornyelse /differentiering [8]. Ekspression af Wnt-ligand, er low-density lipoprotein receptor-relateret protein 5 (LRP5), og LRP6 opreguleret i lungecancere, hvorimod Wnt antagonister der binder Wnt ligander til at blokere interaktion med receptorer (f.eks Wnt inhibitorisk faktor-1 (WIF- 1), udskilte Frizzled-relaterede proteiner (SFRP) og dickkopf proteiner (DKK) nedjusteres eller inaktiveres [9], [10]. Følgelig monoklonale antistoffer og små interfererende RNA’er mod Wnt og overekspression af Wnt antagonister undertrykke tumorvækst i forskellige

in vitro

in vivo

tumormodeller.

LRP6, et medlem af LRP superfamilien, er påkrævet for aktivering af den kanoniske Wnt signalvejen, hvilket fører til en stabilisering og nuklear translokation af β-catenin, nøglen effektormolekyle [11] LRP6 består af fire forskellige YWTD β-propeller /EGF-lignende domæne par;. den første og anden YWTD domæner (E1 og E2) er påkrævet for binding til Wnt [ ,,,0],12] – [14]. i den foreliggende undersøgelse, vi udforskede det terapeutiske potentiale af en roman opløselig Wnt receptor, sLRP6E1E2, som er sammensat af de LRP6 E1 og E2 regioner. Vi undersøgte de biologiske virkninger af sLRP6E1E2 binding til ekstracellulære Wnt ligander og blokering ligand-receptor-interaktioner. Vores resultater giver direkte bevis for, at bestemte Wnt ligand /receptor interaktioner har potentiel anvendelse som anticancer terapeutiske midler.

Materialer og metoder

Etik Statement

håndtering Animal blev gennemført i overensstemmelse med nationale og internationale retningslinjer, i et dyr facilitet akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC). Antallet af dyr, der anvendes blev minimeret, og alle nødvendige forholdsregler blev taget for at afbøde smerte eller lidelse. Protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Yonsei University sundhedssystem (2010-0160).

Materialer

Polyklonale antistoffer mod MAPK kinase (MEK1 /2), P44 /42 mitogen -aktiverede proteinkinase (MAPK; Erk1 /2), mTOR, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) og Akt, og monoklonale antistoffer mod Wnt3a, Dvl2, Axin, glycogensyntasekinase (GSK3-β), poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), og spaltes caspase-3 blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mod epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) -relaterede molekyler β-catenin, E-cadherin og vimentin blev opnået fra Cell Signaling Technology, og antistof mod N-cadherin blev købt hos eBioscience (San Diego, CA). Antistoffer mod cyclin D1 (H-295), cytochrom

c

(C-20 for Western blot-analyse), og LRP6 (C-10), og protein A /G agaroseperler blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA). Monoklonalt antistof mod caspase-3 var fra StressGen Biotechnologies (Victoria, BC). Polyklonalt antistof mod cytochrom

c

(6H2.B4 for Immunhistokemi) var fra BD Pharmingen (San Diego, CA). Alexa Fluor 488-konjugerede og Alexa Fluor 568-konjugeret anti-kanin IgG-antistoffer blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA). DAPI (1 ug /ml), Hoechst 33342, og tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC) -konjugeret phalloidin var fra Sigma (St. Louis, MO). Renset Wnt3a protein blev indkøbt fra R . D Systems (Minneapolis, MN)

cellelinier og dyrkningsbetingelser

Ikke-småcellet lungecancer cellelinier A549, H460, H358, og H596 var opretholdt i Dulbeccos modificerede høj glucose Eagles medium (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY); H322, H2009 og H1299 cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 (Life Technologies) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1% MEM ikke-essentielle aminosyrer, penicillin-streptomycin (100 IU /ml), og Hanks balancerede saltopløsning (Life Technologies). Celler blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og holdt ved 37 ° C i et fugtigt kammer ved 5% CO

2.

Generation af adenovirale vektorer, der udtrykker Opløseligt LRP6 Receptor

for at studere den biokemiske funktion af opløselig LRP6 receptor (sLRP6E1E2), genererede vi konstruktioner af E1 og E2 ekstracellulære domæner (Wnt-bindingssteder) af LRP6 [15] og FLAG-mærkede sLRP6E1E2 blev subklonet i en pCA14 shuttlevektor [ ,,,0],16]. Dette pCA14-sLRP6E1E2 vektoren blev co-transformeret med en replikationsinkompetent adenovirus 5/35 kimære vektor (DE1-K35) eller replikationskompetent kimære onkolytisk adenovirusvektor (RdB-K35) [17], genererer PDE1-K35 /sLRP6E1E2 og pRdB -k35 /sLRP6E1E2 hhv. Disse rekombinante plasmider blev transficeret ind HEK293-celler til generering DE1-K35 /sLRP6E1E2 og RDB-K35 /sLRP6E1E2. Den replikationsinkompetent DE1-K35 /LacZ og replikationskompetente onkolytiske RdB-K35 vektorer blev anvendt som negative kontroller [18] (Fig. 1A). Alle vira blev opnået som tidligere beskrevet [19].

(a) Skematisk repræsentation af den genomiske struktur af Ad-vektorer anvendes. (B) Endogen Wnt3a (venstre panel) og LRP6 (højre panel) ekspression i flere humane lunge cancercellelinier. (C) Sekretion og udtryk for sLRP6E1E2. Cellekultursupernatanter blev vurderet med FLAG specifik Ab (Overpanel). Ponceau-farvning er vist som ladningskontrol (Bundplade). (D) H322 og H460 celler blev transduceret med DE1-K35 /LacZ eller DE1-K35 /sLRP6E1E2 (50 MOI) i 48 timer. Cellelysater blev immunpræcipiteret med antisera mod Wnt3a (IP: Wnt3a) eller LRP6 (IP: LRP6). Efterfulgt af western blot-analyse med de samme antistoffer

Luciferase Reporter Assay for β-catenin Aktivitet

TOPflash og FOPflash luciferase reporter vektorerne (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) blev anvendt til at måle β-catenin /T-celle-faktor (TCF) signaleringsaktivitet. A549, H322 og H460 celler blev podet i plader med 6 brønde og transficeret med 0,3 ug TOPflash (indeholdende vildtype TCF bindingssteder) eller FOPflash (indeholdende muterede TCF-bindingssteder) negativ kontrol med DE1-K35 /LacZ eller DE1-K35 /sLRP6E1E2 (20, 50 MOI) i serum-frit medium. Efter 12 timer blev mediet erstattet med 1% DMEM med eller uden 100 ng /ml Wnt3a, og cellerne blev inkuberet i yderligere 24 timer. Cellerne blev lyseret med passiv lysepuffer, og 20 pi af celleekstrakt blev analyseret ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI). Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentaget mindst tre gange.

siRNA Transfektion

siRNA transfektion blev udført som tidligere [20] beskrevne. Kort beskrevet blev celler dyrket i seks-brønds plade til 60% konfluens og umiddelbart før transfektion vaskes med serumfrit medium, og 800 pi serum-frit medium blev tilsat hver brønd. Blanding af 0,3 ug TOPflash vektor, LRP6-specifikke eller kontrol siRNA (10 nM), og 5 pi af lipofectamin (Invitrogen) i 200 pi serumfrit medium blev derefter inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur og tilsat til hver brønd. Serum blev tilsat 8 timer senere til en endelig koncentration på 10%. Den næste dag blev celler stimuleret med eller uden rekombinant Wnt3a (100 ng /ml) i yderligere 16 timer.

celleproliferationsassay

celleproliferationsassay blev bestemt ved 3- (4 , 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) assay (Sigma). A549 og H322-celler blev podet i plader med 24 brønde (2 × 10

4 celler /brønd). Efter 24 timer blev cellerne behandlet med PBS, DE1-K35 /LacZ eller DE1-K35 /sLRP6E1E2. Den næste dag blev celler stimuleret med eller uden rekombinant Wnt3a (100 ng /ml) i yderligere 48 timer. Absorbans ved 540 nm blev aflæst på en mikropladelæser. Alle assays blev udført tre gange.

Western Blotting

Celler dyrket i DMEM med 1% føtalt bovint serum i 100-mm-plader blev transduceret med DE1-K35 /LacZ eller DE1-K35 /sLRP6E1E2 . Den næste dag blev celler behandlet med eller uden Wnt3a (100 ng /ml) i 16 timer. Immunoblotting blev udført som tidligere [17] beskrevne. Blokerede membraner blev inkuberet med antistoffer mod Wnt3a, FLAG, LRP6, Dvl2, Axin, cyclin D1, GSK3-β, MEK1 /2, p44 /42 MAPK (ERK1 /2-), Survivin, mTOR, PI3K, Akt, PARP, pro- caspase 3, spaltes-caspase 3, og cytochrom

c

natten over ved 4 ° C. Blottene blev inkuberet med de følgende sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase: gede-anti-kanin-IgG, ged anti-mus IgG eller muse-anti-gede-IgG (Cell Signaling Technology) og udviklet ved hjælp af forøget kemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige ).

Immunopræcipitering Analyse

H322 og H460 celler podet på 10 cm skåle blev inficeret med hver annonce (MOI, 50). Forty to døgn efter infektion blev cellerne høstet og lyseret i lysisbuffer (50 m

M

HEPES indeholdende 0,15

M

NaCl, 0,5% Nonidet P-40, og proteinase inhibitorer phenylmethylsulfonylfluorid, tosyl-L-lysinchlormethylketon, og

N

tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon). Den samlede cellelysat (500 ug) blev først immunpræcipiteret med Wnt3a eller LRP6 antistof og analyseret ved Western blot med anti-Wnt3a og anti-LRP6 antistof.

Immunofluorescens Assay

I immunfluorescensmikroskopi, dyrket cellerne blev vasket to gange med PBS, fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, og derefter permeabiliseret ved inkubation i 15 minutter med 0,1% Triton X-100 i PBS. Prøverne blev blokeret med 1% bovint serumalbumin efterfulgt af inkubation med E-cadherin, β-catenin, eller anti-cytochrom

c

primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Den næste dag blev cellerne vasket med PBS og inkuberet med Alexa Flour 488-konjugeret gede anti-kanin IgG sekundært antistof i 60 minutter ved stuetemperatur. Den endelige antistofbehandling indeholdt også TRITC-konjugeret actin og Hoechst 33342 eller DAPI farvning (både ved 1 ug /ml, Sigma) i nuklear farvning. Slides blev monteret med Vectashield montering medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA), og cellerne blev set under en konfokal laser-scanning mikroskop (LSM510, Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY).

mitokondrie Fraktionering og vestlige Blotting

Mitochondriale fraktioner blev fremstillet under anvendelse af Qproteome mitokondrier isolation kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Cellerne blev vasket med 0,9% natriumchloridopløsning blev suspenderet med iskold lysepuffer ved pipettering op og ned. Efter en 10-minutters inkubation, blev lysat centrifugeres ved 1000

g

i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten indeholdende cytosoliske proteiner blev forsigtigt fjernet. Pelleten indeholdende kerner, cellerester og ubrudte celler blev resuspenderet med iskold opbrydningsbuffer og centrifugeret ved 1000

g

i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten (mikrosomal fraktion) blev overført til et rent mikrorør. Den resulterende pellet indeholdende mitokondrier blev vasket med mitokondrier opbevaringsbuffer og centrifugeret ved 6000

g

i 20 minutter ved 4 ° C; et bånd mod bunden af ​​røret blev høstet som en mitochondriefraktionen. Western blotting blev udført med kanin-anti-cytochrom

c

antistof under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet ovenfor.

antitumorvirkninger i Human xenograftmodel

humane ikke-småcellet cancer (H460) xenograft blev etableret i 6- til 8 uger gamle mandlige athymiske nu /nu mus (Charles River Japan, Yokohama, Japan) ved subkutan implantation af 1 × 10

7 H460 celler i maven. Når tumorvolumener nåede ca. 80-100 mm

3 blev musene inddelt fem grupper med sammenlignelige gennemsnitlige tumorvolumener. Adenovirusvektorer blev administreret intratumoralt (2 × 10

10 viruspartikler /mus) på den første behandlingsdag (dag 1) og dag 3 og 5. Alle dyreforsøg blev udført i Yonsei University College of Medicine i henhold til institutionelle regler , i et dyr facilitet akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC). Tumor volumen (

V

) blev beregnet som

V

= 0,52 ×

en

2 ×

b Hotel (

en

, mindste overfladisk diameter

b

, største overfladisk diameter)

Tumor Histologi og Immunhistokemi

Tumor væv blev fikseret i 4% paraformaldehyd og indlejret i paraffin til histologisk. undersøgelse og immunhistokemisk farvning. Repræsentative sektioner blev farvet med hematoxylin og eosin og undersøgt ved lysmikroskopi. For at kvantificere kapillær densitet og Wnt-ekspression blev tumorsnit farvet med anti-muse CD31 IgG (BD Pharmingen), anti-kanin β-catenin IgG (Cell Signaling Technology), eller anti-muse Wnt3a IgG (Santa Cruz Biotechnology). Efter standsning endogen peroxidaseaktivitet og blokering af ikke-specifik proteinbinding med normalt gedeserum (Vector Laboratories), blev snit inkuberet med primære antistoffer ved 4 ° C natten over, og derefter med biotinyleret sekundært IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Positiv immunreaktivitet blev visualiseret med ABC-peroxidase kits (ChemMate ™ DAKO Envision ™ Detection kit, DAKO). Kontroller blev fremstillet ved at inkubere med irrelevante klasse-matchede og arter-matchede IgG. Alle objektglas blev modfarvet med Mayers hematoxylin. Ekspressionsniveauerne af Wnt3a og β-catenin blev vurderet semikvantitativt ved hjælp MetaMorph® billedanalysesoftware (Universal billede Corp., Westchester, PA). Resultater blev udtrykt som middel optisk densitet i fem forskellige digitale billeder.

Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end Labeling Assay

5-um formalinfikserede og paraffinindlejrede vævssnit blev deparaffineret og rehydreret overensstemmelse med standard protokoller [21]. Apoptose blev påvist med den terminale deoxynukleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay (deadend ™ fluorometrisk TUNEL systems Promega). Kort fortalt blev vævssnit permeabiliseret med proteinase K (20 ug /ml) i 10 minutter ved stuetemperatur. Snit blev derefter inkuberet med terminal deoxynukleotidyltransferase (TdT) og fluorescein-12-dUTP i TDT-buffer ved stuetemperatur i 60 minutter og vasket med TdT puffer. Endelig blev kerner modfarvet med DAPI. Prøverne blev analyseret ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af et standard fluorescerende filter.

Migration og Invasion Assay

In vitro Salg migration assays blev udført som tidligere beskrevet [22]. Kort fortalt, den nedre overflade af 6,5-mm polycarbonatfiltre (8 um porestørrelse; Corning Costar, Cambridge, MA) blev coatet ved nedsænkning i 0,1% gelatine. Konditionerede medier blev opnået fra A549-celler transduceret med PBS, DE1-K35 /LacZ og DE1-K35 /sLRP6E1E2 efter behandling med eller uden Wnt3a og placeret i bottom Transwell kammer. A549-celler blev derefter udpladet på det øverste kammer (7 × 10

4 celler /brønd). Kulturer blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer, fikseret og farvet med hematoxylin og eosin.

In vitro

Matrigel invasion blev udført ved hjælp af bio-coat celle migration kamre. Filtre (8-um pore) blev coatet med Matrigel basalmembranmatrix (37 mg /filter, BD Biosciences, San Jose, CA), og forsøget blev udført som beskrevet for cellemigrationsassay. Efter 24 timer blev noninvading celler fjernet, og de invaderende celler på undersiden af ​​filteret blev fikseret og farvet. Membranerne blev monteret på objektglas, og migrerede celler blev talt ved 200 ganges forstørrelse. Fem felter blev talt for hver analyse, og forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Statistical Analysis

Resultater udtrykkes som middel ± standardfejl på middelværdien (SEM). Koncernens resultat blev sammenlignet med envejs variansanalyse, efterfulgt af post hoc Students

t

-test for uparrede observationer eller Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger, når det er relevant.

P

. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Opløselig Wnt Decoy-receptoren udtrykkes i Lung Cancer cellelinjer og binder sig til Wnt3a

Endogen Wnt3a og LRP6 niveauer blev vurderet i syv ikke-småcellet lungekræft cellelinier (A549, H322, H596, H460, H358, H2009, og H1299) ved western blot analyse. Både Wnt3a og LRP6 blev stærkere udtrykt i H322, H460, og H2009 celler end i andre cellelinjer (fig 1B og figur S1.); Derfor blev H322 og H460 celler udvalgt til at vurdere evnen af ​​den opløselige Wnt-attrap-receptor (sLRP6E1E2) at inhibere Wnt signalering. Ekspression af sLRP6E1E2 fra DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede A549-celler blev bekræftet ved Western blot analyse under anvendelse af anti-FLAG-antistoffer (fig. 1C). Sekretion af sLRP6E1E2 fra DE-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler var dosisafhængig. For at sikre lige belastning, blev overført proteiner visualiseret ved farvning med Ponceau Red.

For yderligere at undersøge om sLRP6E1E2 udtrykt fra DE1-K35 /sLRP6E1E2 kan forstyrre bindingen evne endogen LRP6 til Wnt3a, cellelysater af DE1-K35 /lacZ eller dE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede H322 og H460 celler, som endogent overekspression Wnt3a blev immunfældet med Wnt3a eller LRP6 antistof og derefter endogen Wnt3a (øverst) og total LRP6 (nederst) niveauer blev detekteret med anti-Wnt3a og anti- LRP6 antistof. Vi observerede, at både Wnt3a og LRP6 proteinniveauer var lavere i celler transduceret med DE1-K35 /sLRP6E1E2 end i celler transduceret med DE1-K35 /LacZ (fig. 1D), hvilket viser, at exogent udtrykte sLRP6E1E2 kan effektivt binde til Wnt3a, hvilket fører til forebyggelse af samspillet mellem endogene LRP6 og Wnt3a.

Decoy Wnt Receptor Fald Cytosoliske β-catenin Level og TCF transkriptionsaktiviteten

vi næste hypoteser, udskilles sLRP6E1E2 protein hæmme Wnt signalering ved direkte binding til Wnt. Derfor, for at karakterisere de sLRP6E1E2 virkninger på Wnt3a /β-catenin signalering, vi fastlagt sin virkning på β-catenin ved hjælp af et luciferase reporter-system aktiveres ved p-catenin /TCF [23]. Som vist i fig. 2A, luciferaseaktivitet var lav i A549-celler transduceret med DE1-K35 /LacZ eller DE1-K35 /sLRP6E1E2 i fravær af Wnt3a, idet det endogene ekspressionsniveau af Wnt3a i A549 er meget minimal (fig. 1B). Wnt3a behandling forøget luciferaseekspression ca. 7- til 8 gange i kontrolceller, men ikke i DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler, hvilket antyder, at secernerede sLRP6E1E2 kunne blokere signalering virkning eksogent behandlet Wnt3a. I mangel af Wnt3a blev luciferaseaktivitet reduceret med DE1-K35 /sLRP6E1E2 i H460 (48%) og H322 (12%) celler sammenlignet med DE1-K35 /LacZ kontroller (Fig 2B;.

P

0,05). For at gøre dette resultat mere overbevisende, undersøgte vi virkningen af ​​LRP6-specifik siRNA (si-LRP6) på Wnt3a /β-catenin signalering. Som vist i figur S2, blev luciferaseaktivitet signifikant reduceret med behandlingen af ​​si-LRP6 i både nærvær og fravær af Wnt3a efter aftale med resultat af ovenstående (fig. 2).

(a) TCF /LEF luciferase reporter assay A549-celler. At karakterisere de sLRP6E1E2 virkninger på Wnt3a /β-catenin signalering blev celler transficeret med TOPflash (indeholdende vildtype TCF bindingssteder) eller FOPflash (indeholdende muterede TCF-bindingssteder) luciferase vektor. *

P

0,05 versus DE1-K35 /LacZ-transducerede eller PBS-behandlede celler. (B) TCF /LEF luciferase reporter assay H460 og H322 celler. *

P

0,05 versus PBS eller DE1-K35 /LacZ-transducerede celler med eller uden Wnt3a. (C) H322-celler blev transduceret med DE1-K35 /LacZ eller DE1-K35 /sLRP6E1E2 (50 MOI) med eller uden Wnt3a. Celler blev mærket med anti-β-catenin. Original forstørrelse, × 630. (D) Semi-kvantitativ analyse af panel (c) resultater ved hjælp MetaMorph® imaging analyse software. Hvert datapunkt viser middel ± SEM (hver gruppe, n = 5). **

P

0,001 versus PBS eller DE1-K35 /LacZ-transducerede celler med Wnt3a

For at vurdere effekten af ​​sLRP6E1E2 på β-catenin lokalisering, immunfluorescensfarvning var. udført i H322 celler behandlet med PBS eller transduceret med dE1-K35 /LacZ eller dE1-K35 /sLRP6E1E2. I mangel af Wnt3a blev β-catenin farvning begrænset primært kontakt celle-celle steder i alle grupper. Upon Wnt3a stimulering, kontrolceller (PBS og DE1-K35 /LacZ) viste reduceret β-catenin lokalisering på plasmamembranen, især ved celle-celle kryds og forøget β-catenin-niveauer i cytosolen og kernen. I modsætning hertil DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler viste lavere niveauer af cytosolisk β-catenin og højere niveauer af membran-associeret β-catenin (fig. 2C). Kvantificering af kernen β-catenin-ekspression viste et fald i DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler i forhold til DE1-K35 /LacZ kontrol i nærvær af Wnt3a (fig. 2D) 98,08%. Resultaterne af disse funktionelle undersøgelser viser, at interaktioner mellem sLRP6E1E2 og Wnt kan være tilstrækkelig til at blokere Wnt signalering.

Decoy Wnt Receptor sLRP6E1E2 inhiberer Lung Cancer Cell Proliferation

Wnt pathway regulerer en lang række cellulære funktioner, herunder spredning [24]. For at teste effekten af ​​sLRP6E1E2 om spredning af A549 og H322 celler

in vitro

blev celler behandlet med PBS eller transduceret med DE1-K35 /LacZ eller DE1-K35 /sLRP6E1E2. Ved 72 timer efter transduktion med DE1-K35 /sLRP6E1E2 (20 MOI), blev celleproliferation reduceret med 39% i A549-celler og 51% i H322 celler sammenlignet med DE1-K35 /LacZ-transducerede kontroller. Wnt3a stimulation øget proliferation ca. 10-20% i kontrol- celler, men havde tilsyneladende ingen effekt på DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler. Proliferation var 54% lavere i A549 celler og 61% lavere i H322 DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler end DE1-K35 /LacZ-transducerede celler (

P

0,001;. Figur 3A).

(a) A549 og H322 celler blev transduceret med dE1-K35 /LacZ eller dE1-K35 /sLRP6E1E2 (20 MOI). Den næste dag blev disse celler inkuberet med eller uden Wnt3a (100 ng /ml). Efter 3 dage blev celleproliferationen vurderet ved MTT-assayet (gennemsnit ± SEM). *

P

0,05,

#

P

0,01 versus ubehandlet kontrol for hver gruppe; **

P

0,001 versus DE1-K35 /LacZ-transducerede eller PBS-behandlede celler. N.S. = Ikke signifikant. (B) A549-celler blev behandlet som angivet ovenfor (fig. 3a). Western blot under anvendelse af antistoffer specifikke for LRP6, Dvl2, Axin, cyklin D1, eller GSK-3β. (C) A549-celler blev høstet ved 6 timer efter Wnt3a behandling. P-ERK1 /2-, Erk1 /2, p-PI3K, PI3K, blev p-Akt, og Akt proteiner detekteret ved western blot-analyse.

For at karakterisere signalveje, der er involveret i den anti-proliferative handling af sLRP6E1E2, vi undersøgte dens virkninger på kanoniske Wnt signalering. Som vist i fig. 3B, LRP6, Dvl2 og Axin protein niveauer i kontrol-celler (PBS og DE1-K35 /LacZ) blev øget med Wnt3a, men var tilsyneladende uændret ved Wnt3a i DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler. Tilsvarende blev cyklin D1 udtryk steget en smule i kontrol- celler efter Wnt3a stimulation, men faldet lidt i DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler. GSK3p niveauer også optrådte faldet lidt efter Wnt3a behandling.

Wnt spiller en fundamental rolle i spredningen ved at aktivere Erk1 /2 og PI3K-Akt veje [25]. Vi undersøgte derfor, om sLRP6E1E2 kan nedregulere disse veje. Som vist i fig. 3C, phosphorylering af ERK1 /2-, PI3K, og Akt blev opreguleret af Wnt3a behandling, men niveauerne af phorphorylation var lavere i DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler i forhold til dem i PBS-behandlede og DE1-K35 /LacZ-transducerede celler. Angivelse af mTOR, PI3K, og Akt blev ikke påvirket af Wnt3a stimulation, og var lavere i DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler end kontroller i H460-celler (Figur S3). Tilsammen disse resultater tyder på, at sLRP6E1E2 udøver antiproliferative handlinger ved at hæmme Wnt signalering via MEK-ERK og PI3K- Akt veje.

Decoy Wnt Receptor sLRP6E1E2 fremkalder apoptose

Wnt signalering kan forhindre apoptose og fremme cellulær proliferation og overlevelse [26]. For at karakterisere de molekylære mekanismer, som sLRP6E1E2 inhiberer ikke-småcellet lungekræft proliferation vurderede vi virkningerne af sLRP6E1E2 på apoptose. Ved 3 dage efter DE1-K35 /sLRP6E1E2 transduktion, observerede vi, at A549, H1299 og H358 celler gradvist løsrevet fra dyrkningsskålen og blev rundere og mindre end vedhæftede celler (fig. 4A), hvilket antyder at sLRP6E1E2 induceret apoptose. Bevis for apoptose er søgt ved at lede efter nukleare apoptotiske legemer (data ikke vist), og derefter vurderet under anvendelse af TUNEL-assayet til påvisning af internukleosomal DNA-fragmentering [27]. Som vist i fig. 4B, blev observeret flere TUNEL-positive celler blandt DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler end blandt kontrolceller i nærvær eller fravær af Wnt3a. Kvantificering af TUNEL farvning viste, at antallet af apoptose var ca. 1,9 gange højere (uden Wnt3a) og 2,8 gange højere (med Wnt3a) i DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler end i DE1-K35 /LacZ-transducerede kontroller

(P

0,001) (. figur 4C)

(a) Cellerne blev transduceret med dE1-K35 /LacZ eller dE1-K35 /sLRP6E1E2 på (20 MOI), og fotografierne blev taget. ved 72 timer senere. Original forstørrelse, × 200. (B) Påvisning af sLRP6E1E2-induceret apoptose ved TUNEL-farvning. Original forstørrelse, × 400. (C) Samlet antal TUNEL-positive celler pr felter (gennemsnit ± SEM). *

P

0,05 versus PBS eller DE1-K35 /LacZ behandlet med Wnt3a; **

P

0,001 versus PBS-behandlede eller DE1-K35 /LacZ-transducerede kontroller. N.S. = Ikke signifikant. (D) Western-analyse af sLRP6E1E2-medieret apoptose. H460-celler blev transduceret med DE1-K35 /LacZ eller DE1-K35 /sLRP6E1E2 (20 MOI). Western blot ved anvendelse af specifikke antistoffer mod uspaltet PARP, spaltet PARP, pro-caspase-3, spaltet caspase-3, og cytochrom

c

. (E) H460-celler blev behandlet som angivet ovenfor (fig. 4d). Subcellulære lokalisering af cytochrom

c

blev bestemt ved western blot analyse af cytosol og mikrosomale fraktioner.

Vi næste evaluerede regulatorer af apoptose, hvoraf caspasefamilien og cytochrom

c

er de bedst karakteriserede. I fravær og nærvær af Wnt3a blev fuld-længde 116-kDa PARP-protein reduceres, og 85-kDa spaltningsfragmenter blev forøget i DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler (Fig. 4D). Niveauer af det spaltede (aktiv) form af caspase-3 blev også markant forøget ved sLRP6E1E2. Som vist i fig. 4E, DE1-K35 /sLRP6E1E2-transducerede celler også viste øget cytosolisk cytochrom

c

og nedsat mikrosomale cytochrom

c

. Stimulering med Wnt3a produceret lignende virkninger.

Decoy Wnt Receptor sLRP6E1E2 Hæmmer Tumor xenograft Vækst

Vi næste evaluerede evne sLRP6E1E2 at hæmme tumorvækst i en mus xenograft model. Tumorer blev genereret ved subkutan injektion af H460-celler i det abdominale område hos nøgne mus. Når tumorerne nåede en middelstørrelse på 80-100 mm

3, de blev injiceret med PBS DE1-K35, RDB-K35, DE1-K35 /sLRP6E1E2 eller RDB-K35 /sLRP6E1E2 på dag 1, 3, og 5 . fig. Original forstørrelse, × 100. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig.